知识点总结：蛋白质及氨基酸生化基础

蛋白质▲蛋白质的化学知识历史1.1838, Mulder发现了组成生物体的复杂含氮物。

2.1902, Fischer, Hofmeister同时提出肽键理论。

(Nobel，1902)3.1950, Pauling提出蛋白质的二级结构的基本单位：α-螺旋和β-折叠，肽键6个原子在同一平面。

(Nobel，1954)4.1953, Sanger确定了牛胰岛素一级结构。

(Nobel，1958)5.1961, Anfinsen证明蛋白质的一级结构决定其三级结构, 利用核糖核酸酶的变性和复性20种氨基酸–一级氨基酸， Primary amino acid⏹缩写丙氨酸（Ala），缬氨酸（Val），亮氨酸（Leu），异亮氨酸（Ile），脯氨酸（Pro），苯丙氨酸（Phe），色氨酸（Trp），蛋氨酸/甲硫氨酸（Met），甘氨酸（Gly），丝氨酸（Ser），苏氨酸（Thr），半胱氨酸（Cys），酪氨酸（Tyr），天冬酰胺（Asn），谷氨酰胺（Gln），赖氨酸（Lys），精氨酸（Arg），组氨酸（His），天冬氨酸（Asp），谷氨酸（Glu）口诀：⏹分类及特性：✓非极性，通过疏水作用稳定蛋白质的结构, Met, Val, Ala, Gly, Ile, Leu✓芳香族氨基酸，相对非极性，都能参与疏水作用。

Trp, Try, Phe✓极性不带电：水中溶解度较大或更加亲水，可以与水形成氢键。

Ser, Thr, Cry, Asn, Gln, Pro✓植物受到逆境条件的危害，积累Pro。

积累一定量的溶质降低水势。

Pro主要以游离状态广泛存在于植物中，水溶性最大的氨基酸，具有较强的水和能力。

Pro大量积累，含量甚至高达百倍以上。

✓带正电和的三个碱性氨基酸，最为亲水，侧链上有第二个氨基，Arg有带正电的胍基，His有可带电的咪唑基。

Lys✓旋光性与手性原子上的构型没有确定的关系。

⏹氨基酸的理化性质✓一般物理性质：无色晶体，熔点较高，溶解度各不同，在紫外有特征吸收的仅三个芳香族的氨基酸Trp、Tyr、Phe。

测定280nm处的紫外吸收值。

✓两性电解质：同一氨基酸分子上可以同时解离携带正电荷和负电荷，被称为两性电解质ampholyte。

氨基和羧基在不同的PH条件下表现出不同的解离状态。

电荷总量为零时（净电荷为零），溶液的PH值为等电点 isoelectric point, pI.✓ -氨基参与的反应➢与亚硝酸反应（Van Slyke 定氮）➢与甲醛发生羟甲基化反应，直接测定氨基酸浓度。

➢烃基化反应（DNFB）法，二硝基氟苯法，桑格反应，Sanger reaction, 鉴定多肽N端氨基酸的重要方法➢烃基化反应（PITC）法。

Edman氨基酸顺序分析法。

N端测序，苯异硫氰酸酯。

能够不断重复循环，将肽链N端氨基酸逐一进行标记和解离。

➢酰基化反应（丹磺酰氯法），N端测序，丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，DNS-Cl➢酰基化反应（氨基保护反应），用于保护氨基以及肽链合成➢生成西佛碱，多种酶促反应的中间过程➢脱氨基反应：酶催化的反应✓羧基的化学反应➢Strecker降解：弱氧化剂（次氯酸钠）作用下生成NH3和醛；特殊条件下还原成醇、醛；与肼反应，C端氨基酸分析➢成盐成酯，成盐后COOH被保护；酰卤；叠氮化反应，作为多肽合成活性中间体，活化羧基；脱羧✓侧链的化学反应➢羟基：酯化（磷酸化），修饰蛋白质➢巯基：氧化还原，与金属离子的螯合可用于体内解毒✓氨基和羧基共同参与➢茚三酮反应（定性、定量），紫色产物，Pro黄色，比色测定和纸层析显色➢成肽反应▲理化性质、测定及分离纯化理化性质：➢蛋白质溶液是一种胶体溶液；➢特定的空间构象，分子量一定–分子筛层析➢大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷–等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层➢一般而言，蛋白质上同时存在疏水和亲水区域–有机溶剂沉淀，疏水层析（反相层析）胶体性质：分子量大，一万到百万。

球状蛋白质表面亲水，形成水化膜，从而阻止蛋白质颗粒的相互聚集。

颗粒大小：1-100nm之间，属胶体。

稳定亲水胶体的因素：水化膜，表面电荷相同蛋白质分子扩散速度慢，不易透过半透膜，粘度大，将混有小分子杂质的蛋白质溶液置于半透膜制成的透析袋或管内，浮于流动动水或适宜的缓冲液中，小分子杂质易从袋中透出，保留了比较纯化的蛋白质，即透析（dialysis）。

蛋白质大分子溶液在一定溶剂中超速离心时可发生沉降。

沉降速度与离心加速度之比值即为蛋白质的沉降系数S。

s = v/w2r；沉降系数以每单位重力的沉降时间表示，蛋白质、核酸、核糖体、病毒等的沉降系数通常为1-200*10-13s，10-13这个因子叫做沉降单位S。

两性电离和等电点：氨基酸分子中除两端游离的氨基和羧基外，Glu、Asp残基中的γ和β羧基，Lys残基中的ε-氨基，Arg的胍基和His的咪唑基。

作为带点颗粒，在电场中移动，移动方向取决于蛋白质分子所带电荷性质。

蛋白质的电荷即决定于分子组成中碱性和酸性氨基酸的含量，又受所处溶液的pH影响。

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等，即成为碱性离子（净电荷为0），此时溶液的pH值成为蛋白质的等电点。

