荧光定量PCR实验步骤
荧光定量PCR实验操作流程
荧光定量PCR实验操作流程1. 检查实验室条件在进行荧光定量PCR实验前，首先要检查实验室的环境是否适合实验。
实验室应该保持干燥、清洁和无菌。
检查PCR仪和读板器是否能正常运转，并准备所有必需的试剂和器械。
2. DNA/RNA的提取和纯化从组织和细胞中提取和纯化DNA/RNA是实验的第一步。
在提取和纯化DNA/RNA的过程中，需要保持无菌和正确的技术。
同时需要注意使用适当的缓冲液和酶切剂，以避免DNA/RNA的损伤和降解。
3. DNA/RNA质量检测检测DNA/RNA的质量和浓度，以确保实验结果的准确性。
可以使用紫外线光谱仪或其他质量检测设备。
同时，需要记录下每个样本的质量和浓度值。
4. 反转录如果需要检测RNA，需要首先进行反转录（Reverse Transcription，RT）。
反转录反应将RNA转录成相应的cDNA，可以使用逆转录酶和随机引物进行反转录反应。
5. 荧光定量PCR反应体系和引物设计荧光定量PCR反应体系包括模板DNA/RNA，荧光探针，引物和PCR反应缓冲液。
引物的设计是至关重要的，需要确保引物与目标序列的特异性和敏感性。
引物的设计可以使用NCBI或其他引物设计软件进行。
6. PCR反应设置PCR反应参数：温度梯度，反应时间和DNA量，浓度和样本装载量等。
注意反应器核心温度的控制，以确保反应的准确性和重复性。
7. 数据分析使用荧光定量PCR的结果进行数据分析。
可以使用数据分析软件，例如GenEx或其他软件。
计算出每个样本的阈值循环数（Ct值），并使用标准曲线法进行定量计算。
总之，荧光定量PCR是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学检测技术，不仅可以用于基础研究，还可以用于临床诊断和治疗监测等领域。
在实验前需要认真准备，操作流程中需要注意无菌和正确的技术，以确保实验结果的准确性。
实时荧光定量PCR详细操作步骤
实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。
所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反应
反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。
反转录反应条件如下。
37°C 15 min（反转录反应）
85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）
Real Time PCR反应
选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
全班40人，分为5组，每组做8管。
4管做BDNF，4管做18S rRNA。
4管BDNF 或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。
每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。
2）三步法PCR
首先95°C 作用3 min。
PCR进行35个循环。
步骤温度时间
变性95°C 30 秒
退火58°C 30 秒
延伸72°C 30 秒
融解曲线
温度时间变温速度
95°C 0秒20°C/秒
55°C 15秒20°C/秒
95°C 0秒0.1°C/秒。
荧光定量PCR原理及实验步骤
荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
荧光定量pcr步骤
荧光定量pcr步骤荧光定量PCR(real-timePCR)一种高通量的核酸定量分析技术，用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量。
荧光定量PCR是基于反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时PCR技术，结合这两种技术，可以非常快速地检测和定量基因表达。
本文将介绍荧光定量PCR的步骤。
第一步：样品的准备与检测1.1品的准备：首先，细菌或病毒样品根据实验要求进行灭菌或病毒灭活。
1.2测：根据需要，采用适当的抗体检测样品中是否有病毒和细菌，将病毒和细菌样品中的RNA或DNA分离出来，将分离出来的核酸用于下一步检测。
第二步：荧光定量PCR反应2.1品添加：将分离出来的核酸和所需的实验试剂（如反转录酶、DNA聚合酶、定量PCR探针、模板DNA，以及相关配套试剂）混合，反应体系得到。
2.2动PCR反应：将反应体系定温热处理，使反转录酶向模板DNA 中的特定序列引物亲和，以实现反转录。
2.3入PCR探针：将定量PCR探针加入反应液中，以实现基因表达荧光定量PCR。
2.4复PCR循环：每次循环引入一定量的反应物，以实现基因表达荧光定量PCR，并在每次循环时观察荧光信号，从而实现基因表达定量。
第三步：数据分析3.1据分析：对荧光信号数据进行定量分析，实现基因表达定量，并将结果画在实验曲线上，以观察基因表达的变化情况。
