细胞破碎技术
第三章细胞破碎技术
第三章细胞破碎技术第⼆章细胞破碎和分离提取技术2．1细胞破碎技术许多⽣物产物特别是蛋⽩质、基因重组产品、胞内产品如：青霉素酰化酶，碱性磷酸酶等胞内酶，⼲扰素、胰岛素、⽣长激素等基因⼯程产物以及部分植物细胞产物等都是胞内物质，这类⽣物产物需要分离纯化的第⼀步是收集细胞及细胞破碎，使⽬标产物释放出来，然后进⾏分离纯化。
如图所⽰：图胞内产品的分离纯化过程2．1．1细胞破碎⽅法及机理破碎细胞的⽬的是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增⼤渗透性）或破碎、释放其中的⽬标产物，主要采⽤的⽅法有机械法和⾮机械法两⼤类，图1列出了⼀些主要⽅法：破碎⽅法固体剪切作⽤液体剪切作⽤⼲燥处理溶胞作⽤珠磨法压榨法⾼压匀浆超声破碎酶溶法化学法物理法撞击法图1 细胞破碎⽅法分类机械破碎中细胞所受的机械作⽤⼒主要有压缩⼒和剪切⼒，化学破碎则利⽤化学或⽣化试剂或酶改变细胞壁或细胞膜的结构，增⼤胞内物质的溶解速率，或完全溶解细胞壁，形成原⽣质体后，在渗透压作⽤下，使细胞膜破裂⽽释放胞内物质，各作⽤⼒细胞破碎机理如图22.1.2机械⽅法破碎机械破碎处理量⼤，破碎速度较快，时间短，效率较⾼，是⼯业规模细胞破碎的重要⼿段，细胞受到挤压，剪切和撞击作⽤，易被破碎在许多情况下，细胞内含物全部释放出来，由于机械搅拌产⽣热量，破碎要采⽤冷却措施，机械破碎主要的⽅法有珠磨法、⾼压匀浆法、撞击破碎法和超声波等⽅法。
2.1.2.1 珠磨法（Bead milling ）珠磨法是⼀种有效的常⽤的机械破碎⽅法，珠磨机是珠磨法所采⽤的设备，其结构⽰意图3，细胞悬浮液与玻璃珠（或⽯英砂，或氧化铝）⼀起⾼速搅拌，研磨使细胞达到某种程度破碎，在珠磨机中，细胞的破碎是由剪切⼒层之间的碰撞和磨料的滚动⽽引起的。
珠磨法破碎细胞可采⽤间歇式连续操作，研究表明，两种情况下，细胞破碎动⼒学可近似表⽰为：t k l S 11n ?=-其中， t 在间歇操作时，为破碎操作时间，连续操作时为细胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间，即R Vt =，其中V 为悬浮液体积m 3，Q 为悬浮液流量m 3/S ，S 为破碎率，k 为破碎速率常数，与许多因素有关。
生物分离工程5(细胞破碎技术)
01
02
03
04
生物制药
用于提取和分离药物、蛋白质 、酶等生物制品。
食品工业
用于提取植物和动物细胞中的 营养成分，如植物油、动物蛋
白等。
环境科学
用于处理废水中的有害物质， 如重金属、有机污染物等。
农业领域
用于提取植物细胞中的有用成 分，如植物激素、天然色素等
。
02
细胞破碎技术的基本原理
物理法
01
表面活性剂法
利用表面活性剂改变细胞 壁的通透性，使细胞内容 物释放出来。
有机溶剂法
利用有机溶剂如丙酮、乙 醇等溶解细胞壁，使细胞 内容物释放出来。
生物法
酶解法
利用酶如溶菌酶、蛋白酶等将细胞壁分解，使细胞内容物释 放出来。
细菌分泌的蛋白酶
利用某些细菌分泌的蛋白酶将细胞壁分解，使细胞内容物释 放出来。
细胞破碎技术的历史与发展
最早的细胞破碎技术可以追溯到19世纪末，当时人们开始使用机械研磨法破碎细胞。
随着科技的发展，出现了多种新型的细胞破碎技术，如超声波破碎、高压均质破碎、 化学渗透压破碎等。
近年来，随着生物技术的快速发展，细胞破碎技术也在不断改进和完善，以满足更 高效、环保和低成本的需求。
细胞破碎技术的应用领域
细胞破碎过程需要消耗大量的能量，这可能导致生产成本的增
加。
可能引起样品污染
02
在破碎过程中，如果设备或条件控制不当，可能会引起样品的
交叉污染或样品中原有成分的降解。
对细胞的损伤
03
高强度的破碎条件可能会对细胞内部结构造成损伤，影响后续
的分离和提取过程。
04
细胞破碎技术的应用案例
在制药行业中的应用
第四章 细胞破碎和分离技术
（一）双水相分离技术 1、双水相体系简介
1896年，荷兰微生物学家Beijerinck发现
明胶
琼脂（或可溶性淀粉）
传统的双水相体系是指高聚物双水相体系
憎水程度有所差异
2、常用双水相体系 （1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖； （2）聚乙二醇(PEG)/盐相（硫酸盐或者磷酸盐）
聚乙二醇(PEG) 无毒、无刺激性，具有良好的水溶性
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
（2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
举例
珠磨法 固体剪切作用 便宜 大规模处理
高压匀浆法 液体剪切作用 适中 大规模处理 超声波法 液体剪切作用 昂贵 小规模处理
（二）物理法 1、渗透压冲击法 2、冷冻-融化法
1、渗透压冲击法（最温和）
