毛状根培养2
毛状根培养2
毛状根培养技术
毛状根培养技术
1
毛状根培养技术简介 毛状根诱导培养体系的建立 毛状根培养技术与中药生产 展望
2 3 4
什么是毛状根培养 ？
毛状根是一种多分枝的、生长迅速的不定根，
它是将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA转 化到植物细胞的T-DNA上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
毛状根培养技术是20世纪80年代发展起来的基
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
毛状根培养反应器
毛状根培养反应器
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的斑质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
毛状根诱导的分子机理
1
发根土壤杆菌识别受伤植 物释放的诱导物（乙酞丁 香酮等酚性物质）
2
发根土壤杆菌识别信号 分子后,向受伤细胞作趋 化性运动,并与宿主细胞 发生粘接。
4
T-DNA基因进人寄主细 胞的细胞核，并整合到核 基因组中,然后在寄主细 胞中表达,从植物的感染 点诱导毛状根.
3
实验1毛状根诱导和培养
准备工作
• 下周实验前，用YEB活化培养菌株 • 菌株：ＡＴＣＣ１５８３４ harboring
wild type agropine pRiA4b • 培养时间：30h until the OD 600 of
suspension is ca 0.8
THANKS FOR YOUR ATTENTION!
3.4 叶盘法产生毛状根的实验过程
4，需准备的下次实验的材料
• 1.MS固体培养基（不加激素，0.8%琼脂，pH6.0）,每 人4-6瓶（20—30mL果酱瓶）
• 2.MS 液体培养基，每组200mL（稀释活化菌液用） • 3.YEB 液体培养基，pH7. 共2,2升（全班用） • 4.YEB固体500mL（全班用） • 5.无菌水（每人至少4瓶）和空瓶1-2个/人。 • 6.每人无菌吸水纸和牛皮纸各一包（灭菌后供下次用） • 7.接种工具（镊子，手术刀等）包裹灭菌。
实验一， 毛状根的诱导和培养
实验目的
• 1.掌握毛状根产生的原理 • 2.掌握毛状根诱导和培养的方法 • 3.掌握毛状根鉴定的方法
Ri质粒ED C源自G virB AT-DNA
LB RB
Hairy root genes and opine synthase
Ri opine
catabolism
ori
1.毛状根产生的原理
2.毛状根产生过程
• 毛状根形成：
• 菌种活化培养—感 染-吸附到细胞伤 口附近—穿过细胞 壁,膜-质-进入细胞 核内进行插入整合 和表达—形成毛状 根。
3.毛状根的诱导方法
• 1.叶盘法 2.原生质体共培养 3.活体接种法(PPT 演 示)
褐脉少花龙葵毛状根
叶盘法（Horsch et al 1985）
毛状根
发根农杆菌诱导黄瓜毛状根的研究陈佳20072502613华南师范大学生命科学学院广州510630摘要：本实验用发根农杆菌对无菌黄瓜子叶侵染，诱导长出不定根。
并将不定根转入不同卡那霉素浓度的筛选培养基内筛选。
结果表明：MS+Cep500+Kana400的培养基筛选转化根效果最好，嫩根长出的毛状根平均长0.8cm，能明显看到黄瓜毛状根生长。
但总体上讲，黄瓜子叶的转化率并不高。
关键词：发根农杆菌；黄瓜；毛状根；卡那霉素Study on Inducing Cucumber Hairy Roots by AgrobacteriumRhizogenesChen Jia 20072502613College of Life Sciences of South China Normal University, Guangzhou, 510630 Abstract:The cucumber cotyledons were infected respectively by agrobacterium rhizogenes R160 and induced to grow adventitious roots. The results showed that the medium contain 400mg/L kanamycin have the best effect on screening the transformated one .It’s obvious that some hairy roots have growed and the average length is 0.8cm. Generally speaking, the conversion ratio is not high. Key word: Agrobacterium rhizogenes; Cucumber; Hairy Loot; Kanamycin含有Ri质粒的发根农杆菌对植物的侵染也是自然界存在的天然植物遗传转化系统。
第六章毛状根培养
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
2.激素自养性
毛状根的培养方法
具体培养方法
固体培养
•
成批培养 连续培养
液体培养法
两相培养法
•
•
大规模发酵培养
毛状根的筛选与鉴定
筛选：选择生长速度较快、分枝较多的毛状根 株系进行扩大培养 鉴定：
形态学水平：激素自养，根丛生，多分枝
多根毛，无向地性 细胞水平：冠瘿碱的测定 （硝酸银染色）
，
毛状根培养反应器