3.2验结果：在实验曲线上，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为基因表达量，可以观察实验结果，以确定基因表达量的情况。
荧光定量PCR步骤是用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量的有效技术，它包括样品的准备和检测、荧光定量PCR反应、数据分析三个步骤，可以快速准确地定量检测基因表达情况，为实验中的细菌和病毒基因分析领域提供有效的参考依据。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤引言：荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术，可用于准确、快速地定量检测DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR实验的步骤，以及注意事项和数据分析方法。
一、实验准备1. 准备所需试剂和仪器：包括PCR反应体系的各种试剂（如引物、探针、酶等）和实时荧光定量PCR仪。
2. 根据实验设计，制定合适的实验方案。
确定需要扩增的目标序列，设计引物和探针。
二、样品处理1. 提取待测样品中的DNA，确保提取得到高质量的DNA。
可以使用商业DNA提取试剂盒进行提取，按照厂家说明进行操作。
2. 测定DNA的纯度和浓度，确保测量到的DNA适用于PCR扩增反应。
使用比色法或分光光度计检测DNA的纯度和浓度。
3. 对提取得到的DNA进行稀释，以便在PCR反应中使用。
确保稀释后的DNA浓度恰当，以避免PCR反应的干扰。
三、荧光定量PCR反应体系的准备1. 根据实验设计和目标序列的长度，计算出所需的试剂和反应体系的配比。
2. 根据计算结果，将引物、探针和模板DNA按照适当的比例加入PCR反应管中。
注意保持反应管的清洁和无菌。
3. 加入合适的PCR反应缓冲液、酶和核酸酶抑制剂等试剂。
根据实验设计的需要，可以在反应体系中添加适当的试剂，如酶切酶、胶束等。
四、PCR扩增反应1. 将PCR反应管放入实时荧光定量PCR仪中，设置好PCR反应的程序和参数。
通常包括预热、变性、退火和延伸等步骤。
2. 启动PCR反应，开始扩增。
在反应过程中，实时监测PCR产物的荧光信号强度，并记录下来。
五、数据分析与结果解读1. 在实时荧光定量PCR仪中，可以实时获得PCR反应体系中荧光信号的强度和变化趋势。
根据实验设计的需要，可以选择合适的荧光信号通道进行监测。
2. 根据荧光信号和PCR反应的周期数，可以绘制荧光增幅曲线。
通过观察曲线的形态和特征，可以初步判断PCR反应的特异性和效果。
荧光定量PCR实验使用方法
第一部分一、基本步骤：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反应体系的配制；5、反应条件的设定；6、反应体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对；从/网点的genbank中下载所需要的序列。
下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。
另一种直接用DNAstar 软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后要对所有的序列进行排序。
用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。
横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定比较序列的开始与结尾。
有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。
再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。
选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。
荧光定量pcr两步法和三步法
荧光定量pcr两步法和三步法
荧光定量PCR（qPCR）是一种高效、灵敏、特异性强的PCR技术，可以用于检测和定量DNA或RNA。
在qPCR中，荧光信号与PCR 产物的数量成正比，因此可以通过荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
qPCR有两种常见的方法：两步法和三步法。
两步法是最常用的qPCR方法之一。
在两步法中，反应分为两个步骤：第一步是反转录，将RNA转录成cDNA；第二步是PCR扩增，使用荧光探针或SYBR Green等荧光染料来检测PCR产物。
两步法的优点是简单易行，适用于大多数qPCR应用。
但是，两步法需要使用反转录酶来合成cDNA，这可能会引入反转录酶的偏差和不确定性。
