实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析
荧光定量常见问题分析
荧光定量 PCR 常见问题分析荧光定量 PCR 常见问题分析 Q1．CT 值出现过晚．1.扩增效率低，反应条件不够优化。
设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2.PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足。
3.PCR 产物太长。
一般采用 80-150bp 的产物长度。
Q2．无 CT 值（信号）出现．信号） 1.反应循环数不够。
一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至 45cycles），但高于 45 个循环会增加过多的背景信号。
2.检测荧光信号的步骤有误。
一般 SG 法采用72℃延伸时采集，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3.引物或探针降解。
可通过 PAGE 电泳检测其完整性。
4.引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5.模板量不足。
对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6.模板降解。
避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
Q3．标准曲线的线性关系不佳． 1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2.标准品出现降解。
应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3.引物或探针不佳。
重新设计更好的引物和探针 4．模板中存在抑制物，或模板浓度过高 Q4．阴性对照也出现明显的起飞． 1.应 mix 或水被污染。
2.引物二聚体的出现。
用 SG 法在 35cycles 以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
3.反应过程中探针的降解。
用 PAGE 电泳对探针进行检测。
4.如果使用了 ROX 校正，则可能是 ROX 的降解所造成。
Q5．在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相同的一个保温过程．如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。
Q6．熔解曲线不止一个主峰．1．引物设计不够优化。
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
荧光定量PCR实验数据分析
荧光定量PCR实验数据分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的实验方法，用于定量检测特定DNA序列的丰度。
荧光定量PCR是一种非常重要的分子生物学技术，在基因表达分析、疾病诊断等领域得到广泛应用。
在进行荧光定量PCR实验后，需要对实验数据进行分析，以获取样品中目标DNA序列的丰度信息。
本文将介绍荧光定量PCR实验数据分析的基本步骤和常见方法。
首先，荧光定量PCR数据的分析通常包括以下几个步骤：1.荧光PCR数据的获取：荧光定量PCR实验过程中，荧光信号会被记录下来。
对于每个样品，会获得一条荧光曲线，曲线上的荧光信号强度与PCR循环次数（Ct值）有关。
2. 荧光曲线的阈值设置：荧光曲线上的信号强度在实验的早期循环中较低，随着PCR循环的进行逐渐增加，直至达到一个稳定的平台。
阈值（threshold）是在这个平台上设置的一个信号强度的固定值，用于确定Ct值。
常用的阈值设置方法包括固定阈值法和导数阈值法。
3.Ct值的计算：Ct值是荧光定量PCR实验中的一个重要指标，表示荧光信号达到阈值的循环次数。
在荧光曲线上，Ct值可以通过与阈值的交点来确定。
Ct值越小，表示目标DNA序列的丰度越高。
4.样品之间的Ct值比较：荧光定量PCR实验中，通常需要同时检测一些内部参考基因（如GAPDH）作为对照，以便进行样品之间的Ct值比较。
内部参考基因应在不同样品中表达稳定，其Ct值应接近。
通过对目标基因的Ct值与内部参考基因的Ct值进行比较，可以计算出样品中目标DNA序列的相对丰度。
5.目标DNA序列的绝对丰度计算：通过构建标准曲线，可以将目标DNA序列的相对丰度转化为绝对丰度。
标准曲线是通过在实验中使用一系列已知浓度的目标DNA序列标准品进行绘制的。
通过测量标准品的Ct值并绘制荧光信号与目标DNA序列浓度的关系曲线，可以通过比较样品的Ct值与标准曲线来计算目标DNA序列的绝对丰度。
荧光定量PCR常见问题分析
荧光定量PCR常见问题分析荧光定量PCR常见问题分析Q1．CT值出现过晚1.扩增效率低，反应条件不够优化。
设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3.PCR产物太长。
一般采用80-150bp的产物长度。
Q2．无CT值（信号）出现1.反应循环数不够。
一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。
2.检测荧光信号的步骤有误。
一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
3.引物或探针降解。
可通过PAGE电泳检测其完整性。
4.引物或探针的设计，如探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。
5.模板量不足。
对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
6.模板降解。
避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
