大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺修订稿
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编 码序列与大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法,所产生的融合型 重组蛋白表达率高、稳定性强,但不能分泌,只要以包涵体的形式 存在于胞质中。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰 岛素或胰岛素原编码序列与b-內酰胺酶基因拼接,b-內酰胺酶通常 能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备了稳定高效 表达可分泌型融合蛋白的优良特性,为胰岛素的后续分离纯化工序 减轻了负担。
确配对率较低,通常只有10% - 20%,因此采用这条工艺路线生 产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。
为了进一步降低生产成本,美国Ely LiLi公司随后又建立了第 二条生产重组人胰岛素的工艺路线。
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略:
tac Met
Apr ori
人胰岛素的生产方法
化学转型法制人胰岛素
猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得,而且猪胰岛素 与人胰岛素只在B链的C末端有一个氨基酸的差异,猪的为Ala,人 的为Thr,因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种 选择。
上述思路的技术路线是:在pH为6-7的有机相中使胰蛋白酶催 化其逆反应,该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下,将猪胰岛素B 链C末端的丙氨酸交换下来,所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙 酸脱去叔丁酯基团,最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为60% 但工艺路线耗时,分离纯化操作复杂,产品的价格不菲。
目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。
重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A链和B链同时表达法
tac Met
转化
b-Gal
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
《基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究》一、引言基因工程技术的发展为生物医药领域带来了革命性的变革,其中重组DNA 技术作为一种能够改变生物体基因组的技术,为生产重组蛋白素(包括重组人胰岛素)提供了可行性。
本文将从深度和广度两个方面来探讨基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究。
二、基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的原理在基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究中,首先需要获取重组人胰岛素的基因序列,然后以质粒或病毒为载体将其转染至大肠杆菌的体内,经过培养和发酵,大肠杆菌体内合成重组人胰岛素,并通过纯化后得到最终的产品。
三、基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究进展1. 基因克隆技术的应用基因克隆技术的应用是基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的关键技术之一。
利用限制酶切剪切 DNA,然后重组连接,将重组的DNA 导入质粒内,再将质粒导入大肠杆菌细胞内,实现外源基因的表达。
2. 基因工程大肠杆菌的选择为了高效地生产重组人胰岛素,研究者需要筛选高产重组蛋白素的大肠杆菌菌株,并进行相关的改造以提高其产量。
3. 发酵工艺的优化发酵工艺的优化对于提高重组人胰岛素的产量至关重要。
包括对培养基成分、厌氧发酵条件、发酵时间等因素的优化。
四、基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的意义基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素具有重要的生物医药意义。
大肠杆菌是一种广泛存在于自然界中的细菌,其发酵生产成本低、抗污染能力强,适用于大规模工业化生产。
另重组人胰岛素与天然胰岛素具有相同的生物活性,可以作为治疗糖尿病的药物,在临床上有着重要的应用前景。
五、个人观点和理解基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究是基因工程技术的一个重要应用方向,其有着较高的生产效率和较低的成本,为生物医药领域带来了巨大的潜力和机遇。
但是,需要注意的是,基因工程技术在应用过程中也存在一些伦理和社会问题,例如生物安全性、环境影响等方面,需要引起足够的重视。
用大肠杆菌生产人胰岛素的工艺流程