三步法是另一种qPCR方法，它将反应分为三个步骤：第一步是反转录，将RNA转录成cDNA；第二步是前置扩增，使用特定的引物对目标序列进行前置扩增；第三步是PCR扩增，使用荧光探针或SYBR Green等荧光染料来检测PCR产物。
三步法的优点是可以减少反转录酶的偏差和不确定性，提高PCR的特异性和灵敏度。
但是，三步法需要进行前置扩增，增加了实验的复杂性和成本。
无论是两步法还是三步法，qPCR都是一种非常有用的技术，可以用于检测和定量DNA或RNA。
qPCR在医学、生物学、环境科学等领域都有广泛的应用，例如检测病原体、基因表达分析、环境污染监测等。
随着技术的不断发展，qPCR将会在更多的领域得到应用，
并为科学研究和临床诊断提供更加精确和可靠的数据。
荧光定量pcr三步法程序
荧光定量PCR三步法, 实现高效、准确检测！荧光定量PCR是一种常见并且有效的分子生物学技术，用于定量检测DNA的存在量。
荧光定量PCR三步法是一种可靠的PCR技术，可用于快速检测样品中特定目标序列的存在量，并实现精确计量。
以下是荧光定量PCR三步法的具体步骤：第一步：预处理样品在进行荧光定量PCR之前，需要先对样本进行预处理。
这通常包括提取和纯化DNA，并确定其浓度和质量。
确保样品处理后的DNA为适合荧光定量PCR的高质量DNA，防止因样品处理不当而导致PCR 偏差和假阳性或假阴性结果。
第二步：进行荧光定量PCR反应荧光定量PCR反应为三步法。
第一步，反应混合物中需包含模板DNA、两个引物和荧光探针等成分。
第二步，放入PCR扩增仪设定反应条件，启动PCR反应。
反应过程中，荧光探针随着PCR基因扩增而被切割释放，释放出的荧光信号与扩增的目标DNA数量成正比。
第三步，利用PCR荧光测量设备检测扩增产品，并测量PCR信号增加的曲线。
第三步：数据分析荧光定量PCR数据分析是一项重要的步骤，它可以确定扩增的DNA目标的数量和浓度。
根据荧光信号和PCR产物在阈值周期内的翻倍次数来确定PCR 细胞内目标DNA的存在量。
这门技术可以提供准确、灵敏和可重复的结果，可应用于各种场景，如基因检测、体外诊断、食品安全检测等等。
综上所述，荧光定量PCR三步法是一种高效且可靠的PCR技术，可用于快速检测样品中特定目标序列的存在量，并实现精确计量。
它是分子生物学研究和诊断等领域不可缺少的重要技术手段。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
pcr定量实验方案
PCR定量实验方案实验目的本实验旨在通过聚合酶链式反应（PCR）定量检测目标DNA的数量。
通过PCR 定量实验，可以快速、准确地确定目标DNA的含量，为后续实验提供数据支持。
实验原理PCR定量实验基于聚合酶链式反应的基本原理，通过反复复制目标DNA序列，使其数量呈指数增加，并通过荧光信号在PCR循环的各个阶段实时监测目标DNA的增长情况。
荧光信号的强度与目标DNA的初始量成正比，从而可以定量测量目标DNA的数量。
实验步骤1.样本处理：–收集待检测样本，并提取目标DNA。
–使用核酸定量仪检测目标DNA的浓度，并计算出适当的稀释倍数。
–将目标DNA按照所需的浓度稀释，并制备出一系列不同浓度的DNA标准曲线样品。
2.PCR反应体系准备：–准备PCR反应混合液，包括模板DNA、引物、荧光探针、酶和缓冲液等。
–按照所需的PCR反应体系，按比例向反应管中加入相应的试剂，确保反应混合液的配制准确。
3.反应条件设置：–设置PCR反应的温度和时间参数，包括初始变性、循环变性、退火和延伸等步骤。
–根据目标序列的特性和引物设计，调整PCR反应的温度梯度、循环次数等参数，以实现最佳放大效果。
4.PCR反应实施：–将PCR反应混合液分装到反应管中，注意避免产生交叉污染。
–将反应管放入PCR仪中，按照设定的温度和时间参数运行PCR反应。
–实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化，记录关键点的荧光信号值。
5.数据分析：–将PCR反应过程中记录的荧光信号值绘制成实时荧光曲线图。
–根据所制备的DNA标准曲线样品，通过荧光信号值反推目标DNA的初始量。
–根据目标DNA的初始量和稀释倍数，计算样本中目标DNA 的浓度。
实验注意事项1.实验操作前，准备好PCR反应所需的所有试剂和设备，并保持反应管和工作台的清洁。
2.操作过程中，注意避免产生交叉污染，尤其是在样本处理和PCR反应准备阶段。
3.严格按照PCR反应体系准备说明书中的比例和操作要求进行试剂的配制和混合。
荧光定量PCR实验流程图
6
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5 实验分析： 实验分析：
结果有效性： 有效 无效 （依据 SOP- 中的实验结果有效性判断标准）
见附表（原始结果打印）
6
实验后： 实验后： 填写记录； 打开紫外灯消毒 30′； 70%乙醇消毒实验台面和器具； 按 SOP 文件处理废弃物。
操作者： ______________审核者： 审核者： 操作者： 审核者 ________________