Q3．标准曲线的线性关系不佳1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
2.标准品出现降解。
应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
3.引物或探针不佳。
重新设计更好的引物和探针4．模板中存在抑制物，或模板浓度过高Q4．阴性对照也出现明显的起飞1.应mix或水被污染。
2.引物二聚体的出现。
用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲线进行分析。
3.反应过程中探针的降解。
用PAGE电泳对探针进行检测。
4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。
Q5．在溶解曲线前是否插入一个同溶解程序初始温度相同的一个保温过程如果在熔解曲线前没有一个保温过程，则曲线会在前几个循环非常陡峭，使真正的熔解峰型几乎看不到。
Q6．熔解曲线不止一个主峰1．引物设计不够优化。
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2.引物浓度不佳。
适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3.镁离子浓度过高。
适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
医学检验中实时荧光定量PCR技术的使用注意事项分析
医学检验中实时荧光定量PCR技术的使用注意事项分析实时荧光定量PCR技术是一种广泛应用于医学检验领域的分子生物学技术，具有高灵敏度、高特异性和高度定量的特点。
在使用实时荧光定量PCR技术进行医学检验时，需要注意以下几点。
首先，实验室操作规范是保证实时荧光定量PCR技术准确性和可靠性的关键。
操作人员应该严格按照实验室的操作规程进行操作，并遵循好实验室规范。
操作前应进行充分的准备工作，包括准备实验所需试剂、标准品、阳性对照和负对照等。
同时，应根据实际需要设计好实验方案，包括引物和探针的选择以及扩增条件的优化等。
其次，实时荧光定量PCR技术的反应体系也需要特别注意。
在制备反应液时，应按照标准操作流程严格配制，确保各组分的准确浓度，避免误差的出现。
此外，在反应体系中还应添加可见染料以判断反应是否正常进行，在出现问题时及时调整和排除故障。
同时，反应体系的体积也需要根据不同的实验目的进行合理调整，以保证准确的定量结果。
第三，控制实时荧光定量PCR技术过程中的污染也是非常重要的。
PCR反应非常敏感，即使少量的外源DNA也可能对结果产生干扰。
因此，在样品的提取、纯化和扩增过程中，应当严格控制外源DNA的污染。
实验过程中应设有负对照组和阳性对照组，用于确认试剂和系统是否受到污染，以确保结果的可靠性。
此外，实验人员还应注意不要将样品或试剂带到其他实验室或工作区域，以免交叉感染。
此外，实时荧光定量PCR技术的数据分析也需要谨慎。
在实验过程中，所得到的荧光信号曲线应具有明确的指数增长阶段，并且有足够高的信噪比。
对于每个PCR反应，都需要做好内部质控，如负对照组和阳性对照组。
在数据分析时，应使用专业的软件进行数据处理和结果解读，避免主观因素对结果的干扰和误判。
同时，还需要将结果与临床实际情况进行综合判断，避免误诊或漏诊的发生。
最后，实时荧光定量PCR技术在医学检验中的应用也需要结合实际情况进行合理选择。
虽然实时荧光定量PCR技术具有高度灵敏性和特异性，但并不适用于所有的检测需求。
实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析
使用高质量的试剂和仪器
高质量的试剂和仪器是实时荧光定量PCR实验的基础，包括 高质量的DNA聚合酶、高灵敏度的荧光探针、可靠的定量 PCR仪等。
选择经过认证的试剂和仪器，并按照说明书正确使用和维护 ，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
优化PCR反应条件
优化PCR反应条件可以显著提高实验 的重复性和准确性，包括调整模板浓 度、引物浓度、循环数等参数。
通过梯度PCR或条件优化实验，可以 找到最佳的反应条件，使扩增曲线更 符合标准曲线的要求。
严格控制实验操作规范
实验操作规范是保证实时荧光定量PCR数据质量的重要环节，包括实验前的准备 、样本处理、加样、扩增和检测等步骤。
基线漂移
01
总结词
基线漂移是指PCR扩增曲线在起始阶段出现非特异性扩增，导致背景信
号过高。
02
详细描述
基线漂移可能是由于模板污染、酶活性降低或反应条件不适等原因引起
的。高背景信号会掩盖特异性扩增信号，导致检测结果不准确。
03
解决方案
在实验过程中，要严格控制操作环境，避免交叉污染。同时，要定期检
查酶活性，确保其处于最佳状态。此外，可以通过软件对扩增曲线进行
03 实时荧光定量PCR常见问 题分析
扩增效率不一致
总结词
扩增效率不一致会导致数据无法准确反映样本中目标基因 的表达水平。
详细描述
扩增效率不一致通常是由于反应条件、引物设计或试剂质量等 问题导致的。这会导致不同样本间的相对表达量出现偏差，从 而影响实验结果的准确性。
解决方案
在实验过程中，要确保反应条件的一致性，包括温度、时间、 循环数等。同时，要选择质量可靠、设计合理的引物和试剂， 并进行预实验以确定最佳的反应条件。
荧光定量PCR常见问题及解答
荧光定量PCR常见问题及解答更新時間：2010-12-10 10:43:37一、无 Ct 值（信号）出现：1.反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；2.检测荧光信号的步骤有误：一般采用 72℃延伸时采集荧光，Taqman 方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；3.引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4.探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；5.模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；6.模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。
