细胞培养课件
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细胞培养—无菌操作课件
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洁净级别—无菌药品生产所需的洁净 区可分为4个级别
• A级：高风险操作区，如灌装区、放置胶塞桶和与无菌制剂直接接 触的敞口包装容器的区域及无菌装配或连接操作的区域，应当用单 向流操作台（罩）维持该区的环境状态。单向流系统在其工作区域 必须均匀送风，风速为0.36-0.54m/s（指导值）。应当有数据证明 单向流的状态并经过验证。在密闭的隔离操作器或手套箱内，可使 用较低的风速。
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无菌操作—器皿的消毒
• 所有用到的器皿（买时已灭菌的除外）都必须经过高压灭 菌烘干后才能放入超净台内
• 已灭菌的、外包装完好的培养瓶、离心管、冻存管等可以 表面经75%酒精擦拭后直接放入超净台
• 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的 瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面
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生物安全柜
• 生物安全柜一般是做致病菌，霉菌，酵母菌，病毒来用，操作区域 是负压，简单说是往上处抽风的，当然致病菌也不是直接抽出排到 室外，是过滤在生物安全柜的顶部漏器上，从排风量上可以分为， 50%外排型，75% 以及100%外排型。在生物安全柜内所形成的几乎没 有微生物的环境中，尽量避免使用明火，酒精灯的火焰可能会影响 室内的气流平衡。
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洗手和着装
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洗手和着装
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洗手和着装
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洗手和着装
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无菌操作—个人防护
• 在实验室工作时必须使用个体防护装备 • 个人衣服和普通实验服不能穿入细胞培养室内 • 实验室内不能穿长摆裙，短裙及短裤，不得在实验室内穿露脚趾的鞋
动物细胞培养技术ppt课件
常用的排除微生物污染的方法
抗生素排除法：采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓 度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养物，有时可能奏 效。
加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的 细胞至于41摄氏度作用5～10h（最长可达18h），以杀灭支 原体。
动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或 腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细 胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤 细胞进行培养
2、上皮型细胞：
名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同
来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍 生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形， 中有圆形核
生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层— 铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个 活动
3、游走细胞型：
呈散在生长，一般不连成片，胞质常 突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规 则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细 胞相区别。
4、多型细胞型：
有一些细胞，如神经细胞难以确定其 规律和稳定的形态，可统归于此类。
（二）悬浮型：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易 大量繁殖。
(二) 细胞的营养
培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增 殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞 营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还 提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一， 含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养 成分 。
其它成分（条75%酒精泡2—3秒钟 （时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再 用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置 平皿中。
细胞培养技术培训ppt课件版
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下 生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能 状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等， 表明细胞代谢不良。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
倒 置 显 微 镜
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液 氮 罐
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严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
《组织细胞培养技术》PPT课件
2．Hanks使用液配制法 取上述甲、乙液等量用三蒸水稀释 10 倍，即成使用液。用前高压灭菌。 例如配制100 ml Hank使用液，则取三 蒸水 900ml 加入甲液 50ml 、乙液 50ml 混 匀，用高压灭菌15min。临用时，用 7.5％NaHCO3调至所需pH。
附 ： 为配 制 上述 Hanks 液 ， 应先 配 好 0.4 ％酚红溶液待用。配制方法如下： 称取0.4g酚红，置玻璃研钵中细研，逐 渐加入 0.1mol/L NaOH 边滴边研至酚红 完全溶解，记好加 NaOH 的量，共加至 11.28ml 为止，将研好的酚红液用吸管 移入烧瓶中加三蒸水 88.72ml ，高压灭 菌15min。
组织细胞培养技术
授课教师 左 丽
贵阳医学院免疫学教研室 2008年4月10日
第三章
培养用液
培养用液是维护组织细胞生存、生 长及进行细胞培养各项操作过程中所 需的基本溶液。主要包括平衡盐溶液、 常用试剂及培养基三大类，培养基又 分为天然培养基与合成培养基.