用大肠杆菌生产人胰岛素的工艺流程英文回答:The process of producing human insulin using E. coli involves several key steps in the bioprocessing industry.Firstly, the gene encoding human insulin is inserted into the E. coli bacterial genome. This is typically achieved using recombinant DNA technology, where the gene is cloned into a plasmid vector and then introduced into the bacterial cells.Next, the transformed E. coli cells are cultured in a bioreactor under controlled conditions. This includes providing the necessary nutrients for cell growth and maintaining optimal temperature, pH, and oxygen levels.As the E. coli cells grow and divide, they express the human insulin gene and produce the insulin protein. The protein is then harvested from the cells using variousextraction and purification techniques.Finally, the purified human insulin is formulated into the final product, which can be in the form of injectable solutions or insulin pens for diabetes treatment.This process allows for the large-scale production of human insulin using E. coli as a host organism.中文回答:利用大肠杆菌生产人胰岛素的工艺流程涉及生物加工行业的几个关键步骤。
重组人胰岛素制备工艺
重组人胰岛素制备工艺引言胰岛素是一种由胰腺β细胞分泌的激素,它参与调节葡萄糖代谢,维持血糖水平稳定。
然而,对于许多糖尿病患者,体内胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗使得血糖控制成为难题。
为了解决这一问题,重组人胰岛素制备工艺应运而生。
本文将详细介绍重组人胰岛素的制备工艺,以及如何通过优化制备工艺提高其产量和质量。
关键词介绍1、重组人胰岛素:是指利用基因工程技术,通过细胞培养或微生物发酵生产的胰岛素。
它具有与天然人胰岛素相同的结构和功能,因此在临床上有广泛的应用。
2、制备:是指通过一系列工艺步骤,从原料中提取或制造出所需物质的过程。
在重组人胰岛素制备中,主要包括基因工程操作、细胞培养、发酵、分离和精制等步骤。
3、工艺:是指实现制备过程的一系列具体方法和操作规程。
工艺的选择和优化直接影响到产品的产量和质量。
重组人胰岛素制备工艺1、酵母菌的筛选:选用适合生产重组人胰岛素的酵母菌种,对其进行筛选和改良,以提高发酵过程中的产量。
2、基因工程操作:将人胰岛素基因插入到酵母菌的染色体或质粒中,确保基因正确表达。
3、发酵:在适宜的营养条件下,利用筛选得到的酵母菌进行发酵生产。
4、分离和精制:通过一系列物理、化学和生物学方法,将重组人胰岛素从发酵液中分离出来,并进行精制和纯化,以得到高纯度的产品。
制备工艺优化1、通过现代实验设计方法和技术,如响应面法和均匀设计法,筛选最佳工艺条件,以提高重组人胰岛素的产量和质量。
2、通过基因工程技术改良酵母菌,增强其生产重组人胰岛素的能力,提高产量。
3、采用先进的分离和精制技术,如高效液相色谱和超滤膜过滤等,进一步提纯产品,提高产品质量。
4、结合计算机模拟技术和实验验证,模拟工艺过程,指导实际生产,优化制备工艺。
重组人胰岛素制备工艺在糖尿病治疗中具有重要意义,本文详细介绍了其制备过程及优化方法。
通过合理选择工艺条件和基因工程改良,可以有效提高重组人胰岛素的产量和质量。
随着科学技术的发展,相信未来制备工艺将进一步优化,为糖尿病患者提供更好的治疗选择。
重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化
重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化一、本文概述本文旨在探讨重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达及其后续的分离纯化过程。
胰岛素作为一种关键的激素,在调节血糖水平中发挥着至关重要的作用。
然而,天然胰岛素的来源有限,且提取成本高昂,因此,通过基因工程技术在大肠杆菌中生产重组人胰岛素成为了一种可行且经济的替代方案。
本文首先介绍了重组人胰岛素的基因克隆和在大肠杆菌中的表达策略,然后详细阐述了胰岛素的分离纯化过程,包括细胞的破碎、蛋白质的提取、层析分离以及胰岛素的纯化等步骤。
本文还讨论了影响胰岛素表达及纯化的关键因素,并提出了优化表达及纯化条件的策略,以期提高重组人胰岛素的产量和纯度,为糖尿病治疗提供更为可靠和经济的药物来源。
二、重组人胰岛素的基因克隆与表达重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达首先依赖于对胰岛素基因的克隆。
基因克隆是生物技术中一项重要的技术,它涉及到从基因组DNA或cDNA中分离出特定的基因,然后将其插入到适当的载体中,以便在大肠杆菌等宿主细胞中进行复制和表达。
目的基因的获取:需要从人源的cDNA文库或基因组DNA中扩增出胰岛素的编码序列。
这通常通过PCR技术实现,需要设计一对特定的引物,它们能够与人胰岛素基因的两端互补结合。
载体的选择:为了在大肠杆菌中表达人胰岛素,需要选择一个合适的表达载体。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
这些载体通常含有启动子、终止子、复制原点和选择标记等元件,以确保目的基因在宿主细胞中的高效表达。
基因的克隆:将目的基因与载体连接后,通过转化技术将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞中。
在适当的选择压力下,例如抗生素抗性,只有成功导入重组质粒的细胞才能生长,从而实现了对胰岛素基因的克隆。
表达条件的优化:在大肠杆菌中表达人胰岛素时,需要优化表达条件以获得最高的表达量。
这包括选择合适的培养基、调整培养温度、pH值以及诱导剂的浓度等。
表达产物的分析:通过SDS-PAGE、Western Blot等技术,可以对表达产物进行定性和定量分析,以确认胰岛素基因在大肠杆菌中的成功表达。
大肠杆菌制备胰岛备工艺流程
大肠杆菌制备胰岛备工艺流程
以下是利用大肠杆菌生产胰岛素的工艺流程:
1. 提取目的基因:从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。
2. 提取质粒:使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。
3. 基因重组:取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”,形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。
4. 将质粒送回大肠杆菌:再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因。
此时将重组的质粒也放入培养液中,大
肠杆菌便会将重组质粒吸收。
5. 胰岛素的产生:在再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质。
通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素。
以上步骤仅供参考,如果想要了解更多关于大肠杆菌制备胰岛素的工艺流程,建议咨询专业人士获取帮助。
重组大肠杆菌生产胰岛素发酵车间设计
重组大肠杆菌生产胰岛素发酵车间设计胰岛素是一种重要的药物,用于治疗糖尿病等疾病。
由于胰岛素的需求量大且持续增长,传统的化学合成方法已经无法满足市场需求。
因此,利用重组DNA技术在大肠杆菌中大规模生产胰岛素成为了一种可行的方法。
本文将以重组大肠杆菌生产胰岛素发酵车间的设计为主题,探讨其技术原理和实施方案。
1. 胰岛素的重组大肠杆菌生产原理胰岛素是由胰岛素原经过酶切割和修饰而成的肽激素。
重组大肠杆菌生产胰岛素的基本原理是将人类胰岛素基因导入大肠杆菌中,并利用大肠杆菌的遗传机制使其表达和合成胰岛素。
具体步骤包括:将人类胰岛素基因插入大肠杆菌的表达载体中,将重组载体导入大肠杆菌细胞中,利用诱导剂促使胰岛素基因表达,并通过细胞内的代谢途径合成胰岛素。
2. 设计思路和工艺流程(1)菌种选择:选择表达胰岛素基因能力强、产量高的大肠杆菌菌株作为生产菌种。
同时,还需考虑菌株的稳定性和生长特性。
(2)基因导入:将人类胰岛素基因插入表达载体中,通过转化或质粒转染将重组载体导入大肠杆菌细胞中。
(3)发酵条件优化:通过对发酵条件的优化,如温度、pH值、营养物质等的调节,提高胰岛素的产量和纯度。
(4)胰岛素提取和纯化:利用离心、过滤、层析等技术,对发酵液进行胰岛素的提取和纯化,以获得高纯度的胰岛素产品。
(5)产品检测和质量控制:通过高效液相色谱、质谱等技术对胰岛素产品进行质量检测和控制,确保产品的安全性和有效性。
3. 生产车间的设计要点(1)洁净区域设计:胰岛素是一种高效药物,对生产环境的洁净度要求较高。
车间应设计有洁净区域,采用空气过滤设备、无菌操作台等,以确保生产过程的洁净度。
(2)发酵设备选择:选择适合大规模发酵的生物反应器,考虑到胰岛素的特性,应选择能提供充足气体供应、温度控制和搅拌均匀的设备。
(3)废液处理系统:胰岛素生产过程中会产生大量废液,其中含有高浓度的有机物质。
应设计合理的废液处理系统,采用生物处理、蒸发浓缩等技术,以降低环境污染。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
参考内容
引言
人胰岛素是一种重要的生物药物,对于治疗糖尿病具有显著效果。传统上,人 胰岛素的生产主要通过从人身体中提取胰岛素原,然后进行化学合成和结构改 造。然而,这种方法不仅成本高昂,而且生产周期长,难以满足市场需求。近 年来,随着生物技术的发展,利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法逐渐得到 广泛应用。本次演示将详细介绍利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的方法和相关 技术。
展望未来,基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究有望为糖尿病治疗 提供更加安全、有效的药物。随着科学技术的不断进步和研究的深入,我们相 信未来能够在提高产量、降低成本、优化质量等方面取得更大的突破。加强与 其他领域(如纳米技术、生物信息学等)的跨学科合作,将为该领域的研究和 应用提供更为广阔的前景。
生产流程
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素的生产流程包括以下几个步骤:
1、细胞悬浮:将大肠杆菌接种到发酵罐中的无菌培养基中,在适宜的温度和 湿度条件下进行培养。培养过程中需监测细菌生长情况,以确保细菌处于最佳 生长状态。
2、发酵:当细菌生长到一定密度时,向发酵罐中加入适量的诱导剂,以诱导 细菌表达人胰岛素基因。发酵过程中需控制温度、湿度、氧气浓度等参数,以 确保细菌正常表达胰岛素基因。
一、背景介绍
基因工程技术是一种利用微生物或细胞体系生产人类所需蛋白质的技术。在过 去几十年中,基因工程技术得到了广泛应用,并在制药、生物能源、环境保护 等领域发挥了重要作用。重组人胰岛素是一种利用基因工程技术生产的胰岛素, 它与人体产生的胰岛素具有相似的结构和功能。然而,重组人胰岛素的生产过 程比较复杂,需要经过多个步骤,因此生产成本较高。
3、收集:发酵结束后,收集细菌培养液并进行过滤,以去除其中的杂质和细 胞残骸。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的