➢pH=pI，净电荷为零，电场中不移动；➢pH大于pI，带负电，向阳极移动；➢pH小于pI，带正电，向阴极移动；➢pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，没有相同电荷相互排斥的作用，不稳定，溶解度最小，易沉淀。

蛋白质的变性，denaturation➢蛋白质在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失。

变性只是空间构象的破坏，一般认为蛋白质变性的本质是次级键，二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。

➢内部侧链疏水基团暴露于表面，溶解度降低；多肽链松弛伸展，粘度增加；结晶性破坏；生物学活性丧失；结构松散，侧链基团暴露，易于发生化学反应；疏水侧链暴露，导致紫外吸收增加。

➢物理因素–加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波➢化学因素–强酸强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠（SDS）➢复性，renaturation：变性程度较轻时，去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性。

许多蛋白质变性时被破坏严重，不能恢复，称为不可逆变性。

蛋白质的沉淀， Precipitation➢蛋白质分子从溶液中析出的现象–蛋白质沉淀。

➢蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。

➢盐析：在蛋白质溶液中加入大量中性盐以破坏蛋白质交替的稳定性而使其析出。

各种蛋白质所需的盐浓度及pH不同，故可用于对混合蛋白质组分的分离。

盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质活性。

调节蛋白质溶液的pH至等电点后，再用盐析法则蛋白质沉淀的效果更好。

➢重金属盐沉淀蛋白质：可以与重金属离子如汞、铅等结合成盐沉淀，沉淀的条件以pH稍大于等电点为宜。

此时蛋白质分子有较多的负离子，易成盐。

重金属沉淀的蛋白质常是变性的。

临床上抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐吐出。

➢蛋白质与生物碱试剂以及某些酸结合成不溶性的盐沉淀，沉淀条件为pH小于等电点。

正电荷易于与酸根成盐。

➢有机溶剂沉淀蛋白质，可与水混合的有机溶剂，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。

常温下会引起变性，低温下缓慢进行可用于分离制备各种血浆蛋白质。

➢不可逆沉淀：沉淀出来的蛋白质分子，其内部结构发生了较大的改变，失去了原来的生物活性，即使沉淀因素消失也不重新溶解。

加入某些水溶性的有机溶剂，破坏水化膜，进入蛋白质内部，短时间及低温时，沉淀可逆。

但作用时间长或温度较高则不可逆。

生物碱沉淀不可逆，重金属阳离子不可逆。

➢加热凝固：接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，首先使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。

➢蛋白质的变性、沉淀、凝固之间有密切的关系。

但蛋白质变性后不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀，沉淀的变性蛋白质也不一定凝固。

蛋白质的紫外吸收：波长，280nm。

主要是色氨酸和酪氨酸的共轭双键。

Phe在紫外光下也有光吸收。

蛋白质的颜色反应➢双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色。

凡分子有两个以上-CO-NH-键的化合物都由此反应。

因此所有蛋白质都能与双缩脲试剂发生反应。

➢米伦反应：蛋白质溶液中加入米伦试剂，蛋白质首先沉淀，加热变为红色沉淀。

此为酪氨酸的酚核特有的反应，因此含有酪氨酸的蛋白质均呈米伦反应。

➢茚三酮反应：蓝色，α－氨基酸➢黄蛋白反应：含有苯环的氨基酸，与硝酸共热，呈黄色，再加碱则变为橙黄。

一般蛋白质均有。

➢含硫蛋白质：含有Cys或Met等，与碱基醋酸铅共热时，分解产生的硫遇铅即产生黑色的硫化铅沉淀。

➢色氨酸反应：滴入乙醛酸 + 浓硫酸，如果有吲哚环，则两液层的界面上会出现紫色环，这个反应称为色氨酸反应，也称乙醛酸反应或霍普金（Hopking）反应。

用来检验Trp残基。

蛋白质的定量测定法➢凯氏定氮法：消化、蒸馏、吸收、滴定。

➢双缩脲法测定蛋白质含量。

碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛应用。

标准曲线（560nm）。

➢Folin-酚法测定蛋白质含量。

1。

在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质–铜络合物；2。

此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂）还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。

灵敏度比双缩脲法高100倍。

改良Lowry法。

➢紫外吸收法，通常以1mg蛋白质/ ml溶液的A280为1.0进行估算。

蛋白质浓度（mg/ml） =0.144(A215-A225)➢BCA法测定蛋白质浓度，碱性溶液中，蛋白质将二价铜还原成一价铜，后者与测定试剂中BCA（双辛丹宁）生成一个在562nm处有最大光吸收的紫色复合物。

复合物的光吸收强度成正比。

抗干扰能力强。

➢考马斯亮蓝法：根据蛋白质与CBB结合的原理设计。

使染料的最大吸收峰位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。

染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

蛋白质的分离纯化✓破碎细胞及离心–粗提液✓分部分离：利用蛋白质大小或带电性将混合物中的蛋白质分离成不同的组分。

利用溶解度不同，涉及pH、温度、盐浓度等。

盐析✓透析：半透膜的袋子或管子中，脱盐。

✓超速离心：不同蛋白质的密度与形态不同，沉降速度不同。

大体上S与蛋白质分子量成正比；S与密度和形状相关，紧密颗粒的摩擦系数小–快；疏松颗粒的摩擦系数大–慢。

分离纯化和分子量测定。