平 衡 盐 溶 液 （ balanced salt solution， BSS）具有维持渗透压，调 控酸、碱平衡的作用，并可供细胞生存 所需的能量和无机离子成分，另外尚可 用作洗涤组织、细胞以及配制各种培养 用液的基础溶液。常用试剂是制备细胞、 培养细胞及检查细胞所必需的，为细胞 培养提供了方便、有利的条件。
BSS内还含有少量的酚红，作为pH 变化的指示剂，溶液变酸性时呈黄 色，变碱性时呈紫红色，中性时呈 桃红色。
目前最常用的BSS是Hanks液、Eagle液和 PBS等。在细胞培养中，BSS用途如下： （1）作为配制培养基的基础溶液： （2）配制各种试液：如配“胰酶”消化液。 （3）用于洗涤组织和细胞。
八植物细胞培养及次生物质生产模板PPT课件
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规范 标准 专业 高效
-7/XX-
二、 单细胞培养技术（single cell
culture）
1、平板培养(plating culture)
单击此2处、编看辑护母培版养标题(n样ur式se culture)
3、微室培养(micro-chamber culture)
4、双层滤纸培养(feeder layer cultur)
植板：将1份培养基充分混合均匀，然后均匀地平 铺于培养皿中，其厚度为1-2mm左右。
规范 标准 专业 高效
-9/XX-
克隆愈 伤组织
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细胞悬浮 过滤 与培养基 植板 混合
培养
规范 标准 专业 高效
-10/XX-
平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞 在接种单细胞总和中所占的比例。
根形成
生根培养基
规范 标准 专业 高效
-2/XX-
植物细胞培养的类型
单细胞培养(单个细胞) 细胞悬浮培养(小的细胞团) 大规模细胞培养(大量培养细胞)
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规范 标准 专业 高效
-3/XX-
第一节 植物的单细 胞培养 单击此处编辑母版标题样式
规范 标准 专业 高效
-4/XX-
第八章 植物的细胞培养 单击此处编辑母版标题及样次式生代谢产物生产
规范 标准 专业 高效
-1/XX-
培养过程：
培养物
植外物植细体胞培养（Plant
愈伤组织诱导培养基
Cell Culture）:
单击此在 细处编愈离胞辑伤体团母组条进版织件行标下 培题， 养样式对 和植 继物 代单 培养个再，细分胞大化或量培小获养的得基 细胞不群定体芽的技术。
规范 标准 专业 高效
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二、 单细胞培养技术（single cell
culture）
1、平板培养(plating culture)
单击此2处、编看辑护母培版养标题(n样ur式se culture)
3、微室培养(micro-chamber culture)
4、双层滤纸培养(feeder layer cultur)
植板：将1份培养基充分混合均匀，然后均匀地平 铺于培养皿中，其厚度为1-2mm左右。
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克隆愈 伤组织
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细胞悬浮 过滤 与培养基 植板 混合
培养
规范 标准 专业 高效
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平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞 在接种单细胞总和中所占的比例。
根形成
生根培养基
规范 标准 专业 高效
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植物细胞培养的类型
单细胞培养(单个细胞) 细胞悬浮培养(小的细胞团) 大规模细胞培养(大量培养细胞)
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第一节 植物的单细 胞培养 单击此处编辑母版标题样式