研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究是利用基因工程
技术将人类胰岛素基因导入大肠杆菌细胞中,并使其表达和分泌人类
胰岛素。
研究的具体步骤如下:
1. 克隆:将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌中的表达载体上,构建重
组胰岛素的基因工程菌株。
2. 表达:将重组胰岛素基因工程菌株进行培养和诱导表达,启动胰岛
素基因的转录和翻译,使其合成胰岛素多肽链。
3. 折叠:由于胰岛素中存在多肽链的结构,其需要正确折叠形成活性
结构。
通过培养条件的调控和辅助分泌蛋白的表达帮助胰岛素多肽链
正确折叠。
4. 分泌:经过折叠的胰岛素多肽链进入细胞分泌途径,通过胞外酶切,胰岛素分泌至外部培养液中。
5. 纯化:将培养液中的胰岛素进行纯化,去除其他杂质,得到纯度较
高的重组人胰岛素。
这种方法相比其他表达系统有以下优势:
1. 大肠杆菌生长快速且易于培养,并且具有可高效表达外源基因的能力。
2. 人类胰岛素的基因序列已经大量研究,其表达也相对成熟和稳定。
3. 大肠杆菌发酵工艺相对简单,易于工业化生产。
4. 经过纯化的重组胰岛素具有较高的活性和纯度,适用于临床应用。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典]
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典] 基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的工艺一,背景知识1,基因工程科技名词定义中文名称:基因工程英文名称:genetic engineering;gene engineering其他名称:重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA technique) 定义1:狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计,通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DNA技术,将外源基因转入大肠杆菌中表达,使大肠杆菌能够生产人所需要的产品;将外源基因转入动物,构建具有新遗传特性的转基因动物;用基因敲除手段,获得有遗传缺陷的动物等。
定义2:将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术。
扩充:基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有:(1)外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。
这一部分的工作是整个基因工程的基础,因此又称为基因工程的上游部分;(2)适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组;(3)外源基因的导入;(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选;(5)外源基因表达产物的生理功能的核实;(6)转基因新品系的选育和建立,以及转基因新品系的效益分析;(7)生态与进化安全保障机制的建立;(8)消费安全评价。
基本操作步骤(上游技术)提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因,种子的贮藏蛋白的基因,以及人的胰岛素基因干扰素基因等,都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因,是十分不易的。
重组人胰岛素生产工艺
3D Structure of Insulin 胰岛素二聚体(dimer) 胰岛素六聚体(hexamer )
胰岛素的性质
胰岛素的功能 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素,也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。 药理作用 治疗糖尿病、消耗性疾病。
胰岛素的研究历史 1921年----从动物胰腺中提取出胰岛素,开创了人类胰岛素治疗的历史。 1926年----重结晶胰岛素 1930s----传统中、长效动物胰岛素 1970s----单峰胰岛素和 单组分胰岛素 70年代末----半合成胰岛素 1982年----采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。 90年代至今----重组人胰岛素类似物成功研发上市,包括超短效和长效人胰岛素类似物。
03
结构: 胰岛素由A、B两个肽链组成。A链有11种21个氨基酸,B链有15种30个氨基酸,共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键,使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。
人工合成法:根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列,然后人工合成,没有内含子。从基因中提取:也就是事先已经提取完毕的拿来用
PCR扩增技术:用于大量生产该段基因片段,用于商业化运作……
03
02
01
提取质粒:使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。主要有如下2种方法:
转化大肠杆菌
PCR
连接
胰岛素原
活性胰岛素
二硫键
酶切
提取质粒 限制性内切酶酶切
重组胰岛素的质量控制
测定生物活性
1
效价测定
大肠杆菌生产人胰岛素
大肠杆菌生产人胰岛素基因工程自诞生以来发展很快。
1972年,美国斯坦福大学生物化学系主任贝格尔把两种病毒的DNA人工组合到一起,形成了第一个人工重组DNA分子,这是基因工程的开创性工作。
