人脐静脉内皮细胞的培养
人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定
本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥 安徽省立医院普外科安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生)人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定余继海 许戈良 汪 建 荚卫东 傅斌生[摘 要] 目的 探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。
方法 采用胶原酶 灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。
结果 种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。
内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。
结论 消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。
[关键词] 内皮细胞;培养C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001[Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient.[Key words] Endot helial cells;Culture我们采用胶原酶 灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。
一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法
一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法作者：李琴山冯赞杰刘洋徐海燕钱民章【关键词】 ,内皮细胞；脐静脉；细胞培养【Abstract】 AIM: To establish a stable method to isolate and culture human umbilical vein endothelial cells (hUVEC) in vitro. METHODS: Endothelial cells of vein from newborn umbilical cord were successfully isolated using a combination of collagenase and trypsin (1∶1). Cells were not digested with trypsin until the cells reached confluence over 80%. The composition of culture medium was simplified by not adding vascular endothelial cell growth factor and heparin. The cultured cells were verified as hUVEC by morphology and immunofluorescence staining. RESULTS: The endothelial cells initially spread on the bottom of the dishes in 4 h, then coalesced and grew to form confluent monolayers of polygonal cells within 7-10 d. The cultured cells had a cobblestone appearance with a strict monolayer growth and contact inhibition. The purity of endothelial cells was more than 95% identified by immunocytochemistry staining for Ⅷ:Ag and KDR. CONCLUSION: Method of injection with mixed Enzyme solution is an optimized protocol which is reliable and of high achievement ratio. Cellsharvested with this protocol can be used as models on research of vascular endothelial cells in vitro.【Keywords】 endothelial cell; umbilical vein; cell culture【摘要】目的：建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的方法. 方法：采用胰蛋白酶/胶原酶（1∶1）混合酶液消化法培养人脐静脉内皮细胞，简化完全培养液组分（不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子），当原代培养细胞80％以上汇合后用胰蛋白酶消化传代；用形态学、免疫细胞化学法进行鉴定. 结果：种植在培养瓶中的内皮细胞4h贴壁生长，48~96 h生长最快，7~10 d汇合. 内皮细胞呈单层铺路石样外观，Ⅷ因子相关抗原（Ⅷ：Ag）和内皮细胞生长因子受体2（KDR）鉴定内皮细胞纯度达95％以上. 结论：用混合酶液灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法，可靠性大，成功率高，可以构建体外研究血管内皮细胞的模型.【关键词】内皮细胞；脐静脉；细胞培养0引言血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)在心血管疾病的发生中占有重要的地位［1］. 采用培养的VEC进行相关机制研究是一种普遍应用的实验方法. 由于人体组织取材限制，很难获取大量原代培养的人VEC.我们以健康胎儿脐静脉血管为材料，建立起一种改良的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, hUVEC）培养方法.1材料和方法1.1材料新生儿脐带由遵义医学院附属医院提供；胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、EDTA（Sigma公司）；M199、胎牛血清（Gibco公司）；台盼蓝(Amresco公司进口分装)；鼠抗人Ⅷ因子抗体、鼠抗人内皮细胞生长因子受体2（KDR）抗体（美国Dako公司）；超净台（苏州苏净集团安泰空气公司）、倒置相差显微镜（日本Nikon公司）, CO2孵箱（美国Thermo Formo公司）、酶标仪（德国Huma Reader公司）. 