荧光素酶报告实验

荧光素酶报告实验

1 扩增目的片段

扩增包含靶基因与miRNA互补位点的3’UTR序列以及mutant序列，上下游引物5’端各含有不同的酶切位点和保护碱基（如Pme I，Spe I）；电泳检测目的条带，看大小是否正确，然后用试剂盒纯化PCR产物备用。主要采用了2 种方法进行序列突变及扩增，如下图所示：第一种方法：

第二种方法：

1.2 取1-2 μg纯化的目的片段或pMIR-REPORT载体，按酶切反应体系配制混合液进行酶切（加0.01% BSA），酶切3h后，80℃灭活5 min，冰上降温。酶切产物进行胶回收。

酶切体系连接体系Component V olume (μl) Component V olume (μl) H2O 16-x H2O 8-m-n

Vector or DNA x Vector m

NEB Buffer I或IV 2 DNA n

Spe I 1 10×T4 Ligase Buffer 1

Pme I 1 T4 DNA Ligase 1

Total voloume 20 Total voloume 10

1.3 配制连接反应混合液（DNA和Plasmid的molar ratio为3:1到6:1），16℃连接过夜或室温连接10 min。连接完毕后，将连接产物转化入感受态大肠杆菌（热激法）。Amp（100 μg/ml）抗性培养板筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定目的片段，送3个样本测序，提取质粒酶切鉴定等。并扩繁阳性克隆。重组Luc-3’UTR 质粒主要元件和组成如下图所示（重组Luc-3’UTR-Mut 原理相同）：

pLuc-MET 3'UTR 荧光素酶报告基因载体的构建

4.接种对数生长期的HEK293细胞（10% FBS+90% DMEM培养）于96孔板，3×103个/孔，每个实验组设置6个复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养24h；

5.根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，配制转染液，转染HEK293细胞；

A 液B液

pLuc-3’UTR 0.1 μg Lipofectamine 2000 0.5 μl

pRL-SV40 0.05 μg OPTI-MEM 25 μl

Mimic/NC 100 nM终浓度

OPTI-MEM 25 μl

6 转染48 h后，吸除96孔板中的培养液，用ddH2O稀释Passive Lysis Buffer至1×浓度，在96孔板中加入1×Passive Lysis Buffer，20 μl/孔，用移液枪反复吸打裂解细胞；

7 在白色不透明的96孔板中加入100 μl/孔的Luciferase Assay Substrate；

8 从每孔裂解好的细胞悬液中吸出11.5 μl加入Luciferase Assay Substrate中混匀；

9 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据；

10 用Stop & Glo® Buffer稀释Stop & Glo® Substrate至1×使用浓度；

11 在第7步完成后，加入Stop & Glo® Substrate 100 μl/孔，混匀；

12 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据，两次测得数据的比值代表各孔样本的相对荧光强度。