液相色谱应用案例2

粥样硬化的发生，是动脉血栓形成的独立 危险因子。
尿中三甲基组氨酸
样品前处理：收集尿液—加 入内标（乙醇胺）—衍生化
色谱柱：Shim-ODS(4.6mm x 250mm)柱，5μｍ Hypersil-C18 流动相：A 四氢呋喃：甲醇：磷 酸盐缓冲液 5：95：900；B 甲醇， 梯度洗脱 荧光检测：激发波长260nm，发 射波长455nm
Heterozygous 5 ( 1 bp insertion) Heterozygous 4 (SNP) Heterozygous 3 (1 bp deletion)
Heterozygous 2 ( SNP)
Heterozygous 1 ( SNP) Wild type mixed with homozygous mutant Wild type
毒性实验
临床前申报
批准后进行I期、II期和III期临床试验
建立HPLC分析方法——确定应用目的

纯度检查/质量控制（鉴别/有关物
质检查/含量测定）/代谢研究

分离对象——原料/制剂/体液/组织
定量分析/定性分析
常量/痕量 主成分/相关杂质 常规质控/实验室研究
建立HPLC分析方法——了解中间体和副产物
酶切
对照样品
质谱
疾病样品
疾病特异蛋白
疾病相关蛋白质组研究流程图
数据库检索
蛋白质组研究技术路线流程图
细胞、组织或体液 超声破碎、离心
蛋白质提取液
全溶液酶切 SDS-PGGE 2DE 多肽混合物 胶上酶切 多肽混合物 多肽混合物 cLC-MS/MS or MUPIT cLC-MS/MS or MUPIT SDS-PAGE/RPLC 溶液或胶上酶切 cLC-MS/MS or MUPIT
———————————————————————
应用实例：新型COX-2抑制剂的研制
COX抑制剂 NSAIDs COX（环氧化酶） AA→PGs
COX-1 PGs合成
COX-2
PGs合成
COX-2抑制剂
调节外周血管阻力 保护胃肠道粘膜 调节血小板聚集
促进炎症反应和组织损伤
化合物设计
系列化合物合成 化合物纯化/鉴定 活性筛选，确定候选药物 质量研究，制定质量标准 影响因素试验，加速试验 稳定性考察 制剂研究 药效学实验 药理毒理实验 药代动力学研究 毒性评价
体液中氨基酸分析
体液中游离氨基酸水平反映了机体的营养和代谢状态，氨基酸 的水平及改变，与某些疾病，如肝病、肝性脑病、肾病，以及 某些先天性、代谢性疾病有关。特别是必需氨基酸与非必需氨 基酸比值、支链氨基酸与芳香氨基ห้องสมุดไป่ตู้比值的测定，在临床上具 有一定的诊断和判断预后的意义。
The Amino Acids Code
目标化合物及内标的结构式（略）
内标的选择：结构类似；非内源性物质；稳定性好
血浆药物浓度测定方法——预处理方法
血浆药物浓度测定方法——分离检测方法
荧光检测
1 2
紫外检测
A A B B
C C
色谱条件（略）
血浆药物浓度测定方法——方法的确证

方法的专属性——内源性物质、代谢产物不干扰分离 线性——…… 定量限——…… 日内和日间精密度——三个浓度（…… ） 准确度 稳定性——血浆室温放臵24hr、-20℃和室温反复冻融
柱后衍生 离子交换色谱-茚三酮-570nm/440nm
氨基酸分析方法
柱前衍生 衍生-反相色谱-荧光检测或UV检测
血浆同型半胱氨酸
样品前处理：血浆—加入内 标（磺基同型半胱氨酸 ）— 沉淀蛋白—衍生化
色谱柱：Waters NovPak ODS柱 （3.9mm x 150mm）及保护柱 血浆中游离Hcy大约占总量的<2%以下。 Hcy值可以作为一种疾病预警指标，即血 液中同型半胱氨酸含量升高，标志着动脉 流动相：A 0.05mol/L醋酸盐缓冲 液，pH 6.8，含8%乙腈；B 乙腈 梯度洗脱 荧光检测：激发波长335nm，发 射波长455nm
dsDNA Mutation Detection by dHPLC
Partially denaturing: 52-78 C (Size and Sequence Dependent)
Partially denaturing: 52-78 C (Size and Sequence Dependent)
建立HPLC分析方法——方法优化/验证/实施
120 100
溶出度 % （Y-轴）
片剂溶出度的测定
专属性 精密度
1 2 3 4 5 6 平均
80 60 40 20 0 0 15 30 45 60 90 120 溶出时间 min（X-轴）
线性 回收率 方法的耐用性 与UV法比较
批号￥￥￥片剂的溶出曲线
3-甲基组氨酸是骨骼肌肌动蛋白和肌球蛋 白的降解产物，测定尿中3-甲基组氨酸的 排泄量，有助于了解肌组织收缩蛋白的降 解情况，从而掌握肌肉所承受的运动负荷。
建立HPLC分析方法——方法优化与验证
原料和制剂稳定性研究 强酸破坏
色谱图（略）
强碱破坏
氧化剂破坏
高温/高湿/光照试验 加速试验 长期留样品
建立HPLC分析方法
——动物体内代谢的研究

选择内标化合物


预处理方法的确定
建立色谱分离和检测方法
分析方法的确证与实施
主要代谢产物的鉴定
血浆药物浓度测定方法——内标的选择
合成路线（略）
建立HPLC分析方法——初步建立方法
色谱图（略）
选择色谱分离条件 确定检测波长 254nm
建立HPLC分析方法——方法优化与验证
有关物质检查
色谱图（略）
检测波长的确定 面积归一化法/自身对照法（<0.5% ） 系统适用性试验——理论塔板数、主峰与相邻杂质的分离度 供试品溶液的稳定性 方法验证——专属性、精密度、最低检出限
液相色谱应用案例（二）
廖杰 liaojie301@163.com
液相色谱应用案例