1973年,科恩发表一篇报告,说他们把大肠杆菌的两种质粒的DNA连接到了一起,并且又送回到大肠杆菌细胞中去,重组质粒的DNA得到了复制和表达。
这是第一次完成了一个基因工程。
1976年,美国用大肠杆菌生产出了本来由人脑产生的生长抑制素,完成第一个有实用价值的基因工程。
已知生长抑制素是含有14个氨基酸的多肽链,在清楚其结构以后,根据遗传密码可以倒推出它的基因结构——一条由42个核苷酸组成的DNA片断。
人工合成这个DNA片断,再把它送入大肠杆菌。
由这项研究开始,科学家又掌握了一条获得基因的新途径——人工合成。
使用类似方法,美国人在1978年又用大肠杆菌生产出了胰岛素,使胰岛素可以工业化生产,给糖尿病患者带来了福音。
原先胰岛素的来源是从牛胰脏提取,产量有限。
用化学方法人工合成胰岛素仅有科学意义而无实用价值,因为成本太高了。
现在世界医药市场上的胰岛素,已经大半是基因工程的产品了。
鼠生长激素、人生长激素、鸡卵清蛋白、人白细胞干扰素等许多种物质,也都已经可以用大肠杆菌生产。
生物制法:首先剪切胰岛素基因,再将胰岛素基因转入人的大肠杆菌内,再创造大肠杆菌裂殖的有利环境,对大肠杆菌进行大规模培养,使之产生大量的治疗糖尿病的药物——胰岛素。
基因制法: 在基因工程人胰岛素的生产过程中,一般是先表达胰岛素原,然后对胰岛素原复性,复性后的胰岛素原通过酶切得到有活性的胰岛素.其中胰岛素原的复性效率是决定最终收率的关键因素,正确折叠与错误折益胰岛素原的分子量完全相同,结构非常相似,采用RT-HPLC可对其进行分离检定.Sergeev等利用反相色谱建立了复性液中胰岛素原的检测方法.如果要对正确折叠与错误折盛胰岛素原的结构进一步说明,可将其用蛋白酶V8酶解,然后用RP-HPLC-MS作肤图谱.Damn等用S.aureus protease V8酶解胰岛素原,然后用R'FHPLC做肚谱图,并结合质谱法对重组胰岛素原的折受过程进行了监测.新胰岛素工艺提升市场超15% 行业格局将变(2009-05-22 10:57:54)糖尿病在过去十年里在全球各地发展势头十分迅猛,现在中国、印度、巴西和俄罗斯等新兴工业国也已迈入糖尿病高发国行列。
大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺
1.提取目的基因:既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离.2.提取质粒:使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA.3.基因重组:取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒.4.将质粒送回大肠杆菌:再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收.5.胰岛素的产生:再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理;掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求;学会DNA分子的鉴定方法【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论,完成下列问题,并初步巩固。
一、基础知识【活动1】阅读教材P54“基础知识”,讨论并回答下列问题:1.(记忆)提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。
2.(记忆)DNA的溶解性特点:DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。
【思考1】据图5-1分析:DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点?在0.14mol/L时溶解度最小;要使DNA溶解,需要使用什么浓度?较高浓度,可使DNA溶解;要使DNA析出,又需要使用什么浓度?0.14mol/L可使DNA析出。
【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理,可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。
3.(记忆)DNA的耐受性特点:蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA;在60~80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。
洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。
4.(记忆)DNA的鉴定原理当鉴定提取出的物质是否是DNA时,需要使用二苯胺(甲基绿)进行鉴定。
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究一、概述基因工程是一种革命性的生物技术,它允许科学家在分子水平上对生物体进行精确的操控和改造。
自从20世纪70年代基因工程技术诞生以来,它已广泛应用于医药、农业、工业等领域,为解决人类面临的诸多挑战提供了新的途径。
利用基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素是基因工程在医药领域的一个重要应用。
重组人胰岛素是一种通过基因工程技术生产的人胰岛素类似物,具有与天然人胰岛素相似的生物活性。
它主要用于治疗糖尿病等代谢性疾病,具有广阔的市场前景和重要的社会价值。
与传统的动物源胰岛素相比,重组人胰岛素具有纯度高、稳定性好、免疫原性低等优点,因此备受关注。
在大肠杆菌中发酵生产重组人胰岛素的过程涉及多个关键步骤,包括基因克隆、表达载体的构建、宿主细胞的选择、发酵条件的优化等。
通过这些步骤,可以实现重组人胰岛素的高效表达和分泌,从而生产出符合治疗要求的胰岛素产品。
本文旨在探讨基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究进展、技术原理、工艺优化以及未来的发展趋势。