将细胞放在高渗溶液中（如高浓度蔗糖溶液），由 于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发 生收缩，当达到平衡后，将细胞转入水或低渗缓冲 液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入 胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用 2、酸处理 3、化学试剂法
1、碱处理 pH值=11.5---12.5碱处理可导致细胞溶解。
优点：价格便宜，适于任何规模 的操作，易使蛋白使活。
2、酸热法
盐酸对细胞壁中的某些成分（主要是多糖和 蛋白质）的水解作用，使细胞壁结构变疏松， 同时经沸水浴处理，细胞吸水膨胀破裂。
缺点：破壁效果差，后续处理难除HCl。
细胞破碎方法综述
细胞破碎方法综述细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。
结合重组DNA 技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。
关键词：细胞破碎；细胞壁；细胞膜；细胞破碎方法1前言目标产物的分离纯化在现代生物技术工业中占有十分重要的位置，它决定着产品的纯度和安全性，也决定着产品的收率与成本。
许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外，而保留在细胞内。
破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。
自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛应用以来,生物技术发生了质的飞跃,生物产品的数量越来越多,许多具有重大应用价值的产品应运而生,如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一2等,它们的基因分别在宿主细胞(如大肠杆菌或酵母细胞)内克隆表达成为基因工程产物,从而提高了产量,降低了成本。
很多基因工程产物都是胞内物质 (如上述药物经克隆表达后都属胞内物质),分离提取这类产物时,必须将细胞破壁,使产物得以释放,才能进一步提取。
因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤,破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注。
2细胞破碎技术2．1高压匀浆破碎法（homogenization）高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。
细胞破碎技术
细胞破碎技术
细胞破碎技术是一种将细胞壁破坏并使细胞内部成分释放出来的方法。
这种技术常用于提取和分离细胞内的蛋白质、DNA、RNA等分子。
常见的细胞破碎技术包括机械破碎、超声破碎、冻融破碎和化学破碎等方法。
1. 机械破碎：使用研钵、高速搅拌器、螺旋刀等机械设备对细胞进行破碎，通过物理力使细胞破裂，并释放出细胞内的分子。
2. 超声破碎：利用高频率的超声波对细胞进行振荡，产生剧烈的机械剪切力和微小气泡的崩溃，从而破碎细胞壁。
3. 冻融破碎：将细胞冷冻后迅速加热，重复冻结和加热的过程会使细胞壁破裂，并释放出细胞内的成分。
4. 化学破碎：利用化学试剂对细胞进行处理，如使用碱性溶液、表面活性剂或酶，以破坏细胞壁，使细胞破碎并释放出细胞内的分子。
细胞破碎技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学、生物化学等领域，可用于提取纯化目标分子、研究细胞内的代谢过程、检测疾病标志物等。
细胞破碎原理
细胞破碎原理
细胞破碎是一种常见的实验操作，也是生物学研究中的重要步骤。
它的原理是将细胞膜破裂，释放细胞内的各种成分，以便进行后续的实验操作。
细胞破碎原理涉及到多种方法和技术，下面将详细介绍其中几种常见的细胞破碎原理。
首先，最常用的细胞破碎方法之一是超声破碎。
超声波是一种机械波，具有高频振动的特性。
在细胞破碎实验中，超声波可以有效地破坏细胞膜结构，使细胞内的成分释放出来。
超声破碎通常需要在低温环境下进行，以避免细胞内的酶活性影响实验结果。
其次，离心破碎也是一种常见的细胞破碎方法。
通过高速离心作用，可以将细胞内的各种成分分离开来，达到破碎细胞的目的。
离心破碎的优点是操作简单，且可以避免超声破碎可能带来的高温影响。
另外，化学破碎也是一种常用的细胞破碎方法。
通过特定的化学试剂，可以破坏细胞膜结构，使细胞内的成分释放出来。
不过，化学破碎需要谨慎操作，以免化学试剂对细胞内成分造成影响。
除了以上几种方法外，还有一些其他的细胞破碎方法，如高压破碎、冻融破碎等。
每种方法都有其特点和适用范围，研究人员可以根据实验需要选择合适的方法进行细胞破碎。
总的来说，细胞破碎原理是通过物理、化学或机械手段破坏细胞膜结构，释放细胞内的成分。
在进行细胞破碎实验时，需要根据实验要求选择合适的方法，并注意操作细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文对细胞破碎原理有所帮助，谢谢阅读。
细胞破碎原理
细胞破碎原理细胞破碎，又称为细胞裂解，是指细胞膜或细胞壁破裂，导致细胞内部结构和内容物外溢的现象。
