实时荧光定量PCR(Real-Time-PCR)实验流程

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程

一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)

不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。

在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。

二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA

用DNase I 消化DNA

组份加量

模板(RNA) 10ug

RNase Inhibitor 4ul

DNase I buffer 10ul

DNase I 10ul

DEPC处理H2O 至100ul

混匀，37℃ 90min

三、RNA琼脂糖凝胶电泳

1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：

1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。

2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。

2．取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。

4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。

四．RNA反转录为cDNA

反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系)

模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整)

引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul

DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul

混匀，70℃ 5min，立即冰浴

5*buffer 4.0ul 8.0ul

dNTP(10mM) 2.0ul 4.0ul

RNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul

混匀，37℃ 5min

M-MLV 1.0ul 2.0ul

42℃ 60min ，70℃ 10min

反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求

1）随机六聚体引物：

当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

2）Oligo(dT)：

是一种仅对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。

3）特异性引物：

最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

做 Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

① Tm=55-65℃

② GC=30-80%

③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。

④引物的退火温度要高，一般要在 60℃以上。

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。

五、cDNA与引物质量检测

取0.2ml薄壁PCR管，编号。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10ul；加入正反向引物各0.5ul（引物浓度10uM），向管中加入混合的cDNA各1ul。各管补加水至20ul。

组份加量

2×PCRTaqMix 10ul

10uMPrimer FW 0.5ul

10uMPrimer RV 0.5ul

Template DNA 1ul

ddH2O 混匀至20ul

混匀，置于TP600PCR仪中。95℃ 5min；95℃15s，60℃35s ，40cycles；72℃ 5min；4℃ pause。

取扩增产物各8μl，DL2000 分子量标准5μl/泳道。1%琼脂糖凝胶120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察。

选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。

六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：

由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA 等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。

七、定量 PCR检测：

取0.2ml薄壁PCR管，分别编号。向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，对应的cDNA各1ul。一管中不加模板用作阴性对照。各管补加水至25ul。组份加量

模板(cDNA)/ddH2O 1.0ul

10uM 引物F/R 0.5ul

2×qPCR Mix 12.5ul

ddH2O 11.0ul

混匀，置于SLAN荧光定量PCR仪中。95℃5min预变性后，95℃15s→65℃35s（荧光检测），40cycles。荧光定量PCR一般把退火和扩增设成一个温度，只在扩增出现问题时才会考虑设梯度。

八、扩增曲线和溶解曲线

溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线。

如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质；

如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。

如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-Time PCR中很难避免；

若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实