完全培养液为800 mL/L M199培养液、200 mL/L胎牛血清、2 mmol/L L谷氨酰胺、1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素，使用前调节pH至7.0~7.4.1.2方法1.2.1hUVEC的分离和培养在无菌条件下，取健康产妇分娩后6 h内［2］的脐带，长约30 cm,剪去脐带两端钳夹处. 于脐静脉一端插入一针头，用生理盐水反复冲洗至无血迹后，将脐静脉另一端用止血钳夹紧，用空针封闭. 灌入1 g/L胶原酶和2.5 g/L胰蛋白酶（1∶1）（V/V） 15 mL，置37℃水浴箱中孵育8 min，将消化液收集入离心管，用PBS冲洗脐静脉2次，将冲洗液一同收集入离心管，1000 r/min 离心10 min，去上清液，加入完全培养液重悬细胞，取0.1 mL细胞悬液用4 g/L台盼蓝染色后作活细胞计数. 将1.5×107/L细胞接种到24孔板中，每孔加入完全培养液1 mL，置37℃，950 mL/L O2，50 mL/L CO2培养箱内静置培养，次日换培养液，以后每3 d换液1次，7~10 d 融合.1.2.2细胞计数采用台盼蓝排斥法. 取0.1 mL混匀的内皮细胞悬液与4 g/L台盼蓝0.9 mL混匀后，取1滴在显微镜下计数100个细胞. 当细胞悬液中细胞存活率大于95%时可用于进行原代细胞培养.1.2.3hUVEC的鉴定［3-5］用Ⅷ因子抗体（抗von Willebrand 因子抗体）以及KDR抗体免疫细胞化学法鉴定内皮细胞. 将酸化处理的普通盖玻片消毒后放入6孔培养板，将原代或传代的内皮细胞悬液接种于盖玻片上，当细胞生长至近融合状态时用PBS缓冲液冲洗细胞爬片，-20℃丙酮固定10 min；PBS缓冲液洗3次，5 min/次；用30 mL/L H2O2,室温孵育5 min，灭活内源性过氧化物酶；分别滴加适量鼠抗人Ⅷ因子一抗工作液（1∶100）； KDR（1∶200）一抗工作液，37℃作用60 min；PBS缓冲液洗3次，每次5 min；再分别滴加羊抗鼠的IgGFITC 和IgGTR的二抗工作液，37℃作用30 min后，PBS洗涤3次. 立即在荧光显微镜下观察、摄片. GAMFITC绿色荧光显示膜上KDR；GARTR红色荧光显示胞内的Ⅷ因子. 对于Ⅷ因子相关抗原还采用免疫细胞化学SABC法进行检测，显微镜下观察.1.2.4hUVEC的消化传代①取生长融合的细胞吸去培养液，PBS洗2次；②翻转培养瓶，加入1.25 g/L胰蛋白酶, 0.2 g/L EDTA 的细胞消化液；③倒置显微镜下观察细胞消化情况，待细胞与细胞分开、胞体变圆变亮时翻转培养瓶，吸去消化液；④加入完全培养液，小心吹散细胞，计数，接种到新的培养瓶或培养板, 置37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养.1.2.5细胞生长曲线的测定取待测生长状态良好细胞，增长至接近汇合时向培养瓶内加入1 mL 1.25 g/L胰蛋白酶液消化，待细胞接近脱离瓶壁前吸出消化液，加入完全培养液，轻轻吹打制成细胞悬液、计数. 向24孔板的每孔中接种等量细胞，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养. 将细胞分成8组，每组3孔，培养8 d. 从接种次日起每24 h分别取3个孔计数，取平均值，以时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制生长曲线.2结果2.1hUVEC的培养与鉴定在倒置显微镜下连续观察，培养的原代内皮细胞在接种4 h之后开始贴壁生长，细胞呈球形、小多角形，单个或小团块存在. 接种第2～3日，细胞即进入对数生长期，细胞生长迅速；第5～8日时铺满培养瓶瓶底，呈现典型的铺路石样形态特征(图1). Ⅷ因子mAb免疫细胞化学结果显示95%以上为阳性血管内皮细胞，细胞胞质为棕黄色，胞核为蓝色(图2). KDR(图3)和Ⅷ因子(图4)免疫荧光双标显示95%以上为阳性血管内皮细胞.图1培养6 d的原代脐静脉内皮细胞（略）图2脐静脉内皮细胞Ⅷ因子免疫组化检测（略）图3脐静脉内皮细胞内皮细胞生长因子受体2免疫荧光检测（略）2.2hUVEC生长曲线测定通过细胞计数,接种后第1日，细胞较接种时无明显变化，此时细胞仍处于滞留期，第2日则明显增加，第3~5日增长迅速,达到其生长高峰，此时细胞处于对数生长期，第6~8日细胞生长稳定,处于生长平台期(图5).图4脐静脉内皮细胞Ⅷ因子免疫荧光检测（略）图5原代人脐静脉内皮细胞生长曲线（略）3讨论我们以人脐静脉作为培养血管内皮细胞的来源，是因为它具有取材及操作方便，获得细胞数多，在某些方面尚具有与动脉生物学特征相似的优点.获取内皮细胞的方法有机械刮取［6］、组织块移植和酶消化法3种. 前两种易混杂其它血管壁细胞，近几年来已逐渐被酶消化法取代. 从分离细胞数量、保持细胞活性和结构完整性来看，胶原酶是理想的血管内皮细胞分离酶，自成功分离hUVEC以来，已得到广泛应用，但其价格昂贵. 用胰蛋白酶代替胶原酶分离血管内皮细胞已有文献报道. 我们比较了全胶原酶和胰蛋白酶加胶原酶混合两种酶液的消化能力，结果表明，采用胰蛋白酶加胶原酶混合消化的方法，hUVEC 收获量基本接近全胶原酶血管内皮细胞的收获量. 在混合酶液中，胶原酶仅占1/2，这种方法既经济，效果又好. 而且用胰蛋白酶处理可以降低非内皮细胞的贴壁能力，内皮细胞的贴壁能力比平滑肌细胞和成纤维细胞早，所以在接种后6 h可以去除未贴牢的细胞，这些非内皮细胞的污染如不去除，将抑制内皮细胞的增殖.hUVEC较动物内皮细胞的培养困难，只有在培养液中加入刺激细胞生长的物质，方能长期传代培养. 董玉兰等［7］和Relou等［8］报道，培养液中加入人血清、血管内皮细胞生长因子、肝素及培养瓶（皿）用明胶覆盖是hUVEC长期培养的重要条件. 但这些促进内皮细胞贴壁及生长的物质的加入可能成为影响实验结果的混杂因素，限制内皮细胞的实验应用范围. 有人［9-11］研究发现，血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等有助于培养的胚胎干细胞分化为内皮细胞. 胚胎干细胞有望成为新的种子细胞来源. 我们在改进内皮细胞分离和传代方式的基础上选择M199培养基，补充200 mL/L胎牛血清和2 mmol/L L谷氨酰胺，在维持内皮细胞正常生长和形态结构的前提下尽可能减少完全培养液的组分，能将hUVEC传5～6代. 总之，我们改进的hUVEC培养方法可获取足够数量高纯度可传代的内皮细胞，对内皮细胞生物学特性和心脑血管相关疾病的研究有重要意义.【参考文献】［1］ Li XD, Lu kH, Guo SZ, et al. Culture of vascular endothelial cell ［J］. Chin J Aesthetic Med, 2001,10(3):18-20.