实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程
实时荧光定量PCR详细操作步骤
实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。
所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反应
反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。
反转录反应条件如下。
37°C 15 min（反转录反应）
85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）
Real Time PCR反应
选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
全班40人，分为5组，每组做8管。
4管做BDNF，4管做18S rRNA。
4管BDNF 或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。
每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。
2）三步法PCR
首先95°C 作用3 min。
PCR进行35个循环。
步骤温度时间
变性95°C 30 秒
退火58°C 30 秒
延伸72°C 30 秒
融解曲线
温度时间变温速度
95°C 0秒20°C/秒
55°C 15秒20°C/秒
95°C 0秒0.1°C/秒。
荧光定量pcr步骤
荧光定量pcr步骤荧光定量PCR(real-timePCR)一种高通量的核酸定量分析技术，用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量。
荧光定量PCR是基于反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时PCR技术，结合这两种技术，可以非常快速地检测和定量基因表达。
本文将介绍荧光定量PCR的步骤。
第一步：样品的准备与检测1.1品的准备：首先，细菌或病毒样品根据实验要求进行灭菌或病毒灭活。
1.2测：根据需要，采用适当的抗体检测样品中是否有病毒和细菌，将病毒和细菌样品中的RNA或DNA分离出来，将分离出来的核酸用于下一步检测。
第二步：荧光定量PCR反应2.1品添加：将分离出来的核酸和所需的实验试剂（如反转录酶、DNA聚合酶、定量PCR探针、模板DNA，以及相关配套试剂）混合，反应体系得到。
2.2动PCR反应：将反应体系定温热处理，使反转录酶向模板DNA 中的特定序列引物亲和，以实现反转录。
2.3入PCR探针：将定量PCR探针加入反应液中，以实现基因表达荧光定量PCR。
2.4复PCR循环：每次循环引入一定量的反应物，以实现基因表达荧光定量PCR，并在每次循环时观察荧光信号，从而实现基因表达定量。
第三步：数据分析3.1据分析：对荧光信号数据进行定量分析，实现基因表达定量，并将结果画在实验曲线上，以观察基因表达的变化情况。
3.2验结果：在实验曲线上，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为基因表达量，可以观察实验结果，以确定基因表达量的情况。
荧光定量PCR步骤是用于检测和定量检测基因表达以及实验条件下的细菌基因或病毒基因含量的有效技术，它包括样品的准备和检测、荧光定量PCR反应、数据分析三个步骤，可以快速准确地定量检测基因表达情况，为实验中的细菌和病毒基因分析领域提供有效的参考依据。
Agilent Real-time qPCR 检测 操作手册说明书
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。
细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
qPCR操作步骤
QPCR（Real-time Quantitative PCR Detecting System）即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。
标准的两步法：RNA提取→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-time PCR.注意：1 高质量的RNA获取，这里的高质量不是强调RNA降解，而是强调RNA 的纯度，不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。
基因组DNA的存在会导致定量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理，消除DNA污染。
而RNA中的杂质的污染会限制real-time PCR的反应，导致扩增失败，给你假阴性的结果。
RNA的降解不是关键，一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短，150-250个bp，并不用于扩增目标基因的全长。
此外是因为存在内参基因，所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。
毕竟一旦发生降解，所有的RNA以同样的速度降解，而相对比率不会改变。
2 减少加样误差，在使用SYBR Green MIX的时候，一定要先按照反应的量（比如8个孔）把所有的试剂一次性配成MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模板，使用5微升是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你的定量精确度。
3 选择合适的内参基因，一般用于定量PCR的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。
具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因，找到变化最小，最稳定的一个。
4 合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等。
Q-PCR实验流程：一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。
在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA数量。