阳性： r 值：是 CT 值：否 失控标准曲线
斜率：
截距：
失控原因及处理： 失控原因及处理： 3 扩增仪：
开机后自检； 按 基 因 扩 增 实 验 室 SOP操作及设定扩增参数；
将样本标识填写于扩增仪相应位置；
仪器状态正常。
4
样本唯一标识和扩增位置：
1 A B C D E F G H
备注：
2
3
4
5
离心是否正常；异常情况及处理 75% 乙 醇 消 毒 实 验 台 面 和 器 具 ； 操作过程是否正常： 打 开 紫 外 灯 消 毒 30 ′ ；
按 SOP 文件处理废弃物；
核酸扩增及产物分析区 三区） 核酸扩增及产物分析区（三区）
1 实验前： 2 室内质控 结 果
打开紫外灯消毒 30′； 质控品结果 阴性： 75%乙醇清洁实验台面; 是 否 失控 记录室内温湿度:
试剂准备区（一区） 试剂准备区（一区）
1 实验前：
打开紫外灯消毒 30′ ； 75%乙醇清洁实验台面; 批号: 数量 配制 70%乙醇 配制 0.1%DEPC 人份 记录室内温、湿度: 有效期限: 清点试剂存量: ml； ml； 打开紫外灯消毒 30′； 人份 _
荧光定量pcr探针法
荧光定量pcr探针法荧光定量PCR探针法引言：荧光定量PCR探针法（Fluorescent Quantitative PCR Probe Method）是一种基于荧光探针的PCR技术，通过特异性探针与目标DNA序列的结合，利用荧光信号的强度来定量分析PCR产物。
该方法在生物医学领域广泛应用，能够高效、准确地检测和定量目标基因的表达水平。
本文将详细介绍荧光定量PCR探针法的原理、步骤、优势和应用。
一、原理：荧光定量PCR探针法是在常规PCR反应的基础上引入荧光探针，通过监测荧光信号的变化来定量PCR产物。
探针通常由两部分组成：荧光染料和一个与目标DNA序列特异性结合的DNA探针。
在PCR反应过程中，探针与目标DNA序列结合后，荧光信号强度增加，而在无目标序列或非特异性结合的情况下，荧光信号强度较低。
通过测量荧光信号强度的变化，可以推断目标基因的表达水平。
二、步骤：1. 样本准备：提取目标DNA样本并进行纯化处理，确保样本的质量和纯度。
2. 引物设计：根据目标基因序列设计引物和荧光探针，确保其特异性和高度敏感性。
3. PCR反应：将目标DNA样本与引物和荧光探针加入PCR反应管中，进行PCR扩增。
4. 荧光信号检测：在PCR反应过程中，使用荧光实时检测仪器实时监测荧光信号强度的变化。
5. 数据分析：根据荧光信号强度的变化，计算目标基因的表达量，并进行数据统计和分析。
三、优势：1. 高灵敏度：荧光定量PCR探针法具有高度敏感性，可以检测到低浓度的目标DNA序列，适用于分析稀有基因或低表达基因。
2. 高特异性：通过引物和荧光探针的设计，荧光定量PCR探针法能够准确识别和定量目标DNA序列，避免了假阳性结果的发生。
3. 高精确度：荧光定量PCR探针法可以实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，提供准确的定量结果，避免了传统PCR方法中终点检测的不确定性。
4. 高通量：荧光定量PCR探针法可以在同一反应体系中同时检测多个基因或多个样本，提高了实验效率和数据可靠性。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
荧光定量pcr实验步骤
荧光定量pcr实验步骤荧光定量PCR实验步骤荧光定量PCR（Quantitative PCR，qPCR）是一种用于测量特定DNA序列数量的技术。
它可以快速、准确地定量检测目标DNA的含量，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传变异分析等领域。
下面将介绍荧光定量PCR实验的步骤。
一、实验前准备在进行荧光定量PCR实验之前，需要做好实验前的准备工作。
1. 设计引物和探针：根据目标DNA序列设计引物和探针，确保其特异性和互补性。
2. 准备模板DNA：从样品中提取目标DNA，并进行纯化和定量。
3. 制备PCR反应体系：根据PCR反应的需要，准备好PCR反应体系，包括引物、探针、模板DNA、Taq DNA聚合酶、缓冲液和dNTP等。
4. 验证引物和探针的特异性：使用目标DNA和非目标DNA进行聚合酶链式反应，通过凝胶电泳验证引物和探针的特异性。
二、荧光定量PCR实验步骤1. 反应体系配置：按照实验设计，配置好PCR反应体系。
将引物、探针、模板DNA、Taq DNA聚合酶、缓冲液、dNTP等加入反应管中，然后加入适量的去离子水。
2. PCR反应条件设定：根据引物和探针的特性，设定PCR反应的温度和时间参数。
一般来说，PCR反应包括预变性、变性、退火和延伸四个阶段，其中变性温度为95℃，变性时间为30秒，退火温度为60℃，退火时间为30秒，延伸温度为72℃，延伸时间根据目标片段的长度而定。
3. PCR反应体系装入仪器：将装有PCR反应体系的反应管放入荧光定量PCR仪器中。
4. 荧光定量PCR实验运行：启动荧光定量PCR仪器，按照预设的PCR反应条件进行PCR反应。