［2］王建民，刘荫秋，赖西南. 正常脐静脉离体后不同时间内皮某些物质含量的变化［J］. 第三军医大学学报，1995，17（1）：86.［3］ Jonathan B. Rosenberg, Judith S, et al. Genetic induction of a releasable pool of factor Ⅷ in human endothelial cells ［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2000, 20 (12)：2689-2695.［4］李孟彬，王为忠，张宏伟，等. 猪血管内皮细胞的培养与表型鉴定［J］. 第四军医大学学报，2004，25（24）：45.［5］ Mario P, Afazal J, Daniel P, et al. Expression of VEGFR2 and AC133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of functional endothelial precursors ［J］. Blood, 2000,95（3）：952-958.［6］ Quattrone S, Chiappini L, Scapagnini G, et al. Relaxin potentiates the expression of inducible nitric oxide synthase by endothelial cells from human umbilical vein in in vitro culture ［J］. Mol Hum Reprod, 2004,10(5): 325-330.［7］董玉兰，陈铁镇，王铁吉,等. 人脐静脉内皮细胞的继代培养［J］. 中国医科大学学报，1989，18（2）：81-85.［8］ Relou IAM, Damen CA, Van der Schaft. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness ［J］. Tissue Cell, 1998,30(5):525-530.［9］ Evans GR, Brandt K, Klatz S, et al. Bioactive poly(Llactic acid) conduits seeded with Schwann cells for peripheral nerve regeneration［J］. Biomaterials, 2002,23(1):841.［10］ Liang PF, Zhang PH, Yang XH, et al. Experimental study on inductionof endothelial apoptosis by burn serum and subeschar tissue fluid ［J］.中华烧伤杂志,2004,20(5):275-277.［11］ Savore C, Zhang C, Muir C, et al. Perlecanknockdown in metastatic prostate cancer cells reduces heparinbinding growth factor responses in vitro and tumor growth in vivo ［J］. Clin Exp Metastasis,2005,22(5):377-390.。
人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养
人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养张臣;李彤;侯跃龙;严晓晔;高英堂【摘要】目的:建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、鉴定的高效方法.方法:胰酶消化法从脐静脉获得HUVEC,观察其形态并传代培养,检测其摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AcLDL)的情况,传3代流式榆测内皮细胞特异性表达.结果:消化分离的细胞呈小圆形且聚集成团;2h细胞开始贴壁,呈条索状;7d细胞增多呈漩涡样生长;此后细胞继续增多接近融合,呈铺路石样改变.流式检测细胞高表达血管内皮细胞特异性标志CD144、vWF、CD31,部分表达CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达.镜下发现贴壁细胞原代、第5代摄取Dil-AcLDL,胞浆呈现红色荧光,提示为有活性的内皮细胞.结论:利用胰酶消化法能从人脐静脉获得大量内皮细胞,体外培养后能成功增殖传代.【期刊名称】《天津医药》【年(卷),期】2010(038)007【总页数】3页(P605-607)【关键词】内皮细胞;脐静脉;细胞培养技术;细胞分离;连续传代【作者】张臣;李彤;侯跃龙;严晓晔;高英堂【作者单位】300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室【正文语种】中文人的内皮细胞是血管壁的主要组成部分，在维持组织稳态、纤溶与凝血、血液组织交换、血管舒缩调节、血管新生、血细胞激活和迁移等生理和病理过程中发挥着重要作用，另外在免疫反应起始过程中也起着决定性的作用[1]。
因此体外获得血管内皮细胞可为阐明许多疾病血管并发症的病理过程提供重要研究模型[2]。
新生儿脐带由于取材经济、来源充足,而成为血管内皮细胞体外获得的主要材料。
人脐静脉血管内皮细胞HUVEC
第三：铺板加样方法错误。
• 6孔、12孔、24孔、48孔与96孔的细胞接种铺板过程中，你的 加样方式是哪种？你觉得加样方式对后期的接种均匀度影响大 吗？例如你是否有过垂直加入96孔板的经历？是不是有的孔就 比较均匀，而有的孔就聚集在了一起？六孔板怎么摇晃也不均 匀？其实也许你离铺好板就差一种适合你的方法。
• 2、不是所有细胞消化后都会变成圆形
• 有些细胞(比如U87，U251)消化好了也不会变成圆形， 只是呈半沙状。
• 3、有些细胞即使变圆，也有脱落的细胞，但还是没消化好 • 比如7860，要等到大部分细胞脱落培养皿底部才可以停
止消化，否则很难吹打下来，这种情况一般发生于难以消化 的细胞。
• 4、对于一些特殊的细胞需要消化过一点 • 有些细胞吹成单个细胞反而对细胞的状态会好一点，一
6孔板、12孔板或24孔板
• 为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象。通常 每孔首先滴加少量培基，轻轻晃动浸润整个孔底以保证板子 的孔底都是湿润的，这样加液后细胞悬液会平铺在整个孔底， 可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多 的现象，细胞分散会较均匀。注意加完细胞悬液后要放工作 台静置一下（5-10分钟）。镜下观察细胞均匀度，如不均匀 可采用以下8字法、十字法及震荡法等方法进行细胞均匀度 处理