在药物研究开发中的应用

质量研究 药物代谢

在生物标志物研究与分析中的应用

DHPLC与基因诊断 体液中氨基酸分析 体液中儿茶酚胺的测定 其它应用 蛋白质组研究中的色谱预分离
药物研究开发过程中的液相色谱
血浆药物浓度测定方法——实际样品测定
日期 截距 （×10-3） 斜率 (×10-3) 相关系数r
2005-5-23
8.42
6.36
0.9988
2005-6-4
-1.41
7.29
0.9983
2005-7-25
11.87
6.63
0.9981
2005-8-16
14.26
7.02
0.9976
2005-8-19 2005-8-20
Eight different polymorphisms including a deletion, insertion and a homozygous change in one amplicon.
Heterozygous 7 (SNP)
SNP Detection
Heterozygous 6 (SNP)
靶标鉴定/确认 药物设计/合成/鉴定 /筛选/毒性评价
疾病研究 药物发现
生物标志物的分离/鉴定
纯化/鉴定 代谢组学研究
确定候选药物
原料和制剂的临床前研究 药学/药理毒理
药物开发
申报
检验疗效和毒性
确证结构/质量研究/制 定质量标准/稳定性研究 /动物体内药代
临床研究 生产销售
人体药代/长期稳定性研究 /临床用药的质量控制
11.60 23.84
8.29 7.61
0.9963 0.9991
每一分析批建立一条标准曲线，同时携带QC样品，分散在整个待测 样品分析过程的前、中、后进行测定，以保证每个分析批的准确性
血浆药物浓度测定方法——实际样品测定
比格犬口服片剂颗粒血浆药物浓度随时间的变化
体内代谢转化研究——代谢物分离
色谱图（略）
Discovery of Variations Variation Linkage to Disease
Diagnostics and Pharmacogenetics
Gene Discovery
1990’s
2000
Future
Substitutions
Transversion: exchange of a purine for a pyrimidine
批准上市
质量控制 疗效/毒性长期研究
QA/QC
20年抗放药物研究的基本情况
———————————————————————
研 究 项 目 数量(X) (X x 100)/7000 x% ——————————————————————————— 在小鼠上试验过的化合物 7000 100.0 对小鼠有抗放作用的化合物 >230 3.3 在狗上试验过的化合物 >70 1.0 对狗有效的化合物 >30 0.43 能上人进行研究的化合物 14 0.2 临床上进行扩大研究的药物 4 0.057
ACCGTCAAC...GCGACCT
TGGCAGTTG…CGCTGGT
A -> C Purine -> Pyrimidine
ACCGTCCAC...GCGACCT
TGGCAGGTG…CGCTGGT
Insertions
5’ACCGTCAACGACCT3’ 3’TGGCAGTTGCTGGT5’ TCGGAT AGCCTA
5’ACCGTTCGGATCAACGACCT3’ 3’TGGCAAGCCTAGTTGCTGGT5’
Deletions
5’ACCGTCAAC...GCGACCT3’ 3’TGGCAGTTG…CGCTGGT5’ C…G G…C
5’ACCGTCAACGACCT3’ 3’TGGCAGTTGCTGGT5’
DHPLC分离原理
250 mM HCOONH4 150 mM HCOONH4 100mM HCOONH4
Nanobore Column
Ion Trap
80 mM HCOONH4
60 mM HCOONH4 40 mM HCOONH4 20 mM HCOONH4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Time [min]
Capillary or nano LC Pump
体内代谢转化研究——代谢物制备
4
样品前处理：……
3
色谱图（略）
色谱条件：……
2
1
体内代谢转化研究——代谢物鉴定
化学结构（略）
M1
M2
M4
ESI-MSn分析条件：电喷雾离子源（ESI），正离子方式检测，喷射 电压6 KV；毛细管温度250℃；毛细管电压21 V；管透镜补偿电压55 V；碰撞气为He；鞘气（N2）流速为25流量单位（a.u.）；辅助气 （N2）流速为35流量单位（a.u.）；注射泵进样速度5 L· min-1；采 集范围：m/z 50 ~ 800。
2DLC
溶液酶切
HPLC/ALIE F
胶上酶切 多肽混合物
cLC-MS/MS
MS or cLC-MS/MS
生物信息学分析
Salt as gradient or steps Loading Pump
Injector SCX Column
Waste
1 or 2 Enrichment Columns analysis NanoLC Pump
DHPLC的分离模式
Non denaturing: 50 C (Size Dependent, Sequence Independent)
High-Resolution dsDNA Fragment Separations
bp 587 458 434 298 257+267 174
102 80
主要杂质的LC-离子阱质谱鉴定
主成分及相邻杂质的MS1图（略）
主成分及相邻杂质的MS 2图谱（略）
建立HPLC分析方法——方法优化与验证
原料与制剂的含量测定
确定定量方法/含量限度
系统适用性试验——理论塔板数、主峰与相邻杂质的分离度 供试品溶液的稳定性 方法验证——专属性、线性、精密度、回收率、耐用性 各三批供试品测定
Injector
SCX Column
Salt gradient
Collected fractions
Waste
Loading Pump Injector 1 or 2 Enrichment Columns analysis NanoLC Pump
Nanobore Column
Ion Trap
DHPLC与基因诊断
Biomarker Analysis
蛋白质组研究中的色谱预分离
蛋白质组
(proteome = protein + genome): 一种细胞、组织或 生物体完整基因组所对应 的全套蛋白质
蛋白质组学proteomics ——研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的科学
图象处理
蛋白质分析
蛋白质切割