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-4/XX-
第八章 植物的细胞培养 单击此处编辑母版标题及样次式生代谢产物生产
规范 标准 专业 高效
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培养过程：
培养物
植外物植细体胞培养（Plant
愈伤组织诱导培养基
Cell Culture）:
单击此在 细处编愈离胞辑伤体团母组条进版织件行标下 培题， 养样式对 和植 继物 代单 培养个再，细分胞大化或量培小获养的得基 细胞不群定体芽的技术。
细胞培养基本方法从体内到体外优秀课件
（osmotic pressure of humor） ４、细(hyperthermy)对细胞生存的影响：
导致酶的变性而失活
破坏细胞膜的类脂质
高热
细胞核分裂异常
破坏纺锤体
细胞浆外层的钙释放
代谢停止 细胞膜渗透性变化 多极分裂出现 停止在中期 凝固酶使细胞凝固
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
（osmotic pressure of humor） ４、细胞之间的相互联系
２、氧和酸碱度（oxygen and power of hydrogen）
氧 是细胞生存必不可少的条件之一。尽管一些细胞如骨
（一）体内细胞生存的营养条件
１、水（water） ２、无机盐（inorganic salt） ３、葡萄糖（glucose） ４、维生素（vitamin） ５、氨基酸（amino acid）
（二）体内细胞生存的其它条件
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
骼肌细胞、红细胞可通过糖酵解而获得能量，但大多数细 胞缺氧不能生存。
酸碱度 酸度和碱度的度量采用pH表示， pH即氢离子浓度
的负对数值。 各种组织细胞的正常功能及一切生物化学反应，都是在适
当的和稳定的氢离子浓度下进行的。大多数有机体的细胞所耐 受的pH范围为6.0~8.0。人类血液的pH值一般维持在7.36~7.44。
这些现象就是细胞之间相互沟通信息的表现。
（三）体外生长大环境
１、体外培养实验室 ２、体外培养实验室的设备和器具
１、体外培养实验室
导致酶的变性而失活
破坏细胞膜的类脂质
高热
细胞核分裂异常
破坏纺锤体
细胞浆外层的钙释放
代谢停止 细胞膜渗透性变化 多极分裂出现 停止在中期 凝固酶使细胞凝固
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
（osmotic pressure of humor） ４、细胞之间的相互联系
２、氧和酸碱度（oxygen and power of hydrogen）
氧 是细胞生存必不可少的条件之一。尽管一些细胞如骨
（一）体内细胞生存的营养条件
１、水（water） ２、无机盐（inorganic salt） ３、葡萄糖（glucose） ４、维生素（vitamin） ５、氨基酸（amino acid）
（二）体内细胞生存的其它条件
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
骼肌细胞、红细胞可通过糖酵解而获得能量，但大多数细 胞缺氧不能生存。
酸碱度 酸度和碱度的度量采用pH表示， pH即氢离子浓度
的负对数值。 各种组织细胞的正常功能及一切生物化学反应，都是在适
当的和稳定的氢离子浓度下进行的。大多数有机体的细胞所耐 受的pH范围为6.0~8.0。人类血液的pH值一般维持在7.36~7.44。
这些现象就是细胞之间相互沟通信息的表现。
（三）体外生长大环境
１、体外培养实验室 ２、体外培养实验室的设备和器具
１、体外培养实验室
植物细胞培养ppt课件
• 外植体：用来进行离体无菌培养的离体材料。
• 愈伤组织：外植体在离体培养条件下，细胞经脱分
化等一系列过程，产生一团不定型的疏散排列的薄 壁细胞（具有未分化细胞的特性）。
• 胚状体：由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽，胚
根和胚轴的胚状结构。
• 不定芽：愈伤组织中的细胞发生分化，形成
不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。
植物生长调节物质：