一、实验前准备：实验试剂及耗材：试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA试剂盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master1号管包含：热启动Taq DNA Polymerase、反应缓冲液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2仪器及耗材：罗氏LightCycler 480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR仪、F1单道移液器、冰盒、QSP盒装吸头等正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】二、反转录实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。
严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。
本实验是联合使用anchored oligo dT引物和随机六聚体引物进行的反转录。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40μgRNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE 中，测得A260=0.21RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：35μl×0.84μg/μl=29.4μg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤1.提取样本RNA/DNA：首先，从研究对象中提取出所需的RNA或DNA样本。
可以使用商业化的提取试剂盒来完成这一步骤。
2. 反转录酶链反应（RT）：如果提取的样本为RNA，则需要先进行反转录酶链反应，将RNA转录成cDNA（即DNA拷贝），反转录酶具有多样性（M-MLV逆转录酶）和过程性（RTase）。
3.准备PCR反应体系：根据实验所需的扩增模板和引物，将PCR反应体系按照厂家提供的信息制备，通常需要包括PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、酶、模板DNA/cDNA和稀释水。
4. 调整荧光探针的浓度：如果实验中使用到了荧光探针（如TaqMan探针、MGB探针等），需要根据实验要求对荧光探针的浓度进行调整。
5.放置PCR板：将所需的PCR试管或板放置在适当的位置，以便加载反应体系。
6.反应体系加载：按照实验所需的样品数量和模板浓度，依次向PCR反应管或板中加入反应体系。
注意，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。
7.封闭PCR反应管/板：闭合PCR反应管或板，以防止反应体系的挥发和样品的交叉污染。
8.准备PCR仪：根据PCR仪的要求，调整PCR仪的温度和时间参数。
9.PCR扩增：将已封闭的PCR反应管或板放置在预热的PCR仪中，开始PCR扩增。
根据实验需要，设置不同的PCR程序（如热启动PCR、两步PCR和三步PCR等）。
10. 实时监测PCR过程：在PCR反应过程中，实时监测PCR反应管或板中产生的荧光信号，并记录下每个周期（cycle）的荧光值。
11. 数据分析：根据荧光信号的变化，结合标准曲线法或相对表达量法，对PCR反应中目标序列的数量进行定量分析。
常见的分析软件包括Stratagene MxPro QPCR软件和Applied Biosystems SDS软件等。
12.结果分析和解释：根据数据分析的结果，对实验结果进行解释和讨论，并在图表中呈现。
13. 结果验证：可以使用其他方法验证RT-qPCR的结果，如Western blotting、细胞免疫化学分析等。
实时荧光定量PCR仪操作流程
实时荧光定量PCR仪操作流程实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）仪是一种常用的分子生物学实验仪器，用于定量检测DNA或RNA样本中的特定序列。
通过对PCR反应进行荧光检测，可以实时监测目标序列的扩增过程，并且具有高灵敏度和高特异性的优势。
下面将介绍实时荧光定量PCR 仪的操作流程，以帮助您正确进行实验。
1. 准备工作在开始实时荧光定量PCR实验之前，需要准备以下实验器材和试剂：（1）实时荧光定量PCR仪：确保仪器已预热至适当的温度；（2）PCR反应管或板：根据实验需要选择适当的规格；（3）PCR试剂盒：包括DNA模板、引物、探针、酶等；（4）DNA/RNA样本：按照实验设计合理稀释或提取，确保样本质量良好；（5）聚合酶链式反应混合液（PCR Mix）：根据试剂盒说明配置混合液。
2. 操作步骤（1）设置PCR仪参数：将需要的实验参数输入PCR仪中，包括扩增阶段的温度、时间和循环次数等。
（2）制备PCR反应体系：按照试剂盒说明书中的配方将PCR Mix、DNA模板、引物和探针等加入PCR反应管或板中。
（3）密封反应管或板：确保反应管或板密封良好，避免样品蒸发或污染。
（4）放入PCR仪：将密封好的PCR反应管或板放入PCR仪中，确保仪器已预热至适当的温度。
（5）运行实验：启动PCR仪，开始实时荧光定量PCR反应。
仪器会根据设置的参数自动进行温度循环和荧光信号监测。
（6）数据分析：实验进行过程中，可以通过PCR仪的软件实时监测扩增曲线和荧光信号，获得相关的实验数据。
（7）结果解读：根据实验目的和结果，对荧光信号和扩增曲线进行分析和解读，获得所需的定量PCR结果。
3. 注意事项（1）实验操作应按照严格的无菌操作要求进行，避免PCR反应受到外部污染。
（2）实时荧光定量PCR仪涉及的试剂和标本具有一定的生物安全风险，应按照相关安全规范进行操作和处理。
（3）准确的数据记录和标注是保证实验结果可靠性的重要环节，务必在实验过程中进行详细记录。
实时荧光定量步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤关键词：实时荧光PCR2012-03-09 16:43来源：互联网点击次数：467381 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。
样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495?l的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ?l，剩余RNA总量为：35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
实时荧光定量pcr的技术原理
实时荧光定量pcr的技术原理
实时荧光定量PCR（Real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种可以在PCR反应过程中实时监测DNA扩增的方法。
其技术原理基于PCR反应中的DNA扩增和荧光探针的结合。