细胞破碎原理是细胞生物学和生物技术领域中的重要研究内容，对于细胞的破碎过程及其机制的深入了解，有助于我们更好地利用细胞内的生物活性物质，如蛋白质、酶和基因等，从而应用于医学、农业和工业等领域。
细胞破碎的原理主要包括物理破碎和化学破碎两种方式。
物理破碎是利用物理力学的方法对细胞进行破碎，常见的方法包括超声波破碎、高压破碎和磁力破碎等。
超声波破碎是利用超声波的作用产生的剧烈振动，使细胞膜或细胞壁受到破坏而发生破碎。
高压破碎则是通过高压力作用下，使细胞膜或细胞壁破裂。
而磁力破碎是利用磁场的作用对细胞进行破碎，通过改变细胞内部的磁性物质的排列，导致细胞破碎。
化学破碎则是利用化学物质对细胞进行破碎，常见的方法包括酶解法、超声波辅助酶解法和离心法等。
酶解法是利用特定的酶对细胞膜或细胞壁进行降解，使细胞破碎。
超声波辅助酶解法是在酶解的过程中，通过超声波的作用加速酶解的速度，从而实现细胞的破碎。
离心法则是通过离心机对细胞进行离心，使细胞内的不同组分分离，从而实现细胞破碎。
细胞破碎的原理在生物技术领域中有着广泛的应用。
首先，在基因工程领域，细胞破碎是提取目的基因的重要步骤，通过破碎细胞膜或细胞壁，释放细胞内的基因，从而进行基因的分离和纯化。
其次，在生物制药领域，细胞破碎是提取重组蛋白质的关键步骤，通过破碎细胞膜，释放细胞内的重组蛋白质，从而进行后续的纯化和制备。
此外，在生物能源领域，细胞破碎也是提取生物质能源的重要手段，通过破碎植物细胞壁，释放细胞内的生物质，从而进行生物质能源的提取和利用。
细胞破碎的原理研究不仅有助于我们更好地理解细胞的结构和功能，同时也为生物技术的发展提供了重要的理论基础和技术支持。
随着生物技术的不断发展和进步，相信细胞破碎的原理研究将会在更多领域展现出重要的应用价值，为人类社会的发展和进步做出更大的贡献。
第二章细胞破碎技术PPT课件
碎片分离 （离心分离、双水相萃取、膜分离）
提取 初步纯化 （沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）
精制 高度纯化 （重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）
成品加工 （浓缩、无菌过滤、干燥、成型）
2.1 概述 2.2 细胞壁的成分和结构 2.3 细胞破碎技术 2.4 破碎率的评价及破碎率的选择依据
2.1 概述
一、微生物细胞
细胞外层结构
革兰氏阴性菌（Gram-negative），泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。葡萄 球菌、链球菌。 革兰氏阳性菌（Gram Positive）是能够用革兰氏染色染成深蓝或紫色的细菌。 大肠杆菌。
各种微生物细胞壁的结构及组成
1、细菌的细胞壁
几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固的骨架——肽聚 糖组成，是聚糖链借短肽交联而成，使细胞具有 一定的形状和强度。
综上所述：
不同生物体或同一生物体的不同部位，细胞破 碎难易程度不同，因此因采用不同的细胞破 碎方法进行破碎。
如：动物器脏细胞没有细胞壁，细胞膜比较脆 弱，容易破碎；植物和微生物细胞都具有纤 维素、半纤维素或肽聚糖组成的细胞壁，应 采用专门的破碎方法进行破碎。
二、植物细胞
真核细胞具有真正的细胞核，其结构要比 原核生物复杂的多。和原核细胞一样，真 核细胞也具有一层细胞膜。
除了细胞膜，真核细胞具有一些有特殊作 用的细胞器。
植物和大多数真菌具有细胞壁。
动 物 细 胞 模 式 图
植 物 细 胞 模 式 图
对于已停止生长的植物细胞来说，其细胞壁 可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细 胞生长时期形成的。次生壁是细胞停止生长 后，在初生壁内部形成的结构。
对于胞内产物，则需首先收集菌体，进行细胞破 碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞 碎片的分离。
细胞破碎技术
细胞破碎技术
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细胞壁组分与真菌分类
关键多糖
分类组
纤维素, 糖原
集胞(粘)菌纲
(Acrasiomycetes)
纤维素, β-葡聚糖 霉目(Saprolegnicales)
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真菌细胞壁
裂褶菌(Schizophyllum commune)细胞壁组 分即使与之不一样, 但含有相同层次结构。三种 聚合物(R)-葡聚糖, (S)-葡聚糖和壳多糖大约占细 胞壁干重70%, (R)-葡聚糖是一个高分枝聚合物, 分支点为β(1,3)和β(1,6), 且与壁惰性层中微原纤 维壳多糖复合。
R=FCn/CnoX
细胞破碎技术
第22页
(2)质量平衡法
将两式合拚, 删去F项, 得
R=Fo Cn/[Cno X -(1-Fo)Cn M(Qc/Qaq)]