生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D
细胞分裂素类：BAP, KT，TDz，ZT
pH值（5.8）
琼脂
精选ppt
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• 封口：接种后，瓶，管用无菌药棉或盖封
口，培养皿用无菌胶带封口
• 温度（25度），pH（5-6）和氧气（5%）
• 增殖：在新梢（愈伤组织）等形成后，分
株或切段转入增殖培养基中继代培养。
3）分化期：分化期是指在分裂期的末期，细胞 内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而 使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。分 化出形态和功能不同的细胞，分生细胞、色素 细胞、纤维细胞等 。
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• 愈伤组织要求：松散性好、增殖快、再生能力强 。
外观一般为鲜艳的乳白或淡黄色，呈小颗粒状， 疏松易碎。
总的原则：健康无病的年幼组织。
精选ppt
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2）培养材料的消毒
材料
自来水和蒸 馏水冲洗
酒精中浸泡 30-60秒
无菌水 冲洗3遍
0.01%升汞 （HgCl2)消毒10 分钟
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3） 制备外植体
在无菌条件下将材料切成0.2-0.5cm厚的小片， 剥去芽的鳞片，嫩枝的外皮或种皮胚乳。
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苗后用自来水冲洗干净；再移栽到准备好 的基质中。
植物细胞大规模培养ppt课件
阅读课本P228-230
营养耗尽，细胞数目不再增加且次生物质达一定含量
时，收获细胞，提取产物。他们用此系统成功地培养 了银杏、冬青、黑麦草和蔷薇等细胞。结构简单，易
10分钟
于操作是本系统的突出优点。但它的生产效率不够高，
次生物质累积的量也较少。
悬浮培养中的植物细胞的特性
由于植物细胞有其自身的特性，尽管人们已经在各种微生物反应器中成功地
前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；后者则相反， 细胞生长缓慢而次生物质含量相对较高。
1、植物细胞的大规模悬浮培养
1953年Muir成功地对烟草和直立万寿菊的愈伤组织
进行了悬浮培养。继之Tulecke和Nickell（1959）推出
了一个20L的植物细胞封闭式悬浮培养系统。经蒸汽灭 菌后接入目的培养物，以无菌压缩空气进行搅拌。当
固定化培养 主要 固定化培养是在微生物和酶的固定化培养基础上发展起来的植物细胞培养方法。该 法与固定化酶或微生物细胞类似，应用最广泛的、能够保持细胞活性的固定化方法是 将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。
三、植物细胞的大规模培养技术
目前用于植物细胞大规模培养的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培养和植 物细胞或原生质体的固定化培养。
泡沫和表面粘附性
6、植物细胞培养时产生的泡沫有何特点？
静止期
减慢期
悬浮细胞的生长与增殖
细 胞
数
直线生长期
由于悬浮培养具有：增加培养细胞与培
养液的接触面，改善营养供应；可带走培 养物产生的有害代谢产物，避免有害代谢 产物局部浓度过高等问题；保证氧的充分 供给等三个基本优点，使悬浮培养细胞的 生长条件比固体培养有很大的改善。
无菌空气入口
植物组织与细胞培养课件
植物组织与细胞培养
第三十四页，共三十四页。
培养
第十九页，共三十四页。
幼胚培养
(péiyǎng)
影响幼胚培养成功的因素 培养基：无机盐、碳水化合物、激素等
环境(huánjìng)条件(温度：多数为25-30℃，因植物种类有所
差别。光照：一般认为黑暗或弱光条件较为合适。)
提高幼胚的成活率，可采用胚乳看护培养
第二十页，共三十四页。
胚龄与胚性发育(fāyù)的关系
胚乳培养过程 含胚乳的果实或种子→表面消毒(xiāo dú)→无菌 条件下胚乳的剥离→接种培养基培养。 培养室温度25-27℃，黑暗或弱光下进行。