实时荧光定量PCR主要包括以下步骤：
首先，将待扩增的DNA模板，引物和荧光探针混合在一起。
荧光探针由一个与待扩增的DNA序列相互补的引物和一个带有荧光染料和一个抑制退火的小分子的探针组成。
接着，将混合物加入到特定设计的PCR反应体系中，其中包括缓冲液、DNA聚合酶以及其他所需的试剂。
PCR反应开始后，通过热循环过程，将DNA模板的两条链分离，并进行DNA扩增。
在PCR反应过程中，荧光探针与DNA扩增产物结合，当探针结合到合适的位置上时，荧光探针的荧光染料会释放出荧光信号。
PCR反应体系中含有一个光学系统，可以实时监测PCR反应进行过程中的荧光强度变化。
光学系统通常由一个光源、一个荧光探测器和一个数据处理单元组成。
实时荧光定量PCR中的数据处理单元会收集、分析和解释荧光强度变化的数据，根据扩增产物的荧光信号强度，可以推断
出反应体系中的扩增产物的绝对或相对数量。
通过定量PCR技术，可以对DNA进行定量分析，确定起始模板的数量。
实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、拷贝数变异检测等领域得到广泛应用。
real time quantative PCR(RT-PCR,qPCR)实时定量PCR详细操作流程
1.SYBR Green使用浓度：太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱。
2.引物特异性高，否则扩增有杂带。
3.反应温度和时间，根据酶和引物决定。
4.其他与常规PCR相同。
noise band建议刚好越过实验中设置的阴性孔。
不同的基因不需要相同的阈值，但是每块板上同一对引物扩增的基因使用相同的阈值。
横坐标：扩增循环数纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号收集荧光信号阈值：前15个循环信号作为荧光本地信号baseline，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。
荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
Ct:PCR扩增过程中，扩增产物的荧光值达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
Ct值极具重现性。
定量时多取15-35较好。
1.dye kit：roche lightcycle 480 sybr green 1 masterKit中小瓶：Master 2x, 储存于-20℃，避光，避免反复冻融，使用前上下颠倒混匀，避免气泡，不能震荡Water，PCR grade储存于-20℃配制好的PCR反应液，可于室温稳定保持24h，需避光。
2.template：在20μl体系中，说明书中推荐20ng纯化的cDNA，50-100ng genomic DNA，108拷贝plasmid DNA。
根据以往经验，150-200ng cDNA（也许未纯化）为佳。
模板太多，会影响荧光发光。
如果模板不纯，则模板量不能超过2μl，预变性时间改为10min，可降低模板中杂质的影响。
3.primer：最终工作浓度为0.2-1μM, 推荐0.5μM。
引物浓度的原则是，达到目标荧光浓度时，最低引物浓度，导致最低crossing points，Cp值。
4.products: 产物长度最好不超过500bp5. system✧配制体系时，不能触摸PCR板的上表面以及封口膜，戴手套✧Master mix避光✧冰上加样✧准备好混合样品后，吹打混匀，不能震荡20μlMaster mix 10F（10μM）1（0.5μM）R（10μM）1（0.5μM）Template 1（150ng）DDW PCR grade 76.program：Incubation 95℃ 5min or 10min Amplification 95℃ 10s55-60℃（选58℃），5-20s（选20s）72℃5-30s（选30s）40 or 45 cyclesMelting Curve 95℃ 5s，65℃1min，97℃Cooling 40℃ 10s。
qpcr实验步骤详细
qpcr实验步骤详细引言real-time定量聚合酶链反应（qPCR）是一种快速、敏感并具有高度准确性的分子生物学技术，广泛应用于基因表达、DNA定量和病原体检测等领域。
本文将详细介绍qPCR的实验步骤。
材料和试剂•qPCR仪器设备•PCR反应管•DNA模板•引物•DNA聚合酶•dNTP混合液•磷酸盐缓冲液•MgCl2•荧光探针•模板DNA稀释液实验步骤步骤1：实验室准备准备实验室工作台，并清洁工作台表面以消除任何潜在的污染源。
确保所有实验器材和试剂处于合适的工作温度。
步骤2：qPCR反应物的制备1.在干燥的PCR反应管中，向每个样品管中加入以下组分：•磷酸盐缓冲液：根据试剂盒说明书加入适量的磷酸盐缓冲液。
•dNTP混合液：加入适量的dNTP混合液。
•MgCl2：根据试剂盒说明书加入适量的MgCl2。
•引物：根据实验需要加入适量的引物。
•DNA聚合酶：根据试剂盒说明书加入适量的DNA聚合酶。
2.轻轻混合反应管，以确保所有反应物均匀混合。
步骤3：样品处理1.准备待测样品DNA。
可以通过提取DNA、RNA逆转录制备cDNA等方法获取。
2.将待测样品DNA加入PCR反应管中。
步骤4：qPCR条件设置1.预热qPCR仪器到适当的温度。
2.设置qPCR仪器的程序：•95°C：预热反应管，持续2-5分钟。
•95°C：变性步骤，持续15-30秒。
•Tm温度（引物特异性）：退火步骤，持续30秒-1分钟。
•72°C：延伸步骤，持续30秒-1分钟。
•重复步骤2-4，通常为25-40个循环。
步骤5：数据收集和分析1.使用qPCR仪器实时收集PCR数据。
2.通过仪器软件对数据进行分析。
结论经过上述步骤，我们可以成功进行qPCR实验。
这项技术可用于快速、准确地定量检测和分析DNA样品，对于研究基因表达调控、疾病诊断和药物研发等领域具有重要意义。
请注意，本篇文章是一种原创性的解释文章，旨在介绍qPCR实验步骤。
实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA 的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。
二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA用DNase I 消化DNA组份加量模板(RNA) 10ugRNase Inhibitor 4ulDNase I buffer 10ulDNase I 10ulDEPC处理H2O 至100ul混匀，37℃90min三、RNA琼脂糖凝胶电泳1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。