当细胞浓度(X)高时, 用直接测定法测定细胞 浓有困难, 也可从样品物理性质和固体质量分数 计算得到。
X=Qc Qaq W(1-M)/[W(Qaq-Qc) + Qc(1-M)]
• 对于量大样品, 显微镜计数法耗时, 枯燥；电子粒子 计数器虽可测定酵母细胞破碎率, 但大细胞破碎物可 能有干扰；用于细菌破碎率测定时,灵敏度较低。
细胞破碎技术
第18页
2.间接测定法
• 依据破碎过程中破碎细胞释放胞内物质量测算, 如测 定可溶性蛋白量或酶活性等, 但需与破碎率到达 100%标准进行比较。在使用酶活性测定法时需注意, 因为粗酶提取物酶动力学与完整细胞或纯化酶可能 有差异而产生误差。
细胞破碎技术
细胞破碎技术细胞破碎技术是我们根据国际九十年代最新技术研制成功的新产品。
对粘度低于0.2Pa.s，温度低于80摄氏度液体物料（液-液相或液-固相）的均质乳化，如乳品、饮料、化妆品、药品等产品的均质、乳化，细胞破碎技术有很好的适用性，下面小编给大家介绍一下细胞破碎技术。
1、细胞破碎技术工作原理样品必须经过严密的金刚石制备分散阀门，并承受超高压力能量狭缝瞬间释放所产生的剪切、空穴、碰撞三种均质分散效应，同时样品始终享受着低温水浴的冷却或恒温（4~6℃间任意调整），使之处理后的样品颗粒均匀纳米化且不易抱团；4-80℃间任意可调也可通过升温改变样品流动性，便于制备与分散。
2、细胞破碎技术用途适用于：高等院校、科研所、化工、涂料、新材料、新能源、生物医药等行业使用石墨烯，纳米碳管、碳粉制备与分散；纳米高分子材料制备与分散；纳米涂料制备与分散；纳米电池液、浆料制备与分散；纳米油墨制备与分散；纳米染料制备与分散；纳米油漆制备与分散；纳米药物制备与分散；其他•••••••••••3、细胞破碎技术设备操作说明整套机器设备安装到位后，检查各系统联接无误（进水管/出水管、排水管、冲洗水管、电源、电路），观察物料样品是否通过透明胶管进入主机进口，冷却循环水是否正常运转流通，然后操作相关按钮，使主机正常工作。
具体步骤见下：（1）接通总电源，整机通电。
将钥匙插入工作/锁定转换孔，并旋到工作位置。
（2）进样杯中加满纯净水或缓冲液，按“液压泵”“开”按钮（绿色），油泵启动，供油压力输入主附油缸。
（3）按“主机”“开”按钮，机器正常运转（往复运动）。
（4）顺时针缓慢调节调压阀，使低压表、高压表压力同步上升，根据样品种类，调节破碎压力（200Mpa以下）。
（5）当纯净水或缓冲液到达进样杯颈部时，按“主机”“关”按钮，机器停止运转。
将待破碎样品加入进样杯中，按“主机”“开”按钮，细胞破碎开始。
经均质阀破碎后的样品，沿循环冷却管路冷却后，从出样口流出，样品一次破碎完成（可根据需要，进行多次破碎）。
第二章_细胞破碎技术
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖占 40 ％一 90％，其余是多糖和磷壁酸。 革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，最外面还有一 较厚的外壁层，外壁层主要由脂蛋白，脂多糖 组成。
破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网 状结构，其网状结构的致密程度和强度取决 于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的 程度，如果交联程度大，则网结构就致密。
W S K 卧 式 高 效 全 能 珠 磨 机
ZM 系 列 卧 式 密 闭 珠 (砂) 磨 机
（三）超声破碎法 工作原理：利用超声波振荡器发射的1525kHz的超声波处理细胞悬浮液，由于超 声波的空化作用而使细胞破碎。 特点：超声波振荡容易引起温度的剧烈 上升，操作时可以在细胞悬浮液中投入 冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。
二、植物细胞
真核细胞具有真正的细胞核，其结构要比 原核生物复杂的多。和原核细胞一样，真 核细胞也具有一层细胞膜。 除了细胞膜，真核细胞具有一些有特殊作 用的细胞器。 植物和大多数真菌具有细胞壁。
动 物 细 胞 模 式 图
植 物 细 胞 模 式 图
对于已停止生长的植物细胞来说，其细胞 壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁 是细胞生长时期形成的。次生壁是细胞停 止生长后，在初生壁内部形成的结构。
一、微生物细胞
细胞外层结构
革兰氏阴性菌（Gram-negative），泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。葡萄 球菌、链球菌。 革兰氏阳性菌（Gram Positive）是能够用革兰氏染色染成深蓝或紫色的细菌。 大肠杆菌。
各种微生物细胞壁的结构及组成
微生物 壁厚（nm） 层 革兰式阳性菌 革兰式阴性菌 酵母 20～80 单层 肽聚糖(40~90%) 多糖 胞壁酸 主要组成 蛋白质 脂多糖 破碎难易程度 难 10～25 100～300 多层 多层 肽聚糖(5~10%) 葡聚糖(30~40%) 脂蛋白 甘露聚糖 （30％） 脂多糖 磷脂 蛋白质 蛋白质 脂类 相对易 最难