二、如何确认模板中是否含有 PCR 反应阻害物质：有时RNA或cDNA模板中存在对反转录和荧光PCR 反应的阻害物质。
为了确认这样的阻害物质的有无，我们可以使用高浓度的模板按 3－4 个梯度稀释，并使用其进行荧光定量 PCR 反应。
如果无阻害物质存在，得到的 Ct 值就会依模板浓度的变化而变化；而如果模板中有阻害物质的存在，实验过程中我们就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。
三、Ct值出现过晚：1.反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；2.PCR各种反应成分的降解或加样量不够；3.扩增产物片段过长：一般采用 100－200bp 的扩增长度。
四、标准曲线的线性关系不佳：1.加样存在误差，标准品稀释不呈梯度；2.标准品降解：标准品尽量避免反复冻融；3.引物或探针不佳：重新设计；4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
五、阴性对照液出现明显的扩增：1.荧光 PCR mix 或水被污染；2.引物二聚体的出现：在 35 循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析；3.反应过程中探针降解：用PAGE电泳对探针进行检测。
六、溶解曲线不止一个主峰：1.引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；2.引物浓度不佳：适当调整引物浓度；3.退火温度低：提高退火温度；4.镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；5.模板中有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组 DNA 的污染，或通过引物设计避免非特异扩增。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。
该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。
荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。
在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。
荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。
实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。
数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。
通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。
数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。
荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。
通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。
1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。
该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。
荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。
定量PCR数据常见问题分析
PCR inhibitors?
3
PCR抑制物
• 黑色素 • 多糖类 • 血红蛋白 • 尿素 • 其他
• 乙醇 • 蛋白酶K • 胍盐 • 苯酚
4
检查样本质量
• 用分光光度计测量样品260/280比值。
• DNA纯度：OD260/OD280=1.8 • RNA纯度：OD260/OD280=2.0
• 将样品梯度稀释，制作标准曲线
5
标准曲线检查DNA样本质量
• 以一个高浓度的样本(cDNA or gDNA)作为起始样本 • 对样本进行梯度稀释 • 每个稀释度重复三次进行绝对定量实验 • 检查标准曲线的线性
55
如何判断它们是否存在扩增？
• 同时，这些曲线都没有明显的指数增长期。
56
如何判断它们是否存在扩增？
• 其次，看Y轴的数值。
• 这些“可疑”曲线的指数增长期范围常常是落在1e-2 的范围内。
对数图
57
如何判断它们是否存在扩增？
• 最后，看线性图。
• 曲线一直没有上升的趋势，提示不存在扩增。
58
运用不同的工具解决问题：
扩增曲线：
− 查看扩增曲线的形状：是否有明显扩增阶段（特别是指数增长期）? 所有的曲线是否平行?
− 查看Y轴的数值：是否高于背景信号? − 查看线性图： 曲线是否有明显的“take off” ？
标准曲线：扩增效率是否一致 原始数据：各组分的原始荧光表现
常见的问题归类：
抑制物：制作标准曲线查看 重复性差：基线/阈值设置，加样/混匀，泊松分布，参比荧光 可疑的扩增：综合各种图谱分析
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
抑制聚合酶活性。
二、常见问题分析
检查样本质量
•用分光光度计测量样本260/280比值 •DNA纯度：OD260/OD280=1.8 •RNA纯度：OD260/OD280=2.0
二、常见问题分析
2、自动基线有问题
二、常见问题分析
手动设置基线
•点击右键，选择Baseline Threshold