第二十四页，共三十四页。
胚乳培养的器官发生(fāshēng)
愈伤组织形成、器官发生 （1）愈伤组织的诱导 （2）愈伤组织的再分化 （3）胚乳苗的生根培养
经过自身的代谢作用合成其生长必需的物质，在营养 上已可以完全独立。
第十四页，共三十四页。
依据所剥离胚的发育时期(shíqī)不同：
培养类型
幼胚培养 (immature embryo)
成熟胚培养 (mature embryo)
子叶形成(xíngchéng) 之前
子叶(zǐyè)形成之后
第十五页，共三十四页。
受精胚珠的培养
未受精胚珠的培养
植物胚珠(pēi zhū)结构图示
第二十九页，共三十四页。
胚珠 培养 (pēi zhū)
胚珠培养的方法 培养受精胚珠，摘取授粉时间合适的子房(zǐfáng)，如培养 未受精胚珠，则在授粉前摘取子房(zǐfáng)→表面灭菌→剖 开子房壁，取出胚珠或带胚珠的胎座接种培养。
胚培养：指在无菌条件(tiáojiàn)下将胚从胚珠或种子中
第三十四页，共三十四页。
培养
第十九页，共三十四页。
幼胚培养
(péiyǎng)
影响幼胚培养成功的因素 培养基：无机盐、碳水化合物、激素等
环境(huánjìng)条件(温度：多数为25-30℃，因植物种类有所
差别。光照：一般认为黑暗或弱光条件较为合适。)
提高幼胚的成活率，可采用胚乳看护培养
第二十页，共三十四页。
胚龄与胚性发育(fāyù)的关系
胚乳培养过程 含胚乳的果实或种子→表面消毒(xiāo dú)→无菌 条件下胚乳的剥离→接种培养基培养。 培养室温度25-27℃，黑暗或弱光下进行。
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胚乳培养的器官发生(fāshēng)
愈伤组织形成、器官发生 （1）愈伤组织的诱导 （2）愈伤组织的再分化 （3）胚乳苗的生根培养
经过自身的代谢作用合成其生长必需的物质，在营养 上已可以完全独立。
第十四页，共三十四页。
依据所剥离胚的发育时期(shíqī)不同：
培养类型
幼胚培养 (immature embryo)
成熟胚培养 (mature embryo)
子叶形成(xíngchéng) 之前
子叶(zǐyè)形成之后
第十五页，共三十四页。
受精胚珠的培养
未受精胚珠的培养
植物胚珠(pēi zhū)结构图示
第二十九页，共三十四页。
胚珠 培养 (pēi zhū)
胚珠培养的方法 培养受精胚珠，摘取授粉时间合适的子房(zǐfáng)，如培养 未受精胚珠，则在授粉前摘取子房(zǐfáng)→表面灭菌→剖 开子房壁，取出胚珠或带胚珠的胎座接种培养。
胚培养：指在无菌条件(tiáojiàn)下将胚从胚珠或种子中
三维细胞培养技术培训ppt课件
3 水凝胶三维细胞培养
试剂盒组分 ① BD Matrigel ② PBS缓冲液 ③ 细胞回收液
赛哲生物®水凝胶三维细胞培养系列试剂盒（#SZCE13001~#SZCE13010） 乳腺癌系列、胃癌系列、宫颈癌系列、肝癌系列、肺癌系列 分别用于胶上培养、胶内培养
3 水凝胶三维细胞培养
胶内培养
胶上培养
Байду номын сангаас
3 水凝胶三维细胞培养
细胞处理
药物刺激： 胶上层培养液中加入刺激药物
细胞转染： 胶上培养： ① 使用sagene 3D-HG（#SC1201） 三维培养专用转染试剂 ② 使用慢病毒or 腺病毒感染 胶内培养： 使用慢病毒or 腺病毒感染
3 水凝胶三维细胞培养
细胞的回收
细胞回收液（cell recovery solution）：不含酶，能够解聚matrigel 1-2ml 细 胞 回 收 液 ， 轻 轻 刮 起 含 有 细 胞 的 凝 胶 （ 禁 止 吹 吸 ） ， 转 入
水凝胶三维细胞培养
服务热线：400-888-4242
1
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① 什么是三维细胞培养 ② 如何实现三维细胞培养 ③ 水凝胶三维细胞培养 ④ 更多问题
广州赛哲生物科技有限公司 服务热线：400-888-4242
1 什么是三维细胞培养
——Kenneth M. Yamada, and Edna Cukierman. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. [J]cell. 130, 601-610.