• HUVEC细胞培养难度较高，建议使用内皮细胞专用培养基， 选用优质胎牛血清。细胞推荐传代比例为1:2-1:3，胰酶消化室 温1-2分钟，传代周期通常为3-4天。需要注意的是，如 HUVEC出现聚团生长，可能由于培养板亲水性差或者血清中 促贴壁因子不足，可考虑用人纤维粘连蛋白包被培养板，能有 效预防细胞聚团。
第二：细胞吹打次数不够，细胞悬
液密度不均匀。
huvec小管生成实验方法
huvec小管生成实验方法HUVEC小管生成实验方法引言：HUVEC（人脐静脉内皮细胞）是一种常用的体外模型系统，用于研究血管生成和血管内皮细胞功能。
HUVEC小管生成实验是一种常见的方法，用于评估血管形成的能力和细胞迁移的能力。
本文将介绍一种常用的HUVEC小管生成实验方法及其步骤。
材料与试剂：1. HUVEC细胞系：通过细胞培养技术获得。
2. 培养基：使用适合HUVEC细胞培养的培养基，如DMEM/F12。
3. 培养皿：使用96孔板或24孔板。
4. 载玻片：用于观察和分析小管生成。
5. Matrigel：一种基质蛋白，用于模拟细胞外基质环境。
实验步骤：1. HUVEC细胞的培养a. 将HUVEC细胞解冻并在培养基中孵育。
b. 细胞密度达到80-90%时，用PBS洗涤细胞。
c. 使用细胞消化酶（如胰酶）消化细胞。
d. 将细胞重新悬浮在培养基中，并计数细胞数目。
2. Matrigel涂层a. 在载玻片上滴加2-3滴Matrigel。
b. 使用移液器均匀涂覆整个载玻片表面。
c. 在37摄氏度下孵育30分钟至凝胶化。
3. 细胞接种a. 将预定细胞数目的HUVEC细胞悬浮在培养基中。
b. 将细胞悬浮液加入预先涂有Matrigel的孔板孔中。
c. 将培养皿放置在37摄氏度的细胞培养箱中，孵育24-48小时。
4. 观察和图像获取a. 使用显微镜观察HUVEC细胞在Matrigel上的小管生成。
b. 使用图像采集系统捕获并保存小管生成的图像。
5. 分析小管生成a. 使用图像处理软件对图像进行分析，包括测量小管长度、分支点数目等。
b. 统计和比较不同处理组的小管生成结果。
结果与讨论：通过HUVEC小管生成实验，可以评估细胞的血管生成能力。
实验结果显示，HUVEC细胞在Matrigel上能够形成分支的管状结构，模拟血管形成的过程。
小管长度和分支点数目可以作为评估血管生成能力的指标。
此外，通过比较不同处理组的结果，可以进一步研究各种因素对血管生成的影响。
HUVEC培养过程
HUVEC培养过程（Human Umbilical V ein Endothelial Cells）1.细胞名称：人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells）2.购买公司：Cascade Biologics （Invitrogen公司），Catalog Number: C-023-5C；3.试剂及培养液配制注：此处所用TTrypsin/EDTA solution、Trypsin Neutralizer solution为培养HUVEC细胞用专有的消化、中和液，切勿用其他代替。
M200+LSGS：4.培养过程（简略）HUVEC为原代细胞，除复苏、冻存过程中与常规细胞系如293T等贴壁细胞雷同外，需主要注意的是培养液放置温度、Trypsin消化细胞过程。
1）培养液放置温度：细胞代理销售公司技术推荐在使用前30min室温（25-27℃）中放置配制好的培养液，用脸贴培养瓶而感觉到不冷（即接近人体温）即可使用。
Trypsin/EDTA solution、Trypsin Neutralizer solution可同样处置。
2）Trypsin消化细胞过程：加入4mL Trypsin/EDTA solution/ 25cm2 flask后晃动3次，吸弃3mL Trypsin/EDTA，室温中作用1-3mins，显微镜下观察细胞变圆、脱离培养皿即可加入3mL Trypsin Neutralizer solution进行终止作用。
3）转移细胞至15mL离心管中，1000rpm 离心5mins，弃上清，加入新鲜的培养液转移至新的培养皿/瓶。
4）复苏、冻存雷同其他细胞操作，细胞复苏、传代后不可多次传代，一次复苏的细胞尽量满足连续性试验需要。
5）可参考Cascade Biologics公司的操作。
人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术
２ １ ４月 ０ ０年
第１ ４卷
第 ４期
一
５ｌ 一 Ｉ
文 章 编 号 ：０７— ２７２ １）４ ５ １ ３ １０ ４ ８ （００ ０ —０ １ —０
人 脐 静 脉 内皮 细 胞 分 离 培 养 及 鉴 定 技 术
吴金 义 张 ， 蕾 ， 张秀英 曲丽梅 ，
（． １吉林大学 中 日联谊 医院 心内科 ， 吉林 长 春 １０ ３ ； ． ３０３ ２ 一医院 病理科 ） 摘要： 目的 探讨人脐静脉 内皮 细胞 （ Ｖ Ｃ 体外 分离 原代 培养 的方法 ， ￣ＪＥ ） 并总结对培养 的细胞 鉴定 方法。方法
通过胰酶灌注法从人脐带获取 内皮 细胞 进行分离培养 ， 并采用免疫组 化法及 光镜和透射 电镜观察 超微结构 鉴定所获
得 的细胞系 。结果
分离 的 Ｈ Ｖ Ｃ在体外 ７ ０天左右可长成单层 ， ＵＥ —１ 光镜下 胞体 为单层铺 路石状排列 。第 ＶＩ 因子 Ｉ Ｉ
用胰酶灌 注法是获
相关抗原 的检测 为阳性 。透射 电镜下 观察培养的内皮细胞胞浆内可见 Ｗｅ ｅ—ａ ｄ 小体 。结论 ｉｌ ｌｅ ｂ Ｐａ 得脐静脉 内皮细胞 的有效 方法 。本 方法 为血 管内皮细胞的研究提供 了实验模型 。
（ ’ Ｌ ｂＤ ａ ｎ ２ １ ，４ ０ １ ） Ｃ Ｊ ａ ／ ， ０ １ ： １ ｇ ０ ５
ｃｅ ａ ｎ ｔｅ ｃ ｉ ｐ ａ ｍ ｕ ｄ ｒｅｅ ｔ ｎ—ｍ ｃｏ ｃ ｐ ｈ ｃ ｅ ｅ ｉｅ ｔ ｅ Ｃ ． ｎ ｌ ｓ ｎ Ｔ ｅｄ ｇ ｓ ｏ ｆ ａ ｃ ｅ ｔ ｅ ＿ ｌ ｓｗ ｓ ｉ ｅｌ ｌ ｅ ｌｃｒ ｈ ｓ ｎ ｏ ｉ ｒｓ ｏ ｙｗ ｉｈ ｗ ｒ ｄ ｎｉ ｄ ａ Ｅ ｓ Ｃｏ ｃ ｉ ｈ ｉ ｔ ｎ ｏ ｎ ｒａｉ ｐ ｄ — ｉ ｆ ｓ ｕ ｏ ｅｉ ｐ ｎ ｕ ｓ ｎ ｉ ａ ｆ ｃ ｖ ｔ ｏ ｏ ｇ ｉ Ｃ ， ｄ ｔｉ ｍｅ ｏ ｒ ｖｄ ｓｅ ｐ ｒ ｎａ ｄ ｌｆｒＶ Ｃｌ Ｃ ｅ ｅ ｒ ｈ ｉ ｅ ｅ ｔ ｅ ｍｅｈ ｄ ｔ ａｎ Ｅ ｓ ａ ｈｓ ｔ ｄ ｐ ｏ ｉｅ ｘ ｅ ｉ ｔ ｍｏ ｅ ｏ ａ ｌａ Ｅ ｓｒ ｓ ａｃ ． ｏ ｓｎ ｉ ｎ ｈ ｍｅ ｌ ｓ ｌ ｒ Ｋｅ ｒ ｓ ｈ ｍａ ａ ｃ ｌｒ ｎ ｏｈ ｌ ｅｌｉ ｍｂｌ ａ ｖ ｉ ｃ ｌ ｃ ｔｒ ；ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｎ ｙ ｗｏ ｄ ： ｕ ｎ ｖ ｓ ｕ ａ ｄ ｔｅｉ ｃ ｌ ｎ ｕ ｉ ｃ ｅｎ； ｅ ｕ ｕ ｅ ｉ ｅ ｔ ａｉ ｅ ｌ ａ ｉｌ ｌ ｉ ｆ ｏ