•案例： 再看下线性图谱，可以看到曲线有一定的上升。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
•案例： •分析： •形成这类曲线的原因可能是模板可能是模板的质量差（PCR 抑制物；模板浓度低），也有可能是引物探针有问题。 •试剂原因： •如果使用的试剂背景信号太强，荧光的增长将会很小，导致 扩增曲线的指数增长期会变得很短，或者没有。 •荧光信号差的试剂也会有同样的问题。
基线
一、数据分析
基线
一、数据分析
基线
一、数据分析
基线
一、数据分析
阈值线
一、数据分析
阈值线
一、数据分析
二、常见问题分析
1、PCR扩增抑制（以Bio-CFX96为例）
扩增曲线荧光强度大小及Ct值大小可提示存在抑制。
H07存在扩增抑制；解决方法：将样本稀释后进行扩增。 （抑制物的影响可通过稀释样本消除）
实时荧光定量PCR 数据分析及常见问题分析
一、数据分析
定量PCR扩增曲线的各种概念
一、数据分析
什么是基线
• 基线是扩增曲线的水平部分。
一、数据分析
基线扣除
一、数据分析
什么是阈值
• 阈值是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为 阈值线。
一、数据分析
什么是Ct值
• Ct值是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值。
二、常见问题分析
总结
➢ 对PCR原理的了解是基础，一切从原理出发。 ➢ 常见问题归类： • 抑制物：稀释样本消除抑制 • 重复性差：基线/阈值设置、加样/混匀、泊松分布、参比
荧光 • 可疑的扩增：综合各种图谱分析
二、常见问题分析
手动设置基线
•将Baseline End设置为“扩增信号出现的前一个循环” •即，原始为26，将其设置为20，点击OK
二、常见问题分析
手动设置基线
• 设置完成后问题曲线恢复正常
二、常见问题分析
3、重复性
1个样本4个复孔重复性好
二、常见问题分析
3、重复性
1个样本4个复孔重复性差
二、常见问题分析
PCR抑制物
黑色素 多糖类 血红蛋白 尿素 其他
乙醇 蛋白酶K 胍盐 苯酚
二、常见问题分析
血液中PCR抑制物的作用机制及对策
抑制物
作用原理
对策
肝素
可结合于DNA和RNA上； 对反转录酶和聚合酶有抑制作用。
肝素酶或氯化锂
血红蛋白
乳铁蛋白 免疫球蛋白
IgG 亚铁血红素
是否可以调整引物和模板的比例？
• YES。 • 低引物浓度会导致高Ct值（灵敏度低）。 • 所以对于低浓度的样本，反应体系中引物的浓度却不能太
低。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
•首先看对数图谱，和同一反应中的其它曲线相比，这些曲线 的形状不相同。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
结束→扩增信号出现的前一个循环 •如果基线、阈值设置无问题，则是其它原因造成重复性差。
二、常见问题分析
加样误差（操作？移液器？） 没有将试剂和样本充分混匀
• 有时候在制备PCR反应混合液时（包括Goldstar/PCR Mix反 应液、引物探针、样本、水），在分装入反应板（管）前 没有充分混匀。
•同时这些曲线没有明显的指数增长期。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
•最后看线性图谱。 •曲线一直没有上升的趋势，提示不存在扩增。
二、常见问题分析
如何判断他们是否存在扩增？
•案例： 先看对数图谱 右侧的曲线形状和扩增曲线很相似，但曲他们是否存在扩增？
1）DNA-琼浆糖凝胶珠的相互混 含干有扰铁DN，A合释成放。铁离子至PCR混合物，合2（）；牛加血入清0白.6%蛋（白w）t/v；ol）的BSA
3）NaOH处理。
含干有扰铁DN，A合释成放。铁离子至PCR混合物，同上
与单链DNA相互作用
同上
与DNA、RNA结合，后续的提取过
程中不能被去除；
加BSA，结合亚铁血红素
比荧光，或者ROX添加浓度不适合，请将ROX校准关闭 （None）。
二、常见问题分析
4、“可疑的” 扩增曲线（以ABI7500为例）
•由于PCR扩增形成的真正的扩增曲线通常很容易确认。 •有特征的形状：首先有背景信号（基线期），然后是三个增 长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期）
二、常见问题分析
指数增长期内扩增曲线具有高度重复性
二、常见问题分析
是什么原因造成平台期很低呢？
•可能是目标样本的浓度太低。 •通常如果模板的起始浓度太低，反应体系中会形成大量的引 物二聚体。 •大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增 曲线的平台期很低。
二、常见问题分析
引物和模板比例
二、常见问题分析
• 结果加入到每个孔中的试剂成分就有所不同。
• 解决方法： • 在分装反应混合液前，要将其充分混匀（振荡、吹打）离
心。 • 同时上机之前，要将PCR反应板（管）离心，使所有液体
都在反应管底部。
二、常见问题分析
低拷贝的样本→泊松分布
• 泊松分布：是一种统计与概率学里常见到的离散机率分布 （discrete probability distribution）。
二、常见问题分析
造成重复性差的原因
•基线、阈值的设置 •加样误差（操作？移液器？） •没有将试剂和样本充分混匀 •低拷贝的样本→泊松分布 •没有使用ROX校准（ABI7500）
二、常见问题分析
基线、阈值的设置
•根据曲线的具体情况进行设置： 阈值：大部分曲线荧光强度/20 基线：开始→2/3（根据仪器和试剂）
• 在30ul中有9个模板，每个反应管均匀的分配到3个模板的 几率有多高？如果30ul中有9000个模板呢，又会怎么样？
二、常见问题分析
ROX校准：参比荧光（ABI7500）
二、常见问题分析
ROX设置
• ABI7500仪器软件自动进行ROX校准。 • ROX校准为可选步骤，如果使用的PCR试剂没有添加ROX参