微生物细胞破碎原理与技术
酶解破碎
01
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酶解破碎是利用酶分解细胞壁的 一种方法。酶能够特异性地分解 细胞壁中的蛋白质或糖类物质， 使细胞壁变得脆弱，最终破裂。
酶解破碎常用的酶有蛋白酶、糖 酶、胶原酶等。酶的种类和浓度、 反应温度、反应时间等因素都会 影响破碎效果。
酶解破碎的优点是破碎效果好、 细胞碎片小，适用于蛋白质、核 酸等生物大分子的提取。但缺点 是成本较高，需要严格控制反应 条件。
生物技术
利用基因工程和蛋白质工程技术 改造微生物细胞，提高细胞破碎 效率和产物的产量。
微流控技术
利用微流控芯片进行细胞破碎， 实现高通量、高效率和低能耗的 细胞破碎。
提高破碎效率和产物的纯度与活性
优化破碎条件
通过优化破碎条件，如压力、温度、破碎时间等，提 高破碎效率和产物的纯度与活性。
选择合适的破碎方法
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
通过微生物细胞破碎，可以研 究细胞内蛋白质的表达、定位 和功能，有助于深入了解细胞 的生理和病理过程。
微生物细胞破碎技术还可以用 于病毒的分离和纯化，以及疫 苗的制备和研究。
05
未来展望与挑战
新技术的研发与应用
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术提高细 胞破碎效率，减少能耗和成本， 同时提高产物的纯度和活性。
04
应用与实例
工业发酵过程中的应用
微生物细胞破碎在工业发酵过程 中主要用于提取和纯化胞内产物，
如酶、蛋白质、代谢产物等。
通过破碎微生物细胞壁，可以释 放出细胞内的物质，便于后续的
提取和纯化。
工业发酵过程中常用的细胞破碎 技术包括机械破碎、超声波破碎、
化学破碎等。
生物资源开发中的应用
第四章 细胞破碎和分离技术
（2）有机溶剂法
有机溶剂能溶解细胞壁的脂类，从而改变细 胞通透性。
（3）表面活性物质
能溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞通透性增加。
化学法的优缺点 优点 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，
易于固液分离和进一步提取。
①通用性差； 缺点 ②时间长，效率低，一般胞内物质释放率 不超过 80％。 ③有些化学试剂有毒，后续工作需设法分 离除去。
纳豆激酶
1980年，日本心脑血管专家须见洋行博士， 从事溶解血栓药物研究工作
“下午两点半”实验 下午两点半：纳豆提取物加入到人工 血栓中；
下午五点半：血栓溶解2厘米
纳豆的制作
1、泡豆蒸豆
大豆，加水浸泡一夜后，蒸烂。
2、接种纳豆菌
纳豆菌用热水溶解后，加入到大豆中，搅拌均匀，分装。
3、在恒温下发酵14-36小时 4、后熟（活菌低温休眠）
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 （2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
（二）膨胀床分离技术
1、膨胀床的定义
（1）固定床：又称填充床，填充的固体物通常呈 颗粒状，堆积成一定高度的床层。床层静止不动， 流体通过床层进行分离纯化。 （2）流化床：当流体通过床层的速度逐渐提高到 某值时，填料颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床 层体积出现膨胀，但是颗粒仍逗留在床层内而不被 流体带出。床层的这种状态和液体相似称为流化床
（5）柱床的再生和清洗
细胞破碎的方法
细胞破碎的方法细胞破碎是生物学、生物化学等领域中常见的实验技术之一，它的目的是将细胞壁破坏、细胞质液化，并释放出内部的细胞器、代谢产物和蛋白质等物质，以便进行后续的分析和研究。
下面我们将介绍几种常见的细胞破碎方法：1. 高压均质法高压均质法是一种应用于生物样品的基本技术。
通过高速旋转的转子，使生物物质以高速运动摩擦撞击来达到破碎的目的。
高压均质器平均工作压力在10到50 MPa之间，可破坏细胞壁并释放它们的内容物。
高压均质法操作简单，破碎效果较好。
2. 超声波破碎法超声波破碎法是一种简单而高效的细胞破碎方法。
这种方法利用超声波的高频振动破坏细胞壁，使细胞质液化并释放细胞内物质。
超声波破碎法的优点是简单易行，操作灵活，对样品的破坏程度可控。
3. 振荡破碎法振荡破碎法是一种有效的、低成本、易操作并可以克服高温和高压等影响的方法。
它通过振动或震荡特定频率使样品发生共振，达到破碎细胞的目的。
振荡破碎法适用于小样品和较软的细胞，但对于硬壳类生物（如某些藻类、海龟等）效果较差。
4. 冻融破碎法冻融破碎法是指将细胞样品冷冻、解冻多次，利用冻融过程中产生的物理力量使细胞破碎，释放出内部物质。
这种方法不会产生化学改变，样品中的活性细胞因子也不受破坏，是一种常用的原位研究方法。