2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。
倒入凝胶板上凝固30min。
2．取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。
3．120V电压下电泳25min。
用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4．RNA电泳结果如下图所示。
可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。
四．RNA反转录为cDNA反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul 体系)模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整)引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ulDEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul混匀，70℃5min，立即冰浴5*buffer 4.0ul 8.0uldNTP(10mM) 2.0ul 4.0ulRNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul混匀，37℃5minM-MLV 1.0ul 2.0ul42℃60min ，70℃10min反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
qRT-PCR流程
qRT-PCR流程摘要：苯酚的主要作⽤是裂解细胞，使细胞中的蛋⽩，核酸物质解聚得到释放。
苯酚虽可有效地变性蛋⽩质，但不能完全抑制RNA酶活性。
qRT-PCR，是Quantitative Real-time PCR 的简称，也叫实时荧光定量PCR，是⼀种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物的总量，通过内参或者外参法对待测样品中特定DNA序列进⾏定量分析的⽅法。
qRT-PCR⽬前已成为不同样本间进⾏基因表达⽔平差异⽐较权威的⽅法。
然⽽不适当的实验设计，没有⾜够的对照和重复，低质量的RNA样本，逆转录引物选择不理想，qRT-PCR的引物退⽕温度选择不当和数据分析⽅法不正确等都可能会成为影响qRT-PCR检测灵敏度的因素。
下⾯普健⽣物就从8个⽅⾯带你详细了解⼀下qRT-PCR的注意事项，以提⾼你的实验成功率。
1、实验设计 由于RNA易降解,对外在环境敏感，因此在实验条件或样本操作等各个环节都需要严格把控。
2、RNA抽提 RNA的抽提环境⾮常关键。
由于RNA酶⽆处不在和其难以灭活的顽固本性，在实验的每⼀步，任何偶然的疏忽或不妥当的操作都有可能造成RNA酶的污染，从⽽导致整个实验的失败。
因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染，是保证实验成功的关键。
RNA抽提建议⽤专⽤的操作区，离⼼机、移液枪、试剂等均应专⽤；所⽤的耗材、溶液及试剂均应是RNase-free或经过DEPC处理过的（这⼀步很费精⼒但不得不做，所以失败了会很痛苦）；操作过程中应始终戴⼀次性橡胶⼿套，并经常更换，以防⼿臂上的细菌、真菌以及⼈体⾃⾝分泌的RNA酶造成污染；避免在操作中说话聊天并且要记得戴⼝罩以防RNA酶污染；提取过程应尽量保持低温环境（所以戴个⼿套是正确的选择）并减少操作时间。
关于什么是Trizol，某百科是这样说的： Trizol是⼀种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是一种用于精确测量DNA 或RNA样本中特定目标序列数量的分子生物学技术。
该方法结合了传统PCR 技术和荧光探针技术，可以在PCR反应过程中实时监测和定量特定目标序列的扩增量。
实时荧光定量PCR的步骤如下：
1. 准备反应体系：包括特定目标序列的引物和荧光探针、PCR反应缓冲液、酶和DNA模板。
2. PCR反应：将反应体系放入实时荧光定量PCR仪中进行扩增反应。
PCR过程中，引物与DNA模板结合，酶进行DNA合成，目标序列得到扩增。
3. 荧光探针监测：在PCR反应中，荧光探针与目标序列结合，产生荧光信号。
实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的强度。
4. 数据分析：实时荧光定量PCR仪会根据荧光信号的强度，通过计算机算法来计算目标序列的起始数量。
可以利用标准曲线法或相对定量法进行数据分析，得到目标序列的绝对或相对数量。
实时荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、高准确性和广泛线性范围等优点，
广泛应用于分子生物学、医学诊断、基因表达分析等领域。
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实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。
二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA用DNase I 消化DNA组份加量模板(RNA) 10ugRNase Inhibitor 4ulDNase I buffer 10ulDNase I 10ulDEPC处理H2O 至100ul混匀，37℃ 90min三、RNA琼脂糖凝胶电泳1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。
2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。
倒入凝胶板上凝固30min。
2．取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。
3．120V电压下电泳25min。
用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4．RNA电泳结果如下图所示。
可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。