2 如何实现三维细胞培养
水凝胶三维培养：
将细胞培植在一定的细胞外基质中 , 细胞外基质（extracellularmatrix, ECM ）蛋白充当生长支架。
《细胞培养基础》PPT课件
体 外 培 养 细 胞 分 裂 指 数 介 于 0.10.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、 温度等影响。
▪ 指数生长期是细胞活力最好的时期，可对 细胞进行各种实验
▪ 指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断 增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触 汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则 无接触抑制现象。
• 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后，应直接放入含有10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置 换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此 可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴 附之问题
支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
▪ 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢 产物的影响而发生密度抑制
（三）停滞期：
即细胞数量达到饱和密度后，细胞 与营养液的交换面积减少，代谢产物积 累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。
在此时应及时进行传代，否则因细胞 中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再 传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞的传代培养操作
细胞培养的污染和检测
• 细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒 • 污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞
细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。 洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单 胞菌属，是植物病原菌。
白色念珠菌污染
真菌感染
支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状
– 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养 箱。如发现支原体污染，丢弃培养物
• 培养液中无贴壁因子
原代细胞培养物污染
• 原代培养组织在进入培养前已污染
– 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液 反复冲洗组织
▪ 指数生长期是细胞活力最好的时期，可对 细胞进行各种实验
▪ 指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断 增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触 汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则 无接触抑制现象。
• 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后，应直接放入含有10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置 换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此 可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴 附之问题
支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
▪ 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢 产物的影响而发生密度抑制
（三）停滞期：
即细胞数量达到饱和密度后，细胞 与营养液的交换面积减少，代谢产物积 累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。
在此时应及时进行传代，否则因细胞 中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再 传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞的传代培养操作
细胞培养的污染和检测
• 细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒 • 污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞
细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。 洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单 胞菌属，是植物病原菌。
白色念珠菌污染
真菌感染
支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状
– 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养 箱。如发现支原体污染，丢弃培养物
• 培养液中无贴壁因子
原代细胞培养物污染
• 原代培养组织在进入培养前已污染
– 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液 反复冲洗组织
细胞培养技术 ppt课件
PPT课件
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二、培养细胞相关条件
（三）细胞培养用试剂
（7）其他
谷氨酰胺： 终浓度2 mmol/L HEPES： 丙酮酸钠： 10-25 mmol/L 终浓度1 mmol/L
2-巯基乙醇：终浓度50 uM
PPT课件
29
三、培养细胞技术 （一）基本操作
1. 无菌操作
防止微生物污染； 培养用一切物品、液体都无菌。 （37度预热，或室温平衡） 2. 操作区消毒 75%酒精擦拭（生物安全柜，进入操作区物品） 紫外消毒20-30 min 3.洗手和着装 4. 实验操作
• 细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开 发,人参皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究与开发。 • 单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体,治疗用单
PPT课件 4
细胞培养目的和作用
基础研究
(1) 药物作用机理； (2) 基因功能； (3) 疾病发生机理。
2、生物制药
• 疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗 等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
二、培养细胞相关条件
• 血清分类
• 1、特级胎牛血清（最高级别的） （1）Hyclone 北美特级胎牛血清（SH30070.03） （2）Gibco北美特级胎牛血清（16000-044）
• 2、优等级胎牛血清 （1）Hyclone加拿大优等胎牛血清（SH30396） （2）Hyclone澳大利亚优等胎牛血清（SH30084） （3）Gibco澳大利亚胎牛血清（10099-141）
PPT课件 3
细胞培养目的和作用
1、科学研究
药物研究与开发
• 新药筛选：如化学合成药物药效研究,中药有效成分 筛选与鉴定等。 • 疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎 病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
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指数生长期是最佳实验期 !
