基因工程第五章克隆重组体的构建转化PPT课件

2020/12/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
各种基因工程受体的特性
昆虫细胞（家蚕）
具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉， 遗传稳定
DNA重组操作系统欠完善 适用于真核生物基因的高效表达
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各种基因工程受体的特性
哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）
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各种基因工程受体的特性
酵母菌
• 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，遗传稳定
• 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统 • 不含有特异性的病毒、不产生毒素 • 内源性蛋白产物种类繁多且含量高
适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因 文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工 程重要的真核性受体菌
与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修 饰系统
细胞培养条件苛刻，生长缓慢 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是 DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体
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各种基因工程受体的特性
植物细胞（拟南芥菜、烟叶）
农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单 且成本低廉，具有光合作用
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细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA 的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞 去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子
酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化
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遗传操作繁琐 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质 的改良
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第五章 克隆重组体的构建、转化
第二节 重组DNA分子导入宿主细胞
以质粒为载体：转化作用、接合作用 以噬菌体为载体：转染作用、转导作用
一、重组质粒DNA分子转化E.coli
转化（transformation）：重组子通过与膜蛋白结合进入受体细胞并在 受体细胞内稳定维持和表达的过程。
细菌感受态的形成（感受态细胞：处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞）
转化因子的吸收
整合复合物前体的形成
单链DNA转化因子的整合
转化子的形成
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第五章 克隆重组体的构建、转化
第一节 受体细胞
受体细胞的选择
限制缺陷型
大肠杆菌的限制系统主要由hsd R基因编码，因此具有hsd R—遗传表型的 大肠杆菌各株均丧失了降解外源DNA的能 力，同时大大增加了外源DNA的可转化性。
重组缺陷型
大肠杆菌中存在着两条体 内同源重组的途径，即RecBCD途径和RecEF途径，前者远比后者重要，但两种途径均需
第五章 克隆重组体的构建、转化
第二节 重组DNA分子导入宿主细胞 一、重组质粒DNA分子转化E.coli 2. 电穿孔转化法
利用高压脉冲作用，在E.coli细胞膜上进行电穿孔（electroporation） ，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
需在低温下（0℃-4℃）进行，转化效率高。
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第五章 克隆重组体的构建、转化
第二节 重组DNA分子导入宿主细胞 一、重组质粒DNA分子转化E.coli
3. 接合转化法（三亲本杂交接合转化法） 基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式
非接合型质粒由于缺少编码接合转移基因的功能区，因此不能直接通过细胞 接合转化受体细胞，但当同一细胞中共存一个含有接合功能的辅助质粒，则 这些非接合型质粒通常也会被转移。
第五章 克隆重组体的构建、转化
第一节 受体细胞 受体细胞（receptor cell）或称宿主细胞（host cell）：能摄取外源
DNA并使其稳定维持的细胞。 选择受体细胞的基本原则
便于重组DNA分子的导入 能使重组DNA分子稳定存在于细胞 便于重组子的筛选 遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长 安全性高，无致病性 内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量最低 在遗传密码的应用上无明显偏倚性 有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效分泌表达
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各种基因工程受体的特性
枯草杆菌
遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速，培养简单，不产 内毒素
遗传欠稳定，载体受体系统欠完备 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌
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各种基因工程受体的特性
链霉菌
抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素 遗传不稳定，生长相对缓慢 主要用于抗生素生产菌株的改良
2020/12/4
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各种基因工程受体的特性
大肠杆菌
•遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定 •产结构复杂、种类繁多的内毒素
•适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建， 是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌
2020/12/4
要 RecA重组蛋白的参与。因此受体细胞必须选择体内同源重组缺陷型的遗传表型，其相应的基因 型为
recA-、recB-、recC-.
遗传互补型
感染寄生缺陷型
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第五章 克隆重组体的构建、转化
第一节 受体细胞 常用的受体细胞
原核生物细胞 大肠杆菌（G-）、枯草杆菌（G+）、蓝细菌 真菌细胞 酵母菌 植物细胞 水稻、棉花、玉米、拟南芥等 动物细胞 小鼠L细胞、Hela细胞、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等
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第五章 克隆重组体的构建、转化
第二节 重组DNA分子导入宿主细胞 一、重组质粒DNA分子转化E.coli 1. Ca2+诱导转化
利用CaCl2处理E.coli，能够促进其对λ噬菌体DNA、质粒DNA的吸收，重 复性好，操作简便，适合成批制备感受态细胞
2020/12/4
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