通过深入了解这一领域的研究现状,可以为重组人胰岛素的生产提供理论支持和实践指导,进一步推动基因工程技术在医药领域的应用和发展。
1. 重组人胰岛素的重要性和应用背景重组人胰岛素,作为一种生物技术产品,在医学领域具有极其重要的地位。
它是通过基因工程技术,将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌等微生物体内,使其能够生产与人体胰岛素功能相似的胰岛素。
这种胰岛素在治疗糖尿病方面发挥着至关重要的作用。
糖尿病是一种全球性的健康问题,影响着数以亿计的人口。
根据国际糖尿病联盟(IDF)的数据,全球约有62亿成年人患有糖尿病,预计到2045年这一数字将增至7亿。
糖尿病的治疗需要长期使用胰岛素,而重组人胰岛素因其与人体胰岛素的高度相似性,成为糖尿病治疗的首选药物。
重组人胰岛素的应用背景源于对胰岛素需求的不断增长。
在重组人胰岛素出现之前,糖尿病患者主要依赖从猪或牛体内提取的胰岛素进行治疗。
重组人类胰岛素制备工艺研究
重组人类胰岛素制备工艺研究人类胰岛素是治疗糖尿病的重要药物,自20世纪初被发现以来就一直受到广泛的关注。
随着现代生物技术的发展,利用重组DNA技术生产人类胰岛素已成为最主要、最经济的方法。
本文将就重组人类胰岛素制备工艺进行探讨。
一、重组人类胰岛素是什么人类胰岛素是由胰岛细胞产生的多肽激素,主要调节葡萄糖在体内的代谢。
结构上,它包括两个多肽链,A链和B链,它们由21个和30个氨基酸组成,而这些氨基酸的顺序是非常特定的。
重组人类胰岛素是通过将人类胰岛素的DNA序列插入到细菌或酵母等生物的DNA中,利用这些生物基因表达和生产人类胰岛素的蛋白质,达到生产大量纯度极高的人类胰岛素的目的。
这是一种完全体外合成人类胰岛素方法。
二、生产重组人类胰岛素的主要工艺流程生产重组人类胰岛素的主要工艺流程包括基因克隆、重组体表达、糖链修饰、纯化和结构鉴定等步骤。
1. 基因克隆生产重组人类胰岛素的第一步是从人类胰岛素基因库中选取A、B链基因、基因交链片段、启动子、终止子和选择反抗性基因等。
然后,在体外进行重组,使这些片段组合在一起,形成完整的胰岛素基因。
接下来,将这个基因克隆到表达载体上,以便细胞可以识别和表达它。
2. 重组体表达一旦重组表达载体被构建,便可以将其转化到大肠杆菌等生物中。
接着,这些生物被培养在液体培养基或固体培养基中,以促进基因表达和胰岛素蛋白合成。
重组人类胰岛素的产生需要大量的细胞培养,通常使用发酵罐、生物反应器和其他相关设备。
3. 糖链修饰胰岛素的生物活性取决于胰岛素蛋白中的糖链修饰。
然而,大肠杆菌在自然生态中并不会进行糖基化修饰,获取的表达产品如此也是裸露的蛋白链体,无法发挥生物活性。
为了获得具有生物活性的重组人类胰岛素,需要对其进行糖链修饰。
这个过程需要进行歧化和酶法处理,以检查和修改粘附到胰岛素蛋白上的糖基。
糖链修饰的最终产品可以具有各种形式的糖基链。
4. 纯化重组人类胰岛素是在细胞内产生的,因此需要进行后期精细纯化。
重组人胰岛素原料药生产实验报告
重组人胰岛素原料药生产实验报告一、引言胰岛素是一种重要的药物,用于治疗糖尿病等疾病。
重组人胰岛素是指通过基因工程技术生产的胰岛素,与传统的动物源性胰岛素相比,具有更高的纯度和更好的效果。
本报告旨在介绍重组人胰岛素原料药生产实验的过程和结果。
二、实验设计1. 实验目的本实验旨在通过大肠杆菌表达系统生产重组人胰岛素原料药,并对其进行纯化和鉴定。
2. 实验步骤(1)构建表达载体:将人胰岛素基因插入大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中。
(2)转化大肠杆菌:将表达载体导入大肠杆菌中,使其能够表达人胰岛素基因。
(3)培养大肠杆菌:在LB培养基中进行培养,使其能够表达出人胰岛素。
(4)收集细菌:将细菌离心收集,并用冷冻离心法裂解细胞获得包含目标蛋白的上清液。
(5)纯化目标蛋白:通过离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对上清液进行纯化。
(6)鉴定目标蛋白:通过SDS-PAGE电泳、Western blot等方法对纯化后的目标蛋白进行鉴定。
三、实验结果1. 表达载体构建将人胰岛素基因插入pET-28a(+)表达载体中,经PCR扩增和酶切,得到正确的表达载体。
2. 转化大肠杆菌将表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用热激法转化。
经PCR检测和测序验证,转化效率较高。
3. 大肠杆菌培养在LB培养基中进行培养,经过16小时的培养后,细菌进入对数生长期。
经过4小时的诱导,大肠杆菌开始表达人胰岛素基因。
4. 目标蛋白纯化通过离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对上清液进行纯化。
最终得到了高纯度的重组人胰岛素原料药。
5. 目标蛋白鉴定通过SDS-PAGE电泳、Western blot等方法对纯化后的目标蛋白进行鉴定。
结果表明,纯化后的目标蛋白具有正确的分子量和免疫反应性。
四、实验讨论本实验通过大肠杆菌表达系统成功生产了重组人胰岛素原料药,并对其进行了纯化和鉴定。
其中,表达载体构建和大肠杆菌转化是实验的关键步骤,需要严格控制条件以确保表达效率和转化效率。
用大肠杆菌生产人胰岛素的工艺流程
用大肠杆菌生产人胰岛素的工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成,希望大家下载以后,能够帮助大家解决实际的问题。
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从大肠杆菌获得重组胰岛素原的高通量筛选与工艺开发
应用说明文档28-9966-22 AA 开发开发从大肠杆菌获得重组胰岛素原的高通量筛选与工艺开发本“应用指南”描述了在大肠杆菌中表达的重组胰岛素原从PreDictor™板筛选到400 mL中试级的完整纯化工艺开发流程。
采用PreDictor 96孔预装过滤板、Assist软件和装填了1 mL填料的Tricorn™ 5/50层析柱来探索捕获阶段的最佳条件。