ScienCell 原代细胞培养方法
ScienCell原代细胞培养方法2018.06.01原代细胞在复苏和传代前一定要包被培养瓶，以促进细胞贴壁。
以人脐静脉内皮细胞（sciencell，货号#8000）为例：1.培养瓶包被包被液纤维粘连蛋白（sciencell，货号#8248）以1-2ug/cm2的浓度包被培养瓶。
可将1mg/ml的纤维粘连蛋白不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液（sciencell，货号#0303）稀释100倍，T-75培养瓶中加入10ml左右，37度孵箱1小时或4度冰箱过夜，并用灭菌双蒸水洗涤培养瓶2遍（此步骤非常重要，必须清洗2遍），包被好的培养瓶不要放置超过24小时。
2.配制培养基以ECM培养基为例把胎牛血清（sciencell，货号#0025）、生长因子（sciencell，货号#1052）和双抗（sciencell，货号#0503）加入培养液中，混匀后的完全培养基于4度保存，应尽快使用。
可分装以延长效期。
3.细胞复苏在培养瓶中加入配制好的ECM培养基10ml（推荐复苏至T75培养瓶，如T25瓶子加5ml）从液氮中取出冻存原代细胞，37度水浴冻融，冻融过程中可以轻轻转动细胞，加快冻融速度（注意原代细胞复苏时一定不要离心），将融化的细胞放入已加入培养基的培养瓶中，再用1ml培养基洗涤细胞冻存管，保证原代细胞都被加入培养瓶中，然后静置于孵箱，12-16小时后更换培养基以除去DMSO。
4.原代细胞传代细胞生长至70-80%左右可以传代，传代比例1:2或1:3为佳。
首先弃去培养基，PBS或D-Hank’s液洗涤培养瓶2遍，加入适量0.25%Trypsin-EDTA，37度孵育，轻拍培养瓶侧面，显微镜下观察原代细胞消化情况。
细胞消化好后，加入适量的胰酶中和液以中和胰酶，然后将原代细胞和培养基转移至离心管中，1000rpm离心5分钟。
然后弃去上清液，以1-2ml培养基重新悬浮原代细胞，加入包被好的已加入培养基的培养瓶中。
根据原代细胞生长情况，大概每2天更换培养基。
人脐静脉内皮细胞的分离培养及鉴定
两种易混 杂其 它血管壁细胞 ， 年 已逐渐被酶 消化 法取 近
代 ＿。 蛋 白酶 、 原 酶 均 可 用 于 消 化 血 管 内皮 细 胞 ， ２胰 Ｉ 胶 但 胰 蛋 白酶 对 内 皮 细 胞 的 损 伤 较 大 ； 原 酶 作 用 较 温 和 ， 胶 但 价 格 昂 贵 ， 制 了 其 在 大 规 模 实 验 研 究 中 的应 用 。 限 本
用Ｓ Ｐ系 列 试剂 盒 、 ＤＡＢ显 色 试 剂 盒 为 中杉 金 桥 生 物 技 术
２ 结果
２ １ 形 态 学观 察 原 代 细 胞 呈单 层生 长 ， 界 清楚 ， ． 边 形 态 为 卵 圆 形 。 养 ３ ｄ 合 ， 典 型 的铺 路 石 状 镶 嵌 排 培 —４ 融 呈
列 。 代细 胞的形 态和 生长特 点与原 代细胞 类似 。 传
公司； 净化工作台 ， 上海新苗 医疗 器械制 造有限公司。
１ ２ 方 法 ．
人 脐静 脉 作 为 内皮 细胞 的 材料 来 源 ， 有取 材 容 具
易 、 作 方 便 的 特 点 ， 与 各 种 实 验 动 物 相 比 ， 实 验 条 操 且 其 件 更 符 合 人 体 情 况 ， 果 更 具 有 意 义 。 培 养 细 胞 的 获 结 在 取 方 法 上 ， 机 械 刮 取 、 织 块 移 植 和 酶 消化 法三 种 。 有 组 前
洗脐静 脉 ， 将冲洗液一并收 集在锥形瓶 中 ， 离心 ｌ ｍｉ ｎ； ０
固定 １ｍｉ ，％Ｈ， 浸泡３ ｍｉ ， ０ ｎ ３ Ｏ， ０ ｎ 山羊血清封闭 ， 加入兔抗 人Ⅷ 因子Ｉ Ｇ抗体 （ ｇ 一抗 ） ℃过夜 ， ＡＢ显色 ， ４ Ｄ 苏木精 复 染 ， 水透 明封 片 后显微镜 下观察 。 脱 以胞 质内 出现棕 黄
人脐静脉内皮细胞的分离培养及鉴定
physiology and the role of novel risk factors:a
静脉通道，遇到病情变化可随时用药，为抢救患者生命
2 方法
赢得了宝贵的时间。
2.1 材料选用 套管针采用洁瑞公司生产的封闭式套 3.3 套管针的穿刺部位均为静脉远端，近邻无重要脏
管针，型号为２０Ｇ或２２Ｇ；敷料采用３Ｌ公司９ｃｍ×６ｃｍ的无 器组织，从而避免了深静脉穿刺的并发症。
菌透明敷贴。
4 使用套管针的注意事项
静脉套管针作为一项新的护理技术已广泛应用于 套管，放松止血带，拔出针芯，用无菌透明敷贴固定套管
临床，特别在急危患者的抢救中更为重要，它保持了静 针，调节输液速度。
脉管道的持续畅通。在Ｃ Ｃ Ｕ 的工作中常常遇到以下情 3 使用套管针的优越性
况：急性心肌梗死的患者由于剧烈的胸痛和恶心呕吐导 3.1 套管针针体长，外套管柔软远端圆滑而整齐，留
1 临床资料
体外渗的发生，对急性心肌梗死的患者静脉具有保护作
我院自２００８．１－２００９．４应用静脉套管针技术抢救急 用，套管针可以留置５－７ｄ［２］。对于需要反复多次静脉输液
性心肌梗死患者１００例，其中男６８例，女３２例；年龄２９－８６ 及随时需要输液的患者，套管针的留置等于一条开放的
岁，平均６ ７ ． ４ 岁。
·６０·
承 德 医 学 院 学 报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＥＮＧＤＥ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ
人脐静脉内皮细胞原代培养方法的改进
ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ，Ｎｉ ｎ ｇ ｄ ｅ Ｍｕ ｎ ｉ ｃ ｉ ｐ ａ ｌ Ｈｏ ｓ ｐｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｆ Ｆｕ ｊ ｉ ａ ｎ Ｐｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ，Ｎｉ ｎ ｇ ｄ ｅ ，Ｆｕ ｊ ｉ ａ ｎ ３ ５ ２ ０ ０ ０，Ｃｈ ｉ ｎ ａ ［ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ ０ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔｏ ｉ ｍｐ ｒ ｏ ｖ ｅ ｔ ｈ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｏ ｆ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｉ ｎ ｇ ｈ ｕ ｍａ ｎ ｕ ｍｂ ｉ ｌ ｉ ｃ ａ ｌ ｖ ｅ ｉ ｎ ｅ ｎ ｄ ｏ ｔ ｈ ｅ ｌ ｉ ａ ｌ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ ＨＵＶＥＣｓ ）ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｔ ｏ