5. 化学破碎法化学破碎法是一种非常特殊的细胞破碎方法，它是在强酸、强碱、有机溶剂或酶作用下使样品破碎，并释放出内部的物质。
此方法常用于细胞壁为纤维素组成的植物样品。
需要注意的是，不同的酸、碱溶液对不同的细胞具有不同的适应性，需要根据实验需要具体选择。
细胞破碎技术是生物研究领域中不可或缺的技术手段，它为后续的细胞分析和蛋白质表达等实验提供了便利。
以上几种方法中，适用于不同细胞类型和实验需求。
在进行细胞破碎前，需要对不同细胞采取合适的方法，保证破碎后的细胞组织和细胞质液化程度适当，才能得到最好的实验结果。
超声波细胞破碎技术对蛋白质释放率的影响
超声波细胞破碎技术对蛋白质释放率的影响超声波细胞破碎技术在生物医学领域中被广泛应用于蛋白质释放的研究。
本文将探讨超声波细胞破碎技术对蛋白质释放率的影响，并探讨其中的机理。
超声波细胞破碎技术是利用超声波的机械振动效应来破坏、破碎细胞膜和细胞结构的一种方法。
在蛋白质释放的研究中，通过超声波的作用，可以有效地破坏细胞膜，使蛋白质从细胞内释放出来。
超声波破碎细胞的过程中，一般会将待处理的细胞悬浮液置于带有超声波发生器的容器内。
超声波的振动作用使得细胞膜发生剧烈的振动和扭曲，并最终导致细胞膜的破裂。
破裂之后，细胞内的蛋白质便能够自由地释放到外部环境中。
超声波细胞破碎技术能够显著影响蛋白质的释放率。
破坏细胞膜可以有效地增加蛋白质释放的速率和量。
超声波振动作用能够使细胞膜产生不均匀的压力分布，导致膜内部的分子发生扭曲和挤压，从而破坏细胞膜的完整性。
这一破坏作用能够极大地促进蛋白质从细胞内释放的过程。
另一方面，超声波细胞破碎技术还能够改变细胞内的环境，从而影响蛋白质的释放率。
超声波振动会产生热量，并引起细胞内部温度的增加。
这种温度变化可能会导致细胞内蛋白质的空间结构发生改变，进而增加蛋白质的释放速率。
此外，超声波振动还可导致细胞内的机械应力增加，强化细胞的运动，促进蛋白质的释放。
然而，超声波细胞破碎技术对蛋白质释放率的影响也存在一定的局限性。
首先，使用超声波破碎技术有可能引起蛋白质的变性和降解。
超声波的高频振动作用下，蛋白质分子可能会发生结构异常，导致其功能丧失或蛋白质的降解。
其次，超声波的振动力度和时间对蛋白质释放率的影响也需要进一步研究和优化。
过强的超声波振动可能会导致膜的完全破裂，造成蛋白质的流失，而过长的超声波作用时间可能会增加蛋白质的变性和降解风险。
总结起来，超声波细胞破碎技术对蛋白质释放率具有显著的影响。
通过破坏细胞膜和改变细胞内环境，超声波振动能够促进蛋白质从细胞内释放。
然而，超声波振动也存在一定的副作用，可能引起蛋白质的变性和降解。
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四、细胞破碎某些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可，其后续分离和纯化都相对简单。
但由于一些重组DNA(rDNA)产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类生物产品是细胞内产品(非分泌型)，这些产品主要为医药和保健产品，对于这类产品的提取，需要先应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。
细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质(产品)的基础。
随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在都可以大规模生产。
微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称为原生质体。
动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。
通常情况下，细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。
基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。
此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解。
因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。
(一)机械破碎法机械破碎法分为高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法和超声波破碎法三种。
1．高压匀浆破碎法Manton Gaulin高压匀浆器是高压匀浆破碎法常用的设备，它由可产生高压的泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。
细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。
在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。
为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。
高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到20％左右。
团状和丝状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高压匀浆法。
使用高压匀浆法时应注意，高压匀浆器的操作温度上升约2～3℃／10MPa，为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。
多级破碎操作中，为有效防止温度上升，保护产物活性，需要在级间设置冷却装置。
影响高压匀浆器破碎的主要因素包括压力、温度和通过均浆器阀的次数。
升高压力有利于细胞的破碎，这样可以减少细胞的循环次数，在不明显增加通过量的情况下，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，可以避免细胞碎片不至过小，从而给随后细胞碎片的分离工作带来好处。
在工业生产中，通常采用的压力为55 70MPa。
2．高速搅拌珠研磨破碎法研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞破碎。
在工业规模的破碎中，高速搅拌珠研磨破碎法常利用Dyno珠磨机(高速珠磨机)。
水平位置的磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的圆盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。
在料液出口处，旋转圆盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻璃小珠被料液带出。
由于操作过程中会产生热量，易造成某些生化物质破坏，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻璃小珠。
高速搅拌珠研磨破碎法的破碎作用与许多操作参数有关，如搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠的装量和珠体的直径以及温度等。
3．超声波破碎法超声波破碎法是利用超声波振荡器发射的15～25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。
超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。
超声波振荡器可分为槽式和探头直接插入介质两种形式，一般情况下后者比前者破碎效果好。
超声波破碎的机理是在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。
超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。
超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。
超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。
由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。
(二)非机械法破碎方法非机械法破碎法包括酶解破碎法、渗透压冲击破碎法、冻结一融化破碎法、干燥法、化学破碎法和去垢剂破碎法，其中酶解破碎法和化学破碎法应用最广。
1．酶解破碎法酶解是用能溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。
溶菌酶适用于革兰阴性菌细胞的分解，应用于革兰阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。
真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。
酶解破碎法的优点是酶解条件温和，能选择性地释放产物，胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整，便于后步分离等。
但酶的价格高，故小规模应用较广。
自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。
在微生物代谢过程中，大多数细胞都能产生一种能水解细胞壁聚合物的酶，使生长过程能够继续下去。
改变细胞的生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其他的自溶酶，以达到细胞自溶目的。
2．渗透压冲击破碎法渗透压冲击也是一种较温和的破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。
3．冻结一融化破碎法将细胞放在低温(约一15℃)下冷冻，然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。