高通量筛选迅速减少了候选层析填料的类型,并为进一步研究所需的结合及洗脱条件提供了建议。
当捕获阶段条件经过进一步优化和验证后,纯化规模被扩大400倍。
放大平稳且可预测,最终目标产物的回收率和纯度分别达到96%和82%。
此外,与柱层析法相比较,PreDictor板的筛选还节省了相当多的时间和样品。
第二项研究(1)描述了胰岛素原经酶解获得的胰岛素的中度纯类似工艺流程。
引言在工艺开发过程中引入高通量方法能提高效率。
减少下游纯化开发步骤所需的时间和样品用量,就可使收益有所提高。
如今,GE Healthcare Life Sciences提供了多种产品来提升工艺开发的效率。
PreDictor 96孔板(预装填BioProcess™层析填料)适用于纯化条件和填料的高效、高通量初次筛选。
Assist软件简化了实验设置以及数据管理和评估的过程。
筛选设定的条件随后可用HiTrap™或HiScreen™预装层析柱进行验证和优化。
带有缓冲液制备和DoE(实验设计)支持功能的AKTA™ avant 25层析系统,简化了在层析柱上的优化,并可通过如HiScale™16/40的层析柱,将工艺放大到中试级水平。
采用AKTA avant 150系统和AxiChrom™层析柱,规模还可进一步的放大。
B链A链C肽图1.胰岛素原分子简图本应指南描述了通用电气医疗集团的工艺开发平台,目的是探索一种捕获重组胰岛素原的稳健方法(图1)。
PreDictor板和Assist软件用于确定适用于捕获阶段的层析填料类型及可能的结合和洗脱条件(2)。
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大肠杆菌生产制备重组
人胰岛素工艺
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1.提取:
2.既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将从原DNA中分离.
3.2.提取质粒:
4.使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA.
5.3.基因重组:
6.取出与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒.
7.4.将质粒送回大肠杆菌:
8.再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将吸收.
9.5.胰岛素的产生:
10.再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!
〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理;掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求;学会DNA分子的鉴定方法
【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论,完成下列问题,并初步巩固。
一、基础知识
【活动1】阅读教材P54“基础知识”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。
2.(记忆)DNA的溶解性特点:
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。
【思考1】据图5-1分析:
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点?在L时溶解度最小;
要使DNA溶解,需要使用什么浓度?较高浓度,可使DNA溶解;
要使DNA析出,又需要使用什么浓度?L可使DNA析出。
【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理,可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。
3.(记忆)DNA的耐受性特点:
蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA;在60~80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。
洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。
4.(记忆)DNA的鉴定原理
当鉴定提取出的物质是否是DNA时,需要使用二苯胺(甲基绿)进行鉴定。
在沸水浴条件下,该试剂与DNA反应,呈现(浅)蓝色。
二、实验设计
【活动2】阅读教材P55“实验设计”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)实验材料的选取:选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
【思考3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取DNA。
2.(记忆)破碎细胞,获取含DNA的滤液:
鸡血:向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌,用纱布过滤后,收集滤液。
洋葱:向研钵中加入一定量洗涤剂和食盐,搅拌研磨,用纱布过滤后,收集滤液。
【思考4】在以上实验中,蒸馏水的作用是使血细胞大量吸水而胀裂,洗涤剂的作用是瓦解细胞膜,食盐的作用是溶解DNA物质。
3.(学会)去除滤液中的杂质:
方案一:30mL滤液→加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液→加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解→DNA-NaCl溶解
液
方案二:30mL滤液→加嫩肉粉(木瓜蛋白酶)→静置10分钟→得DNA滤液
方案三:30mL滤液→60~67℃处理→过滤得DNA滤液
【思考5】以上三个方案的原理分别是什么?