细胞指数生 长极限点 细 胞 数 量 平台期 退化死亡
潜伏期
指数生长期
0
24
48
72
96
120
小时
正常培养细胞的生长曲线
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养
原代培养的一般流程
实验准备 取材、 取材、分离细胞 原代培养 维护培养
操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手， 操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手， 着装 然后用1 新洁尔灭浸泡消毒5 然后用1‰ 新洁尔灭浸泡消毒5分钟
小鼠胚胎成纤维细胞原代培养
细胞的传代培养
将原代培养物分割后重新接种到两 个或多个培养瓶内进行培养，这一 操作称为传代培养,传代比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异. 细胞传代培养的意义 传代时机的把握 传代培养的代数限制；少数细胞可 出现永生化
细胞数增大极限点， 出现接触抑制
细胞指数生长 极限点 细 胞 数 量 （MI、细胞群 体倍增时间） 平台期 退化死亡
细胞培养的基本概念
培养细胞的类型
贴附型
成纤维样细胞型 上皮样细胞型
悬浮型
培养的骨髓瘤细胞 培养人真皮成纤维细胞
培养人口腔上皮细胞
细胞培养的基本概念
贴附型细胞的生长特性 细胞的贴壁生长 接触抑制 细胞的生长曲线
细胞贴壁延展过程(模式图) 细胞的接触抑制现象 细胞贴壁延展过程(模式图)
细胞数增大极限点， 出现接触抑制
超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱 动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗 粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过 工作台面，使工作台内构成无菌环境。
解剖显微镜
倒置显微镜
2.细胞培养的主要实验设备 2.细胞培养的主要实验设备
3.细胞培养的主要试剂（培养基）
基础培养基（人工合成）：干粉培养基DMEM 、α-MEM、RPMI1640 血清（天然成分）： 水：高纯度的去离子水 抗菌素：通常是青霉素和链霉素联合使用，使用浓度为100U/ml 消化液：常用0.25％胰蛋白酶，使细胞脱离组织或容器壁， 用含血清培养液中止其活性
培养细胞 的观察
在培养瓶中加入 适量含血清培养液
分装接种，置于CO2 培养箱中继续培养
调整细胞密度
吹打悬浮细胞
细胞的传代培养： 细胞的传代培养：悬浮型
直立瓶
去旧液
加新液
加新液
分瓶接种
细胞培养前的实验准备
离心机 实 验 台 橱柜
1.细胞培养室设置
显 微 镜
实验台
缓冲间
衣 柜 冰箱
无菌操作室
递物窗 培养箱 试剂柜
超 净 工 作 台 实 验 仪 器 台
冰 箱
实 验 台
实 验 台
实 验 台
实 验 台
准备室
水 池
无菌操作室
上风口
下风口
超净工作台和CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以 保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒 ③箱内蒸馏水槽中预留灭菌蒸馏水，以保持箱 2.细胞培养的主要实验设备 2.细胞培养的主要实验设备 内湿度，避免培养液蒸发。
分装接种，置于CO2 培养箱中继续培养
调整细胞密度
吹打悬浮细胞
胰酶消化数分钟
细胞脱离器壁， 细胞脱离器壁，呈圆粒状
细胞的传代培养： 细胞的传代培养：贴附型
中止消化、吹散细胞 细胞计数，调节密度 按比例分割，接种至新培养瓶 中止消化、离心，收集细胞 离心， 细胞计数， 按比例分割， PBS洗 涤 1~2次 加入消化液 解离细胞约5min 在倒置显微镜下观 察，细胞呈圆粒状 吸去旧液
潜伏期
指数生长期
0
24
48
72
96
120
小时
每一代培养细胞的生长过程分期
细胞的传代培养： 细胞的传代培养：贴附型
吸去旧液 PBS洗 涤 1~2次 加入消化液 解离细胞约5min 在倒置显微镜下观 察，细胞呈圆粒状
培养细胞 的观察
在培养瓶中加入 适量含血清培养液
分装接种，置于CO2 培养箱中继续培养
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养
（三）接种培养
1. 用移液器吸去培养皿中的多余液体加入适量含20%新生牛血清的DMEM 培养液，将组织块转移至新的培养皿（瓶）中，并均匀分布在培养皿 （瓶）的底部，做好标记（日期、名称、编号），放入37℃，5％CO2， 100％相对湿度的培养箱中培养。 2. 细胞沉淀用适量含20%新生牛血清的DMEM培养液重新悬浮；利用血球 计数板计数，调节细胞密度为105个/ml，计算细胞的存活率（具体实 验步骤见“细胞计数与活力检测”部分）；剩余细胞悬液用于细胞冻 存实验（具体见“细胞的冷冻保存”部分） 3. 第2-3天可以观察，组织块半消化原代培养可见组织碎块附着于培养 瓶（皿）底部，周围细胞呈放射状生长，此时可见有多种细胞类型， 有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是呈圆形的上皮细胞。
原代培养(primary culture)，或 称为初代培养，就是从供体取下组 织细胞后在体外进行的首次培养， 中途不分割培养物。常用的原代培 养方法有组织块培养法和消化培养 法。
