细菌DNA的提取方法

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法:

试验试剂：

抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)

25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH5.2)

96%乙醇

70%乙醇

试验步骤：

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。

4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C 下沉淀。

7、以2,000rpm，离心10min。

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。

较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul 的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法：

试验步骤：

1、取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。

9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,2.5倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二种方法：

试验步骤：

1、真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀

2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

细菌基因组DNA的提取方法综述，提供了5种方法。

1 快速微量提取法

A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。

B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37o C水浴1hr。

C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。

D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。

2 蛋白酶/SDS法制备

先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE （50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris 饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头

O中。

将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH

2

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1) 细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。

2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE （pH8.0）中（用ddH

O也行)。

2

3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml