免疫学方法及其在中医研究中的应用

上海中医药大学《实验中医学》教案（7）课程名称实验中医学（理论部分）总学时数36第六节免疫学方法及其在中医研究中的应用（2学时）第一段简要介绍了中医学有关免疫学的发展历史和贡献。

第二段简要介绍了免疫学的定义、分化和与中医药继承和发展的关系。

第一句化有定义的意义：“现代免疫的概念认为免疫是识别和排除抗原性异物的过程，以维持机体的生理性平衡，在多数情况下对机体具有保护作用，如其功能发生异常，则也可发生疾病。

”第三段进一步解释免疫的功能、功能紊乱的表现和与中医药的关系：“人体免疫功能主要有三种：免疫防御功能、自身稳定功能和免疫监视功能。

”1）免疫防御功能是指机体抵抗各种病原微生物并免除毒素的毒害作用，以及抵抗各种异体抗原物质的侵袭能力，包括非特异性免疫和特异性免疫。

2）自身稳定功能指机体清除自身衰老及伤亡的细胞，以利于组织细胞更新、维持内环境平衡与稳定，亦即清除内源性抗原（类似内邪），以保生理功能的稳定性。

3）免疫监视功能是指在正常情况下，人体的T细胞能识别并杀伤体内经常出现的少量异常细胞，包括癌细胞。

第四段，阐述了章教授的观点：“正气能驱除外邪、内邪，维持人体健康，所以，免疫功能与其相似。

正气是由肾脏的先天精气、脾运化的水谷之气和肺吸入的清气构成，所以中医的肾、脾、肺三脏与免疫功能关系也较大。

”“正气与肺、脾、肾关系密切，肺、脾、肾的强弱决定正气盛衰。

根据中医理论，肾是根本，脾是化源，肺起敷布和辅助作用，就机体免疫功能而言，肾虚免疫功能损害最重，脾虚次之，肺虚又次之，若慢性病久病失治，由轻而重，也多肺→脾→肾的规律发展，从而说明了中医脏象学说与现代免疫学的联系。

”第五段讲“用免疫学方法研究中医的目的及意义”。

1）探讨有关中医理论。

虚证——免疫功能一般低下，且以细胞免疫功能较为明显；实证——免疫功能有亢进趋势，具有较大理论和实际意义。

2）阐明中医治疗机理。

一些中药能调节免疫功能：扶正固本药促进免疫功能；祛邪药抑制免疫、防治过敏反应。

今后的任务是进一步阐明其作用原理，提高疗效，并弄清其适应症（这个观点十分重要，确实是中医药研究的方向之一）。

3）发掘开发中药。

发展促进免疫或抑制免疫中药，开发产品。

4）中西医结合，发展中医学及免疫学。

（介绍了两个观点：）（1）可将中医与免疫作为中西结合的突破口。

（2）弄清正气、内邪、外邪、虚证、实证与人体免疫功能、免疫系统、抗原、免疫分子等免疫理论和实际的关系，将大大有利于中医学与免疫学的发展。

6．6．1 免疫学的主要方法介绍了几个定义：免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫测定。

（1）体液免疫测定主要利用抗原与相应抗体在体外发生特异性结合，并在一些辅助因子参与下出现反应，从而用已知抗原或抗体来测知未知抗体或抗原。

此外，尚包括检测体液中的各种可溶性免疫分子，如补体、免疫球蛋白、循环复合物、溶菌酶等。

（2）细胞免疫测定法是根据各种免疫细胞（T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨噬细胞等）表面所具有的独特标志和产生的细胞因子等，测定各种免疫细胞及其亚群的数量和功能，以帮助了解机体的细胞免疫水平。

进而介绍了其延伸的内容“免疫学检测方法的应用范围越来越广泛，包括传染病、免疫性疾病（免疫缺陷、自身免疫性疾病、变态反应、移植排斥反应）、肿瘤等领域，也可用于微量蛋白、微量分泌激素、微量药物中抗原等的测定。

中医中药的疗效及机理、某些中医证型与免疫功能的关系、开发中药时的动物实验皆可以应用免疫学方法进行研究观察。

”在介绍具体方法的时候，请大家考虑，中医药研究如何应用。

6．6．1．1 体液免疫检测法讲抗原与抗体在体外结合反应的一些基本条件，和为什么叫“血清学反应”，以及其应用领域。

1. 凝集反应。

颗粒性抗原（细菌或红细胞等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与下形成肉眼可见的凝集物，称之为凝集反应。

凝集反应的原理是：抗原与抗体均带负电荷，又皆为亲水胶体，由于同种电荷的相互排斥及其分子周围的水化膜而呈稳定的胶体溶液。

当抗原与抗体特异性结合时，相应的极性基团（羟基、氨基等）的相互吸附，破坏了水化膜，使亲水胶体变成了憎水胶体；加上存在的电解质离子会中和一部分负电荷而使抗原抗体相互凝集，形成肉眼可见的凝集物。

1）直接凝集反应。

颗粒性抗原与相应抗体直接结合所产生的凝集现象，前者多为细胞表面的结构成分，如细菌或红细胞的表面结构抗原。

（1）玻片法：多用于抗原的定性检测。

将含有已知抗体的诊断血清与待测抗原（细菌或红细胞）滴于玻片上混合并摇动，数分钟后出现肉眼可见的凝集物即为阳性反应。

此法简便快速，常用于鉴定细菌和血型。

（2）试管法：多用于抗体的定量检测。

在试管中用生理盐水将待检血清作系列倍比稀释，然后加入等量已知抗原，混匀、振荡后置37℃过夜，以观察凝集现象。

凡最高稀释度具有明显凝集现象者为该待测血清的效价（或称滴度）。

凝集效价表示血清中抗体的含量，可根据有关抗体含量高低来辅助诊断或作流行病的调查，如诊断伤寒或副伤寒的肥达氏反应。

2）间接凝集反应。

将可溶性抗原吸附于载体颗粒（如乳胶颗粒、红细胞等）的表面，称之为致敏颗粒。

当致敏颗粒与相应抗体结合，即可出现凝集现象。

这个反应常用于测定细菌性抗体、病毒性抗体、钩端螺旋体和梅毒螺旋体抗体及某些自身抗体（如抗核抗体、抗肾抗体、抗甲状腺抗体等）。

根据凝集反应的原理，还有间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验、协同凝集试验等。

2．沉淀反应。

可溶性抗原（外毒素、血清、细菌培养的滤液、组织浸出液等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与下，形成沉淀物，称为沉淀反应。

沉淀反应的抗原多为多糖、类脂、蛋白质等。

1）单向扩散试验。

这是一种抗原定量试验，是可溶性抗原在含抗体的琼脂介质中扩散的沉淀反应。

试验时，将已知抗体与融化的琼脂混匀倾注于平皿或玻片上。

琼脂凝固后打孔，孔内加入待检抗原，置湿盒于室温使其扩散，次日观察结果。

由于抗体均匀地分布于琼脂内，抗原从孔中向四周扩散，抗原抗体复合物在孔周围形成沉淀环。

沉淀环的直径与孔中抗原浓度成正比。

如事先用不同浓度的已知标准抗原作单向琼脂扩散，并绘制成抗原浓度与沉淀环直径的标准曲线，则可根据待检抗原孔的沉淀环直径从标准曲线查明其抗原含量。

此法常用于检测血清免疫球蛋白和补体各成分的含量。

2）双向扩散试验。

这是可溶性抗原与抗体在琼脂介质中相互扩散的沉淀反应。

将融化的琼脂倾注于平皿或玻片上，琼脂凝固后打孔，抗原、抗体分别注入孔内，置湿盒内室温过夜。

如抗原与抗体相对应，两者相互扩散可在抗原、抗体孔间呈现清晰的白色沉淀线，一对抗原与抗体只形成一条沉淀线，几对抗原与抗体则形成几条沉淀线。

本法常用于定性试验，如检测血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。

3）对流免疫电泳。

对流电泳是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。

在用pH 8.6 巴比妥缓冲液配制的琼脂板上挖出成对且平行的小孔，将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的白色沉淀线。

