人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定.

人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定

作者：秦明春，王若光，秦莉花，刘小丽，李春梅，刘惠萍，叶赞

【摘要】目的探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法，提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。建立血管内皮细胞培养模型，为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法取2根脐带（至少20 cm）冲净淤血，采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液, 一根用0.2％胶原酶Ⅱ，另一根用0.1％胶原酶Ⅰ和0.25％胰酶等比混合消化液，比较两种酶的消化效果。收集细胞并用含有10 ng/mL的VEGF的培养基中培养，观察细胞的生长及传代。并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术观察细胞周期。结果两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞，胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶，且比较理想的消化时间均为13 min，细胞接种后4～5 h开始贴壁生长，1周左右可生长成单层，光镜下呈多角形，“铺路石”样排列，免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。细胞周期显示约有50.6%的细胞处于G0/G1期。结论胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法，而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，成功率高，可靠性大，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。

【关键词】人脐静脉内皮细胞；细胞培养；流式细胞术；细胞周期；分离；鉴定

Cultivation and in vitro identification of endothelial cells from human umbilical vein

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕Ｏｂｊｅｃｔｉｖ

ｅTo explore the primary culture method of human vascular endothelial cells(ECs) from umbilical vein, enhance the succes s rate of separating and culturing ECs in vitro, establish the model of human vascular ECs, and provide an experimental method for research of ECs. Methods The umbilical veins in human umbilical cords, 20 cm long, were fixed and filled the digestive fluids, 0.2% collagenenaseⅡin one cord and t he complex enzyme of 0.25% trypsin and 0.1% collagenaseⅠin an other, and the digestive results were compared. All the cells were collected and cultured in fluid with 10 mg/mL VE GF, their procreation and generation were observed, the morph ologic characteristics of ECs were observed with light micros copy and immunohistochemistry under inverted microscope, and t he cell cycle was observed by flow cytometer. Results Enough

ECs were obtained from both digestive liquids, and collagen enaseⅡwas better than complex enzyme, the effective digesti ng time was 13 minutes. the culturing cells grew on the wa ll appeared after 4-

5 hours and the monolayer cells were formed after one week.Ⅷfactor in the ECs showed positive reaction by immunohis tochemistry. Cell cycle revealed that 50.6% cells were at st age of G0/G1. Conclusion The perfusion with colla 〔Ｋｅｙｗｏｒｄ

ｓ〕human vascular endothelial cell in umbilical vein; cell culture; flow cytometry; cell cycle; separation; identifica tion

血管内皮细胞是位于血管内壁的单层细胞，通过产生和分泌许多血管活性物质，在维持血管舒缩、抗凝血及血管构建等方面起重要作用，同时由于其特殊的解剖学部位使内皮细胞能敏感地感知血流、压力、炎症信号以及血液循环中激素水平的变化，通过一系列的信号转导过程与邻近及远处的细胞相互联系，对各种刺激作出反应，维持机体内外环境的稳定。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法。新生儿脐带由于取材方便，来源充足，而成为血管内皮细胞体外实验的主要材料。本文利用健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带，采用改进的灌注消化法，运用不同的消化酶成功分离了人脐静脉内皮细胞，并用免疫组织化学法进行了鉴定，从而为构建体外研究血管内皮细胞的模型及进一步实验研究打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源与采集标本均来自于湖南中医药大学第一附属医院妇产科正常足月妊娠娩出的新生儿脐带。于无菌条件下剪下脐带（至少

20 cm）放入装有培养基的无菌容器中，快速移入实验室，1 h内行脐静脉内皮细胞的分离培养。

1.1.2 试剂PRMI-1640培养基、类标准胎牛血清（Hyclone)；L-谷氨酰胺（Sigma公司）；VEGF（Sigma公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；胶原酶Ⅰ、Ⅱ（Gibco公司）；兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；青-链霉素（Gibco公司）；其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器水套式CO2培养箱（2300型，SHEL-LAB）；超净工作台（SW-CJ-IF，苏州安泰空气技术公司）；台式多管自动平衡离心机（TDZ5-WS，长沙平凡仪器仪表有限公司）；倒置显微镜（XD-101型，南京江南光电股份有限公司）；制冰机（AF100型，斯科茨曼公司）；超纯水仪（Maxima Scientific，ELGA公司）；电热重蒸水器（ZLSC，上海申安医疗器械厂）；座式自控电热压力蒸气灭菌器(ZDX-35型，上海申安医疗器械厂)；电