仪器会根据设定的温度和时间参数进行PCR反应，并实时检测荧光信号。
5. 数据分析与结果解读：荧光定量PCR仪器会自动记录PCR反应过程中的荧光信号，根据荧光信号的变化可以计算出目标DNA的数量。
通过对比不同样品的荧光信号差异，可以定量分析目标DNA 的含量。
实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA 的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。
二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA用DNase I 消化DNA组份加量模板(RNA) 10ugRNase Inhibitor 4ulDNase I buffer 10ulDNase I 10ulDEPC处理H2O 至100ul混匀，37℃90min三、RNA琼脂糖凝胶电泳1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。
2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。
倒入凝胶板上凝固30min。
2．取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。
3．120V电压下电泳25min。
用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4．RNA电泳结果如下图所示。
可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。
四．RNA反转录为cDNA反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul 体系)模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整)引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ulDEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul混匀，70℃5min，立即冰浴5*buffer 4.0ul 8.0uldNTP(10mM) 2.0ul 4.0ulRNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul混匀，37℃5minM-MLV 1.0ul 2.0ul42℃60min ，70℃10min反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
荧光定量pcr两步法和三步法
荧光定量pcr两步法和三步法1 荧光定量PCR简介荧光定量PCR是一种检测DNA样本中特定目标序列数量的方法，它结合了聚合酶链式反应（PCR）技术和荧光探针的使用。
相对于传统PCR技术，荧光定量PCR能够给出更加准确的目标序列数量结果，并且可以在一个反应管中同时检测多个目标序列。
荧光定量PCR分为两步法（Two-Step qPCR）和三步法（Three-Step qPCR），它们的反应机理有所区别，适用于不同的实验需求。
2 两步法2.1 反应机理两步法荧光定量PCR，又称为逆转录荧光定量PCR（RT-qPCR），是通过逆转录将RNA转化为cDNA，再将cDNA参与PCR反应，并通过荧光探针实时监测反应过程中目标序列数量变化的方法来定量RNA的表达水平。
具体过程：先用一个专门的逆转录酶II将RNA转化为cDNA，然后将cDNA加入到PCR反应中，PCR反应过程中，荧光探针会与目标序列结合并荧光发射，PCR反应的进程中，荧光探针完全分解之前，荧光信号增强，通过分子探测器检测荧光信号的数量，即可以得到目标序列的数量。
2.2 应用场景两步法荧光定量PCR通常被用于研究转录调控、RNA可变剪接的研究，以及疾病诊断中的病原体检测，包括HIV、乙肝病毒、H1N1流感病毒等等。
3 三步法3.1 反应机理三步法荧光定量PCR，又称为普通荧光定量PCR或SYBR-green染料荧光定量PCR，是利用SYBR-green染料的荧光信号实时监测PCR反应过程中DNA目标序列数量变化的方法来定量DNA的含量。
具体过程：PCR反应体系中加入SYBR-green染料，在PCR反应过程中，荧光信号随着PCR扩增产物的增加而增大，通过检测荧光强度的变化，可以计算出PCR扩增产物的数量。
3.2 应用场景三步法荧光定量PCR通常被用于基因表达、基因定量、基因型鉴定以及SNP分析等实验中。
4 两步法和三步法的区别两步法和三步法的主要区别在于荧光信号的来源不同。
荧光定量pcr熔解曲线
荧光定量pcr熔解曲线
荧光定量PCR熔解曲线是一种常用的实验技术，用于检测PCR产物的放大效果和特定基因的表达情况。
下面，我们就来深入了解一下荧光定量PCR熔解曲线的相关知识。
一、PCR概述