只需1小时左右即可观察结果。

此法常用于检测血清中的乙型肝炎表面抗原与甲胎蛋白等。

3．中和试验。

特异性抗体可抑制相应抗原物质的活性，抗体使相应抗原的毒性或传染性消失的反应为中和试验。

例如抗毒素中和外毒素的毒性，病毒的中和抗体可使病毒失去感染性等。

诊断风湿热的抗链球菌溶血毒素“O”试验也为一种中和试验。

乙型溶血性链球菌能产生一种溶解人、兔红细胞的溶血毒素“O”，该毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素“O”抗体所中和而不出现溶血。

试验时将病人血清与溶血毒素“O”混合，作用一段时间后加入人红细胞，红细胞不被溶解为阳性反应，表示病人血清中存在抗溶血毒素“O”抗体。

血清抗体效价达400单位以上时提示患者曾感染乙型溶血性链球菌，有助于风湿热的诊断。

4. 免疫荧光法（荧光抗体法）。

是应用荧光素染料（如异硫氰酸荧光黄等）来标记抗体，但不影响其活性，此种抗体称荧光抗体。

用已知种类的荧光抗体浸染待检的含有抗原的细胞或组织切片，如有相应抗原存在，则抗原即与此种抗体发生特异性结合，形成复合物而粘着在细胞上，不易洗脱，在荧光显微镜下成为发出荧光的可见物，可达到诊断或定位的目的。

1）直接法。

将已知种类的荧光抗体加到待检标本上，作用半小时后，用缓冲液冲洗，将未结合的荧光抗体全部洗去，干燥后在荧光显微镜下观察，如发现荧光表明标本中有相应抗原存在，是为阳性。

此法的优点是特异性高，可应用于早期检查病原，如细菌、病毒等，缺点是每检查一种抗原，必须制备与其相应的荧光抗体。

2）间接法。

先使未标记的已知抗体与待检抗原作用，如待检抗原与已知抗体相对应，即发生特异性结合成复合物，再加入荧光标记的抗免疫球蛋白（或称抗抗体，能与抗体结合），由于抗抗体与抗原抗体复合物中的抗体相结合，在荧光显微镜下即能见到荧光，是为阳性。

5．酶联免疫吸附试验。

本法的原理是利用酶（常用辣根过氧化物酶）标记的抗原或抗体，以测定被检标本中有无相应的抗原或抗体。

有间接法、双抗体法、竞争法三种。

现以间接法为例，简述其检测血清中抗体的基本过程。

1）使已知可溶性抗原吸附于固相载体（聚苯乙烯板凹孔、聚苯乙烯管等）上，孵育后冲洗去未吸附的抗原；2）加待检血清并孵育，若血清中含有相应抗体，即与吸附的抗原结合，再行冲洗，去除未被结合的抗体；3）加入酶标记抗球蛋白（抗抗体），使之与抗原抗体复合物上的抗体相结合，再洗涤去除未吸附的酶标记抗球蛋白；4）加入酶作用底物（二氨基联苯胺，DAB），酶即能分解底物并显色，用分光光度计检测其显色程度。

颜色的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。

6．溶血空斑试验。

详见7.13实验的论述。

7．免疫印迹技术。

免疫印迹或免疫转印技术（immunoblotting或Western blot）是在Southern（1975）创建的DNA印迹术（Southern blotting）基础上发展起来的新型免疫生化技术。

其原理是应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白质样品分离后，通过转移电泳或直接印渍方式原位转印至固相介质上，并保持其原有的物质类型和生物学活性不变，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测。

由于此项技术具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高度特异性和敏感性，方法简便易行，标本可以长期保存和便于比较等优点。

因此，问世十多年来经过不断改进，已广泛应用于生物学和医学领域，成为免疫学、微生物学及其它生命科学常用的一种重要研究方法。

6．6．1．2 细胞免疫检测法近代免疫学广泛采用了细胞生物学、免疫血清学、免疫标记、免疫组化等多方面技术，不断发展和完善了一系列细胞免疫检测技术，用于检测各类免疫细胞的表面标志（包括抗原及受体）、细胞的活化、增殖、吞噬、杀伤功能、各种细胞因子的活性或含量等方面。