细胞培养的基本概念
Hale Waihona Puke 传代培养 （Secondly Culture） Culture）
传代培养(secondly culture) (secondly culture)，在 原代培养物铺展为单细胞层后，将 原代培养细胞分开接种到两个或多 个新的培养瓶中继续培养增殖。
（一）获取小鼠胚胎
1.将8周龄的昆白♀鼠和12周龄的昆白♂按1:1比例合笼。次日晨10:00前观察 ♀鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物（阴道栓）即定为怀孕0.5天； 2.断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。75％酒精消毒后，用普通剪刀和镊 子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥 皮。用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。用眼科弯镊夹住一侧子宫， 分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿 使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。 3.在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。将子宫移入另一 盛有PBS的平皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠， 并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。将胎鼠移入另一盛有 PBS的平皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。
血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等， 其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体病毒污 染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌 血清的使用浓度为5％～20％
4.细胞培养用器皿的清洗和消毒
静止2 静止2～3小时，然 小时， 后将细胞培养瓶轻 轻翻转， 轻翻转，继续静止 培养。 培养。
原代培养流程图： 原代培养流程图：消化法
取材 漂洗 剪碎
计数接种 酶解 (单细胞)
离心洗涤 加液
原代培养流程图： 原代培养流程图：半消化法
取材
漂洗
剪碎
接种 酶解
沉降洗涤
加液
(部分酶解)
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养
细胞培养技术主要参考资料
组织培养和分子细胞学技术. 鄂征 主编. 北京出版社, 1995年8月出版 细胞培养 司徒镇强 主编. 世界图书出版 公司, 1996年出版 体外培养的原理和技术. 薛庆善 主编. 科 学出版社, 2001年1月出版 动物细胞培养——基本技术指南(中译).章 静波 等译. 科学出版社, 2004年10月出版. Human Cell Culture Protocols (2nd Ed). Joanna Picot. Humana Press, October 2004. Basic Cell Culture Protocols (3rd Ed). CD Helgason, CL Miller. Humana Press, October 2004
调整细胞密度
吹打悬浮细胞
细胞的传代培养： 细胞的传代培养：贴附型
培养液颜色、 培养液颜色、是否清亮
培养细胞 的观察
培养细胞的状态
细胞的传代培养： 细胞的传代培养：贴附型
吸去旧液 PBS洗 涤 1~2次 加入消化液 解离细胞约5min 在倒置显微镜下观 察，细胞呈圆粒状
培养细胞 的观察
在培养瓶中加入 适量含血清培养液
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养
（二）分散细胞
1.将干净的鼠胚躯干移至干净的培养皿内（一般6个鼠胚躯干装1皿，视大小而 定），用眼科直剪充分剪碎，剪成约1mm3以下的碎块。 2.用1ml的移液器每皿加入3ml的PBS，混匀，静置30sec，用移液器吸去上清液； 向装有鼠胚碎块的培养皿内加入1ml0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液， 用1ml移液器轻轻吹吸30秒，可见组织块变得较为粘稠，缓慢摇动培养皿25min后利用倒置显微镜观察组织块变透明，并有单细胞脱离时即可进行组织块 半消化的原代培养； 3.留小部分鼠胚碎块于培养皿中用于组织块半消化原代培养，其余移至一尖底 离心管中，置37℃水浴摇动消化15-20min，用于细胞计数及细胞冻存实验； 4.培养皿中立即加入1ml含50%新生牛血清的PBS，吹打混匀，以终止酶的作用； 离心管消化结束后，静置5min，用移液器小心将上清液转移到另一离心管中， 并加入1ml含50%新生牛血清的PBS中，吹打混匀，以终止酶的作用， 1000rpm 离心5min，弃上清，沉淀即为分散的鼠胚成纤维细胞
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养