・
６ ４ ・
揖建 药杂毒 ２ ０ １ ３ 年４ 月第 ３ ５ 卷第 ２ 期
Ｆ ｕ ｊ ｉ ａ ｎ Ｍｅ ｄ Ｊ ， Ａ ｐ ｒ ｉ ｌ ２ ０ １ ３ ， Ｖ ｏ １ ． ３ ５ ， Ｎ ｏ 静脉 内皮 细胞 原 代 培 养 方 法 的改 进
福 建 省宁 德 市 医 院 心 血管 内科 （ 宁德 ３ ５ ２ ０ ０ ０ ） 高 峰
ｍｅ ｄ ｉ ｕ ｍ ａ ｄ ｄ ｅ ｄ ｒ ｂ Ｆ ＧＦ ｏ ｎ ＨＵＶＥ Ｃｓ ｐ ｒ ｏ ｌ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｃ ｏ ｎ ｔ ｉ ｎ ｕ ｏ ｕ ｓ ｌ ｙ ｏ ｂ ｓ ｅ ｒ ｖ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｇ ｒ ｏ ｗｔ ｈ ａ ｎ ｄ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｈ ｐ ａ ｓ ｓ ａ ｇ ｅ ｏ ｆ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗｉ ｔ ｈ ａ ｎ ｉ ｎ ｖ ｅ ｒ ｔ ｅ ｄ ｐ ｈ ａ ｓ ｅ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ａ ｓ ｔ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｓ ｃ ｏ ｐ ｅ ． Ｔｈ ｅ ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｐ ａ ｓ ｓ ａ ｇ ｅ ｄ ｗｈ ｅ ｎ ｔ ｈ ｅ ｙ ｇ ｒ ｅ ｗ ｔ ｏ ６ ０ ，７ ０ ，８ Ｏ ｃ ｏ ｎ ｆ ｌ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ，ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｇ ｒ ｏ ｗｔ ｈ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｆ ｉ ｒ ｓ ｔ ｐ ａ ｓ ｓ ａ ｇ ｅ ｏ ｆ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗａ ｓ ｖ ｉ ｅ ｗｅ ｄ ． Ｒｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ Ｔｈ ｅ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｉ ｍｍｕ ｎ ｏ ｃ ｙ ｔ ｏ ｅ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ
实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养
实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养1.将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。
注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）2.用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。
3.用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。
4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml 无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。
5.将收集液离心（2000转/分）3分钟。
6.倒去上清，加入10mlM199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。
注：每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。
）7.培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10ml新鲜的M199培养基。
9.一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。
10.倒掉造就基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，插手2-3ml消化液（0.25%胰酶0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下窥察，一旦细胞变圆，即插手2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。
11.用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50ml无菌离心管中。
2000转/分，离心3分钟。
12.倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养.13.一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。
内皮实验报告
实验目的：本研究旨在通过体外实验，探讨内皮细胞在不同条件下的生物学特性，包括细胞增殖、凋亡、迁移和血管生成能力，以期为内皮细胞在疾病发生发展中的作用提供实验依据。
实验材料：1. 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）2. DMEM培养基（高糖）3. 胎牛血清（FBS）4. 0.25%胰蛋白酶5. 细胞培养箱6. 倒置显微镜7. 流式细胞仪8. 实验试剂（如Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、血管内皮生长因子（VEGF）检测试剂盒等）实验方法：一、细胞培养与鉴定1. 将HUVECs接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 每2-3天更换一次培养基。
3. 利用免疫荧光染色法鉴定内皮细胞，观察细胞形态和内皮细胞标记物（如VE-cadherin）的表达。