四．RNA反转录为cDNA反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系)模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整)引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ulDEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul混匀，70℃ 5min，立即冰浴5*buffer 4.0ul 8.0uldNTP(10mM) 2.0ul 4.0ulRNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul混匀，37℃ 5minM-MLV 1.0ul 2.0ul42℃ 60min ，70℃ 10min反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2）Oligo(dT)：是一种仅对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。
3）特异性引物：最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。
用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
做 Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。
引物设计的要求：① Tm=55-65℃② GC=30-80%③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。
④引物的退火温度要高，一般要在 60℃以上。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。
做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。
对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。
五、cDNA与引物质量检测取0.2ml薄壁PCR管，编号。
向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10ul；加入正反向引物各0.5ul（引物浓度10uM），向管中加入混合的cDNA各1ul。
各管补加水至20ul。
组份加量2×PCRTaqMix 10ul10uMPrimer FW 0.5ul10uMPrimer RV 0.5ulTemplate DNA 1ulddH2O 混匀至20ul混匀，置于TP600PCR仪中。
95℃ 5min；95℃15s，60℃35s ，40cycles；72℃ 5min；4℃ pause。
取扩增产物各8μl，DL2000 分子量标准5μl/泳道。
1%琼脂糖凝胶120V电压下电泳25min。
用凝胶紫外分析仪观察。
选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。
六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。
常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA 等。
因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。
七、定量 PCR检测：取0.2ml薄壁PCR管，分别编号。
向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，对应的cDNA各1ul。
一管中不加模板用作阴性对照。
各管补加水至25ul。
组份加量模板(cDNA)/ddH2O 1.0ul10uM 引物F/R 0.5ul2×qPCR Mix 12.5ulddH2O 11.0ul混匀，置于SLAN荧光定量PCR仪中。
95℃5min预变性后，95℃15s→65℃35s（荧光检测），40cycles。
荧光定量PCR一般把退火和扩增设成一个温度，只在扩增出现问题时才会考虑设梯度。
八、扩增曲线和溶解曲线溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线。
如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质；如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。
如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-Time PCR中很难避免；若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。
在溶解曲线中出现双峰有三种可能：①引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物；②在做基因表达差异时容易出现DNA被扩增峰（只在引物跨内含子时存在），出现原因是提取RNA时存在DNA污染，可以通过电泳验证，这时要重新消化RNA样品中的DNA；③扩增非特异，这时要重新摸扩增条件或重新设计并验证引物。
九、表达差异的计算方法绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本或是目标转录本在不同时相的表达差异之间的表达差异。
2-△△CT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。
在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。
显然，我们说X基因在经过某种处理后表达量增加2.5倍比说该基因的表达从1000 拷贝/细胞增加到2500拷贝/细胞更加直观。
2-△△CT方法的推导（详见实时定量PCR和2-△△CT法分析基因相对表达量）补充：在DNase I 消化样品RNA 中的DNA后，需要对样品重新进行氯仿抽提，具体实验流程如下：消化后总体积10Oul，体积太少，不利于抽提，我们往往补加200ulDEPC水。
1. 向离心管中加入等体积氯仿（约300ul），剧烈颠倒，充分混匀至中层出现白色片状沉淀。
4℃14000 rpm离心8min，取上清（约250ul）。
2. 加入1/10体积的NaAC（3M）（约25ul）和预冷的等体积异丙醇（约280ul），-20℃放置20min。
3. 4℃14000 rpm离心15min，去上清，注意不要触到沉淀。
4. 加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm离心3min，去上清。
5. 瞬时离心，用200ul（或10ul）的枪头小心吸去离心管底的残存液态（勿吸到管底的沉淀）。
6. 把离心管放置于超净台晾至约5-10 分钟（勿完全干燥，否则很难溶）。
加入30~50μl 的无RNase的水，静止1min 后，振荡30sec，瞬时离心。
7. 将提取的RNA立即进行下游实验，或放-20℃保存。