由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。
对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。
4．干燥法经干燥后的细胞，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。
5．化学破碎法采用化学试剂处理可以溶解细胞或抽提胞内的组分。
常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂。
例如酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常选用浓度为6mol／L的HCI 处理。
碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。
天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等。
合成的表面活性剂可分离子型和非离子型，离子型如十二烷基磺酸钠(SDS，阴离子型)和十六烷基三甲基溴化铵(阳离子型)，非离子型如Triton X一100 和吐温(tween)等。
有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等。
化学破碎法和酶解破碎法一样，也具有对产物的释出选择性好、细胞外形较完整、碎片少、核酸等胞内杂质释放少和便于后步分离等优点，故使用较多。
但该法容易引起活性物质失活破坏，因此，根据生化物质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件是非常重要的。
另外，化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物的纯度，如表面活性剂的存在常会影响盐析巾蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意除去。
(三)目标产物的选择性释放破碎的目的是要得到一种或几种目标产物，因此，在细胞内存在的许多种物质中，选择性释放目标产物，尽量使其他物质少释放出来，并且尽可能降低细胞的破碎程度，对下游分离纯化操作的顺利实施是非常重要的。
利用珠磨法破碎酵母细胞时，酵母内各种酶的释放速率常数不同。
一般靠近细胞壁和细胞膜的酶释放速度快，而细胞内部或细胞器内的酶随着破碎的进行，缓慢释放出来。
因此，选择性地释放目标产物是可能的，关键是要知道目标产物的性质和在细胞内存在的位置，选择适当的破碎方法和操作条件。
选择性释放目标产物应遵循以下原则。
(1)仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较温和的方法，如酶溶法(包括自溶法)、渗透压冲击法和冻结一融化破碎法等。
当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法。
(2)选择性溶解目标产物当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液pH值、离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂，如螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。
同时，溶液性质应使其他杂质不易溶出。
另外机械破碎法和化学破碎法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，可降低细胞的破碎程度。
(3)包含体的分离和蛋白质复性重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。
但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物(如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素一6、人7一干扰素等)不仅不能分泌到细胞外，而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒——包含体。
包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。
这些基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。
为此，欲获得天然活性态的目标产物，必须在分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。
所以，包含体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为生物化学家的蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。
程殿林主编.微生物工程技术原理.化学工业出版社,2007.5.。