二、细胞增殖实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的VEGF处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 在不同时间点收集细胞，利用CCK-8法检测细胞增殖情况。
三、细胞凋亡实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理，对照组给予等量DMEM 培养基。
3. 利用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡情况。
四、细胞迁移实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的细胞外基质（ECM）蛋白处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 利用Transwell小室检测细胞迁移能力。
五、血管生成实验1. 将细胞分为实验组和对照组。
2. 实验组给予不同浓度的VEGF处理，对照组给予等量DMEM培养基。
3. 利用血管生成实验试剂盒检测细胞血管生成能力。
实验结果：一、细胞培养与鉴定成功培养出HUVECs，细胞形态为长梭形，细胞表面表达VE-cadherin。
二、细胞增殖实验VEGF处理组细胞增殖能力明显增强，与对照组相比，增殖率显著提高。
三、细胞凋亡实验TNF-α处理组细胞凋亡率显著升高，与对照组相比，凋亡率显著增加。
Migration
Migration
1实验材料
1.1细胞株
HUVEC人脐静脉内皮细胞
1.2试剂
RPMI1640培养、DMEM培养液、PBS、小牛血清、Trypsin、EDTA HE染色试剂盒、甲醇、无水乙醇、二甲苯
1.3 实验器材
趋化小室、聚碳酸酯膜、莱卡倒置荧光显微镜、精密移液器、全自动高压灭菌锅、超净工作台、超低温冰箱、CO2培养箱、纯水仪、台式电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、24孔细胞培养板、Tip头若干
2 实验方法
趋化小室法测定HUVEC migration
1）细胞饥饿过夜；
2）在趋化小室下层加入600μl含10%血清的培养介质。
盖上8μm的微孔多聚碳酸酯滤膜；
3）配制1×106/ml的细胞悬液，小室上层加入90μl无血清的细胞悬液；
4）药物与细胞悬液一起加入，加药量为10μl；
5）在培养箱中培养（5%CO2，37℃）12h，12h后拆下滤膜；
6）将滤膜上层的细胞擦去，滤膜用甲醇固定，苏木精-伊红染色；
7）每个浓度设3个复孔，染色后于100×显微镜下拍照，做形态学对比；同时400×取随机5-6个视野，取其均值作为迁移细胞数；
8）细胞迁移率（%）＝（对照组细胞数－给药组细胞数）∕对照组细胞数×100%.。
人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定
ｓｎ ｔ １ ．Ｄｅａｔ ｎ ａｄｏ ｇ ，Ｔ ｅ ６ ｏ ｉ ｌｆＰ Ａ ｈｎ ｄ ｅｅ０ ７０ Ｃ ｉ ２ ｅｔ ｌ ｔｉ ｕｐｙＤｅａ ｍ ｎ，Ｔ ｅ ｏｇ ，ｅａ．１ ｐ ｒ ｔｆＣ ｒｉｏｙ ｈ ６Ｈ ｓ ｔ Ｌ ，Ｃ ｅｇ ｅ ｂｉ ６ ００， ｈｎ ｍｅ ｏ ｌ ２ ｐａ ｏ Ｈ ａ； ．Ｃｎｒ ｅｌ Ｓｐｌ ｐ ｒ ｅｔ ｈ ａ Ｃ ｒｅ ｔ Ａｆａｅ ｏ ｉ ｌ Ｃ ｅｇ ｅ ｄ ａ ｏ ｅｅ Ｃ ｅｇ ｅ ｅｅ０ ７ ０ ， ｈｎ ；．Ｄｐ ｒ ｅｔｆＣ ｒｉｏｙ Ｓｃｎ Ｈ ｓｉ ｌｆＴａｆ ｆ ｌｔ ｉ ｄＨ ｓ ｔ ｏ ｈｎ ｄ Ｍｅｉ ｌ ｌｇ ， ｈｎ ｄ Ｈ ｂｉ ６ ０ ０ Ｃ ｉ ３ ｅａ ｍ ｎ ａｄｏ ｇ ， ｅｏ ｐ ａｆ ｃ Ｃｌ ａ ｔ ｏ ｌ ｄ ｏ ｔ ｉｉ ｐ ａｏ ｎ ｎＭｅｉ ｌ － ｄｃ ａＵ
Ｐ Ｙ．ａ ｄｔｅｅ ａ ｎ ｔ ｎｗｉ ｎｉｅ ｓｏ ｕ ｎ Ⅷ ｆｃｏ ｓｐ ｓ ｉｅ ｎ ｈ ｘ ｍｉａｉ ｔ ａ ｔ ｎ ｆｈ ｍａ ｏ ｈ ｇ ａｔｒｗａ ｏ ｉｖ ．Ｃｏ ｃｕ ｉｎ Ｐｅｆ ｓｏ ｔ ｐｅＩ ｏｌｇｎ ｓ ｎｅｆｃｉｅｗａ ｏｃｌｅｔ ｔ ｎ ｌｓｏ ｒｕ ｉｎｗｉ ｔ ｌ ｅ ａ ｅｉ ａ ｆｅ ｔ ｙｔ ｏｌｃ ｈｙ ｃ ａ ｓ ｖ
ＪｕｎｌｆＣｉｉ ｌ ｎ ｘｅｍｅｔｌ ｄｃ ｅＶ１１ ， ｏ １ Ｓｐ ２ １ ｏ ｒａ ｌ ｃ ｄＥ ｐｒ ｎａ ｉｎ ｏ． １ Ｎ ． ８ ｅ．０ ２ ｏ ｎａａ ｉ Ｍｅ ｉ
人 脐 静 脉 内皮胞 细体 外 培 养及 鉴 定
李 东升 邵 素玲 杨 万松 黄 体钢 １解放 军 ２ ６医院心 内科 河 北 承德 （ ６ ２承德 医学 院附属 医院 消毒 供应 中心 河 北 ３天 医科 大 学第二 医院心脏 科 天津 承德 ０７０ ６００； ３０ １ ） ０２ １
血管内皮细胞原代培养(人脐带静脉灌流消化法)
血管内皮细胞原代培养（人脐带静脉灌流消化法）
内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（tumor angiogenesis factor,TAF）等有很大价值。
研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便，其法如下：
1、产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，如不能立即培养，可
于12小时内保存于4℃。
2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线
绳扎紧，以防液体返流。
3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0. 1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3—10分钟；注入口用线绳扎，以防
液体返流。
4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲
洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。
5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。
两至三天可见细胞长成单层。
•。
HUVEC-原代培养步骤
人脐静脉内皮细胞培养1 材料1.1 取材新鲜脐带(无菌的广口瓶，内装预冷的PBS，并加上200 U/ml 青链霉素)，产后4 h 内最佳，一定不要超过24 h，实验前保存在4℃冰箱中。
1.2 试剂0.1%的I型胶原酶(用培养基配成，如DMEM、M199 均可)；培养液(M199、50 μg/ml ECGF、20%胎牛血清、100 U/ml青链霉素、2 mmol⋅L-1谷氨酰胺、100 U/ml肝素钠)，也可以选择其它的生长因子。
平衡盐液(生理盐水或者PBS或者D-hanks’液)；1%明胶。