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是一种通过体外反应扩增DNA分子的技术。
通俗点说，就是通过PCR放大DNA分子的数量，使其在实验中更易被观测。
二、荧光定量PCR熔解曲线的实验步骤
1. 准备PCR反应体系。
2. 加入反应物质。
3. 设置PCR参数，如反应温度、时间等。
4. 进行PCR放大反应。
5. 对PCR产物进行Tm（熔解温度）分析，并制作熔解曲线。
三、熔解曲线的基本原理
PCR熔解曲线是一种通过热力学原理，根据温度升高和DNA链的解离程度来推算DNA的数量的实验方法。
当PCR产物被加热到超过其熔解温度时，其DNA链将解离，原先一个双链变成了两个单链，这时用荧光染料检测放大的DNA产物，荧光的强弱将随DNA数量的增加。
四、应用范围
荧光定量PCR熔解曲线被广泛应用于医学、生物学、农业等领域。
例如，用于检测特定基因在不同组织、不同阶段、不同环境下的表达情况；分析两个样品中特定基因的差异表达等。
五、总结
荧光定量PCR熔解曲线是一种常用的实验技术，能为我们提供准确可靠的实验数据，帮助我们更好的了解基因的表达情况及其变化规律。
需要注意的是，实验前需要准备充分、重视细节，以确保实验的准确性和可靠性。
荧光定量PCR
荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。
其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。
荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。
2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。
因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。
TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。
在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。
只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。
荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。
cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。
2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。
3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。
4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。
荧光定量PCR标准操作程序
荧光定量PCR标准操作程序ABI 7500荧光定量PCR仪标准操作程序1.打开UPS电源。
2.UPS电源稳定后，依次打开电脑和PCR仪，PCR仪开机时绿、黄、红3个灯全亮，最终绿灯常亮（如果是红灯常亮，则仪器运行不正常需联系仪器维护工程师排除仪器故障）。
3.双击桌面7500Sofeware V2.0.4图标，弹出Login界面，输入用户名，单击OK，进入实验设计主界面。
4.依次Set up→Advanced Setup→Experiment Menu，进入实验手动设计界面。
5.Setup→Experiment Properties→Experiment Name输入实验名称，选择染料类型，（如需选择SYBR Green Reagents，则必须选上溶解曲线选项）。
6.Setup→Plate Setup→Define Targets and samples设定染料探针名称、添加或删除探针和选择染料探针的报告基团和猝灭基团。
→Define s amples选择添加或删除样品。
→Assign Targets and samples 图标，可设定样品（S）、阴性对照（N）和标准品（S），并在右侧的96孔显示界面中设置每管的具体位置，尽量将样品管集中于96孔界面的中央位置。
注意：每管中都需选择加入染料探针。
7.Setup→Run Method→Graphical view设定PCR反应体系总体积、循环次数、添加或删除反应的阶段和步骤，以及反应的各个阶段和步骤的时间和温度。
（注意：由于数据的采集是在实验的延伸阶段，因此延伸阶段一定要选上数据采集图标，并且延伸时间不能少于35s。
）8.设置完毕后，向样品板中加入样品，单个样品管8连管需用专用平盖封好，96孔管用专用封膜封好，轻按样品槽右侧按钮，弹出样品槽，放入样品板，使A1朝向左上角，单手按住样品槽右侧按钮，将样品槽轻轻送进机体即可。
9.单击右上角绿色START RUN图标，开始实验。
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2016.4.27
实时荧光定量PCR：
利用荧光信号的变化实时检测PCR反应中每一个循环扩增产 物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分 析。
Ct值：PCR扩增反应中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值
时所经过的扩增循环次数。模板DNA量越多，荧光达到阈值的循 环数越少，则Ct值越小。
琼脂糖凝胶电泳：
2.实验步骤：
2.1 安装电泳槽 2.2 制备琼脂糖凝胶，称取2g琼脂糖，溶于100mL 1×TAE中，微波加热至完 全溶解。
2.3 灌胶：将的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
2.4 待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 2.5 加样。 2.6 120V稳压约20min. 2.7 观察。
常用荧光标记方法：
2. Taqman 探针法 探针两端分别标记一个报告荧光基团(R)和一个淬灭荧光基团(Q)。 PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧 光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号 ，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信 号的累积与PCR产物形成完全同步。
序号
1 2
试剂名称
乙型肝炎病毒-核酸释放剂 乙型肝炎病毒-PCR反应液
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
主要成分及作用
释放样本中的核酸 引物、探针、dNTPs、Mg2+、PCR buffer
3
4 5 6
乙型肝炎病毒-酶混合液
乙型肝炎病毒-内标 乙型肝炎病毒-定量参考品A 乙型肝炎病毒-定量参考品B
Taq酶、UNG酶
阳性内对照，避免PCR假阳性 定值的阳性样本，浓度：4×107IU/mL 定值的阳性样本，浓度：4×106IU/mL
2.样品处理：
2.1 每组取3个定量PCR管，每个PCR反应管中加入HBV-核酸释放剂5ul， 然后加入待测样品15ul ，阴性对照、阳性对照以及定量参考品A,B,C,D 各15ul，吸打3-5次混匀（轻轻吸打，避免出现气泡）； 2.2 间隔10分钟以上，每管加入PCR混合液40ul，2000rpm离心30秒。
7
8 9 10
乙型肝炎病毒-定量参考品C
乙型肝炎病毒-定量参考品D 乙型肝炎病毒-阴性对照 乙型肝炎病毒-阳性对照
定值的阳性样本，浓度：4×105IU/mL
定值的阳性样本，浓度：4×104IU/mL 阴性样本（已灭活） 定值的阳性样本（已灭活）
操作步骤：
1.试剂准备： 1.1 待测样品：取一个1.5mL的EP管，一个PCR管里需要的量：反应液 38ul+酶混合液2ul+内标0.2ul，每个样本需要做3个重复，所以吸取反应 液114ul+酶混合液6ul+内标0.6ul ，在EP管中充分混匀，即为PCR混合液 ，瞬时离心后备用。 1.2 阳性对照、阴性对照、定量参考品A,B,C,D：吸取反应液684ul+酶混 合液36ul+内标3.6ul ，在EP管中充分混匀，即为PCR混合液，瞬时离心 后备用。
琼脂糖凝胶电泳：
1.实验原理：
琼脂糖是一种固相电泳支持物，DNA在碱性条件下带负电荷，在电场中通过凝胶介 质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同 ，因此可以分离鉴定和提纯DNA片段。
胶浓度与DNA片段大小的关系：
凝胶浓度（%） 线性DNA长度（bp） 0.5 0.7 1.0 1.2 1.5 2.0 1000-30000 800-12000 500-10000 400-7000 200-3000 50-2000
3. PCR扩增 4. 琼脂糖凝胶电泳检测
5. 结果分析
6. 质量监控 5.1 HBV阴性对照：无Ct值显示；但HBV-内标检测为阳性（Ct值≤40）。 5.1 HBV阳性对照：检测浓度值介于1.26×105-1.26×106IU/mL. 5.4 四个定量参考品（A,B,C,D）：均检测为阳性，且标准曲线相关系数 r≥0.98.
标准曲线：利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，横坐
标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值，因此只要知道未知样 品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
常用荧光标记方法：
1. SYBR Green Ⅰ SYBR Green Ⅰ是一种结合于所有双链DNA螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。