方案一原理:DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;
方案二原理:蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;
方案三原理:DNA耐高温而蛋白质不耐高温。
【思考6】方案一中:“加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液”的目的是除去不溶(可溶、不溶)于NaCl溶液中的细胞杂质;“加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物”的目的是除去可溶(可溶、不溶)于NaCl溶液中的细胞杂质。
4.(记忆)DNA的析出:
DNA滤液与等体积冷却酒精混合,静置一段时间后析出的白色丝状物就是DNA。
5.(记忆)DNA的鉴定:
取2支洁净的试管,编号甲、乙,各加入等量的2mol/L NaCl溶液。
甲中放入少量白色丝状物,使之溶解。
在甲、乙试管中各加4mL二苯胺,混合均匀。
沸水浴5min,观察颜色变化,甲试管呈现蓝色。
三、操作提示
【活动3】(记忆)阅读教材P56“操作提示”和P57“课题延伸”,关注下列注意事项:
1.在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固;鸡血静置或离心后除去血浆,以提高细胞悬液浓度。
2.实验中使用塑料烧杯和尼龙布,以免DNA被吸附。
3.玻棒沿同一方向缓慢搅拌(细胞破裂时快速搅拌),玻棒不要碰到烧杯壁。
4.二苯胺试剂要现用现配。
5.为提高DNA纯度,实验中通常使用的洗涤剂有CTAB、SDS等。
【活动4】观看视频:观看“DNA的粗提取与鉴定”视频,体会并学会相关技术方法。
〖课后学习〗
1.尝试从植物组织中提取DNA分子。
2.基础训练册:将基础知识整理到作业本上;完成该节训练题。
〖学习要求〗
尝试PCR技术的基本操作,体验PCR技术的分子生物学实验方法;理解PCR技术的原理;讨论PCR技术的应用
【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论,完成下列问题,并初步巩固。
一、基础知识
【活动1】阅读教材P58“PCR原理”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)PCR技术扩增DNA的过程与细胞内的DNA复制过程类似。
【思考1】填写下表:(记忆)细胞内DNA复制条件分析
2.(理解)细胞内DNA的复制
(1)DNA的结构:脱氧核苷酸分子通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链,两条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化,形成DNA双螺旋结构。
(2)DNA的复制:首先,在解旋酶的作用下,由ATP供能,DNA发生解旋形成两条DNA单链。
其次,在DNA单链的3’端,在RNA聚合酶在作用下,合成RNA引物。
再次,在DNA聚合酶的作用下,从引物的3’端开始合成DNA子链。
最后,DNA聚合酶将引物切去,并合成空缺处DNA单链,再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来。
3.(记忆)DNA分子复制的人工控制
解开螺旋:在80~100℃时,DNA双螺旋打开,形成两条DNA单链,称为变性。
恢复螺旋:在50~60℃左右时,两条DNA单链重新形成双螺旋结构,称为复性。
复制条件:缓冲液,DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。
控制仪器:PCR仪(温度周期性自动调节仪)。
【思考2】缓冲液相当细胞内的什么成分?核液。
【活动2】阅读教材P59“PCR的反应过程”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)填写PCR反应流程:
?
2.(理解)PCR反应过程是:在升温至90℃以上时DNA解旋;在降温至50℃左右时引物与DNA单链结合;在升温至72℃左右时合成DNA子链。
二、实验操作
【活动3】阅读教材P62“实验操作”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)在PCR反应体系的配方中,含有的成分有缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物、水。
2.(了解)实验操作步骤:按照PCR反应体系配方配制反应液;将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管()中;将微量离心管放到PCR仪中;设置PCR仪的工作参数;DNA在PCR仪中大量扩增。
3.(了解)水浴法:将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃恒温水浴锅中循环处理。
三、操作提示
【活动4】阅读教材P62“操作提示”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)避免外源DNA污染,所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
2.(记忆)将缓冲液和酶分装成小份,-20℃低温保存。
3.(记忆)每添加一种反应成分,更换一个移液器枪头。
4.(记忆)混匀后离心处理,使反应液集中在离心管底部。
四、结果分析与评价
【活动4】阅读教材P63“结果分析与评价”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)反应液稀释:取2?LPCR反应液,添加98?L蒸馏水。
2.(记忆)分光光度计调零:将100?L蒸馏水添加到比色杯中,在260nm处将分光光度计读数调节为零。
3.(记忆)将100?L反应稀释液倒入比色杯中,测定在260nm处的光吸收值。
4.(记忆)DNA含量计算:DNA含量(
g)=50×光吸收值×稀释倍数。
【活动4】观看视频:观看“多聚酶链式反应扩增DNA片段”视频,学会相关技术方法。
〖课后学习〗
1.尝试从植物组织中提取DNA分子。
2.基础训练册:将基础知识整理到作业本上;完成该节训练题。