1.3 器械烧杯(脐带数＋2)、止血钳(脐带数×2＋2)、镊子2 把、手术直剪(脐带数×1)、12 号粗针头(去尖，打磨光滑，脐带数×1)、玻璃培养皿。
2 方法2.1 明胶包被培养瓶过夜，取出明胶，用2 ml培养液(含10%血清的普通培养液)冲洗培养瓶一遍，放置超净台中。
2.2 去妇产科取当天新鲜脐带。
2.3 将取出的脐带放在盛有含双抗PBS 的玻璃培养皿中，洗净脐带表面的残留血液，将脐带两端各剪去一部分；更换一个新的玻璃培养皿，辨别脐带静脉(粗大的那根)，顺着静脉插入大针头，注入含双抗PBS，充分冲洗脐静脉，至流出液体中无可见血液；再更换一个培养皿，加少许PBS，把脐带放在培养皿中，从针头打入胶原酶(37℃预温)，当胶原酶从另一头流出少许的时候，用止血钳夹闭，继续注入胶原酶使脐带充盈后也封闭，37℃消化15 min(室温30℃ 20 min)。
消化结束后收集所有消化液，吸取PBS 冲洗脐带，合并到消化液中，1000 rpm 离心5 min，弃上清，加入4 ml 培养液悬浮细胞，接种到明胶包被的塑料培养瓶中，12-24 h 后换液一次。
一般一根脐带消化下来的细胞可以培养一个培养瓶，如果细胞少就六孔板一个孔，细胞不能太稀疏，否则生长缓慢。
2.4 3-4 天长满后用胰酶(含EDTA)消化以1:2 传代时。
两种人脐静脉内皮细胞培养方法的比较
１ ． １ 实验材料及主要试 剂 、仪器 １ ． １ ． １ 材料 供 ，产妇及其家属签署知情同意书。 １ ． １ ． ２ 主要试 剂
足 月健康 出生 的新 生儿脐带 由太和 医院妇 产科提 而活 细胞 拒染呈无色透 明状 。 随机 观察 ５ 个 视野 ， 活细胞率 （ ％） ＝ Ｍ１ ９ ９培 养基 ，胎 牛血 清 （ Ｈｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ 公司） ，胰 酶加 ０ ． ０ ２ ％ 的Ｅ Ｄ Ｔ Ａ消化液灌注 消化法获取 的内皮 细胞 ，活细
胞贴壁数量只达到 ２ ０ ％～ ３ ０ ％，细胞大部分呈梭形 ，少 部分 呈圆 形或椭圆形。 ２ ． ２ 检测细胞活力
种 疾病发生 密切相关 ，血管细胞 的研 究因此成 为动脉粥样 硬化 以及其 他血管疾病研究 的重要方 向 ［ １ － ２ ］ ｏ人们 常用 脐静 脉作为获 取 血管 内皮 细胞 的来 源。本研究 利用健康 婴儿脐带 ，分别 采用 改 良方法 和传统方法来 获取 内皮 细胞 ，结果发 现细胞数量 和细
化 液消化 、方离脐静脉 内皮 细胞 ，用含 ２ ０ ％ 的胎 牛血清的 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ完全培养液 ，于 ３ ７ ｏ Ｃ 、５ ％Ｃ Ｏ 条件下培养 。（ ２ ） 方法 ２ ，用胶原酶 Ⅱ消化脐静脉
内皮细胞 ，用含 ２ ０ ％ 胎牛血 清 ＋细胞生长 因子 ＋明胶铺板 ，于 ３ ７℃、５ ％Ｃ Ｏ ， 条件下培养 。比较两种方法对细胞 活力 、培养细胞数量 等方 面的影
响。结果 ： 以改 良 方法 培养 的内皮细胞 ４ ｈ 贴壁生长 ，细胞数量达到整瓶 的 ８ ０ ％～ ９ ０ ％， ４ ８ ～ ７ ２ ｈ 生长最快 ，细胞融合 ，内皮 细胞呈单层铺路石样外观 。 传 统方法培养的内皮细胞 ２ ４ ｈ 后细胞数量只达到整瓶的 ２ ０ ％ ～ ３ ０ ％，细胞融合较慢 。结论 ：用 Ｏ ． １ ２ ５ ％胰酶加 ０ ． ０ ２ ％的 Ｅ Ｄ Ｔ Ａ灌注脐静脉消化 内皮细 胞是获取内皮细胞的一种好方法 ， 更加简便 、经济 ，是建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离 和培 养的好方法 。
huvec细胞成管原理
huvec细胞成管原理HUVEC细胞成管原理主要涉及人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在体外形成管腔结构的过程。
HUVEC细胞是一种源自人体脐静脉内皮的细胞，常被用于体外实验研究。
成管过程是指HUVEC细胞在特定条件下形成管状结构，模拟人体内血管系统的形成。
成管的过程经历几个主要阶段。
首先，HUVEC细胞被培养在含有特定细胞培养基的培养皿中。
接着，经过一定时间的培养，HUVEC细胞开始发生形态改变，从扁平的形态转变为柱状形态。
这个阶段被称为上皮细胞向内突出。
细胞内的特定信号逐渐调节细胞的粘附性，促使细胞集结在一起。
接下来，HUVEC细胞开始形成单层的圆形管腔结构。
这是通过细胞间的细胞黏附分子和细胞外基质分子之间的相互作用实现的。
这些分子在特定时间和位置上被调控，从而使细胞形成管状结构。
同时，细胞内的信号通路被激活，导致细胞内的分化和生长。
最后，一系列的信号通路和细胞间相互作用促使管腔的进一步扩张和稳定。
这个过程涉及到细胞分化和新的基质分子的合成和分泌。
细胞继续增殖、迁移并形成分支，最终形成完整的管腔结构。
HUVEC细胞成管的研究对于了解血管系统的形成和发展具有重要意义。
这种体外实验方法可以帮助科学家们研究和理解细胞间的相互作用、信号通路的调控以及基质的重要性。
通过研究HUVEC细胞成管原理，我们可以更好地了解血管疾病的发生机制，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
总而言之，HUVEC细胞成管原理是关于人脐静脉内皮细胞在体外形成管腔结构的过程。
这一过程涉及到细胞的形态改变、信号通路的调控以及细胞间和细胞与基质之间的相互作用。
研究HUVEC细胞成管原理有助于我们更好地理解血管系统的形成和发展，并为血管相关疾病的治疗提供新的方向。
细胞说明书（huvec）
细胞说明书（HUVEC）
细胞名称：HUVEC（中文名称：人脐静脉内皮细胞）
细胞简介：HUVEC细胞为人脐静脉内皮细胞，来源于人脐静脉，中文名为人脐静脉内皮细胞，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生长。
培养方法：
冻存方法：
For research use only
T25瓶细胞处理方法
收到细胞后，检查外包装是否完整，细胞培养瓶是否完好。
如有破损漏液等问题，请即时联系
我们。
1.75%酒精棉球擦拭T25细胞培养瓶外部。
2.肉眼观察细胞培养基颜色，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（40
×,100×,200×各一张）。
3.将细胞放入37度培养箱中预温1-2小时后再做处理，以稳定细胞状态。
4.预热培养基（含10%胎牛血清，1%双抗）。
5.若细胞密度较小，无菌操作，去掉培养基。
每瓶添加第四步中准备的5-6ml培养基。
放
到37度培养箱培养。
待细胞密度达到80%以上，进行传代。
6.若细胞密度较大，达到80%以上，将细胞传到10cm培养皿培养。
7.传代时，T25瓶里保留部分细胞，同步培养，直到能确保10cm培养皿中的细胞状态良
好。