利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
发根农杆菌菌株的类型： 农杆碱型（agropine type） 胭脂碱型 章碱型
农杆菌菌株的筛选及活化
将菌株在液体培养基上培养（含乙酰丁香酮），
激活vir区的基因，为Ri质粒的转移提供先决条件
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
毛状根实验报告
一、实验目的1. 了解毛状根的生物学特性及生长规律。
2. 掌握毛状根的培养方法及实验操作技能。
3. 探究不同培养基、温度、光照等条件对毛状根生长的影响。
二、实验材料1. 植物材料：紫花苜蓿品种WL-525HQ2. 发根农杆菌：LBA9402、R16013. 培养基：MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基4. 药品与试剂：抗生素、温度计、pH计、紫外灯、移液器、培养皿、无菌操作台等三、实验方法1. 发根农杆菌的培养与活化：将发根农杆菌接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃恒温培养过夜。
次日，将菌液按1:100的比例稀释，涂布于含有抗生素的LB培养基平板上，37℃恒温培养过夜，获得单菌落。
2. 外植体准备：将紫花苜蓿品种WL-525HQ的茎段剪成1-2cm长，用70%乙醇消毒30秒，无菌水冲洗3次，再用0.1%氯化汞消毒10分钟，无菌水冲洗5次，最后将茎段切成0.5cm长的小段。
3. 毛状根诱导：将外植体接种于含有发根农杆菌的培养基中，置于28℃、光照强度为1500lx的培养箱中培养。
每隔3天更换一次培养基，持续培养30天。
4. 培养基筛选：将诱导出的毛状根分别接种于MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基中，观察毛状根的生长情况。
5. 温度、光照条件探究：将毛状根分别置于不同温度（20℃、25℃、30℃）和光照强度（1000lx、1500lx、2000lx）的培养箱中培养，观察毛状根的生长情况。
6. 数据统计与分析：对毛状根的生长情况（长度、直径、分枝数等）进行统计与分析。
四、实验结果1. 发根农杆菌培养结果：在含有抗生素的LB培养基平板上，成功获得单菌落。
2. 外植体诱导结果：接种外植体后，部分外植体在培养基上形成了毛状根。
3. 培养基筛选结果：在1/2MS培养基中，毛状根生长情况最好，长度、直径、分枝数均较高。
4. 温度、光照条件探究结果：在25℃、1500lx条件下，毛状根生长情况最佳。
第六章毛状根培养
到基础研究和大规模工业化生产的要求还需要进一步探讨
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。
2.激素自养性
毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。
3.遗传稳定性 4.可塑造性
毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。
发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
毛状根培养技术
毛状根培养技术
教学内容
1 毛状根培养技术简介 2 毛状根诱导培养体系的建立
33 毛状根培养、筛选和鉴定
4 毛状根培养技术与中药生产
5
展望
1. 毛状根培养技术简介
毛状根（hairy root）概念
毛状根：植物受伤后，被发根农杆菌感染，在 伤口处就会形成不定根，并产生多个分枝，呈 毛发状；这些不定根又被称为毛状根。
ori
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌Ri质粒
？什么是毛状根培养技术
➢毛状根培养技术是20世纪80年代发展起
来的基因工程和细胞工程相结合的一项 新技术。
➢利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes
发根农杆菌一种侵染性非常广泛的土壤细菌， 革兰氏阴性。发根农杆菌能侵染多种植物,诱发被 感染植物的受伤部位长出毛状根，其特征是迅速增 生、高度分化出大量不定根。
毛状根培养技术在获得药用植物次生代谢产物中的应用
２０２１ 年 ６ 月
景德镇学院学报
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３６No．
３
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Jun．
２０２１
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毛状根培养技术在获得药用植物
次生代谢产物中的应用
司春灿 ①,林 英
(景德镇学院 生物与环境工程学院,江西 景德镇 ３３３４００)
平,相对于正常植物根内次生代谢产物的量,增加量
并不是很大,可以通过正常的根培养来实现,这表明
需要更好的实验设计来进行毛状根的代谢工程.由
于毛状根主要在暗 环 境 下 培 养,一 些 与 光 合 作 用 相
关的代谢产物在发根内的含量并不高.相对于只需
要一到几天就能繁 殖 一 代 的 微 生 物 而 言,某 些 毛 状
状根技术对药用植物进行改良也是近些年的发展趋
势之一,主要有以下几种方式:
２．
２．
１ 毛状根再生植株
植物 被 发 根 农 杆 菌 侵 染 后 产 生 毛 状 根,通 过 添
养条件下,皂苷的产量显著提高 [１２].
２．
３ 毛状根与微生物共生产生次生代谢产物
微生物能够促进药用植物毛状根次生代谢产物
超量积累. WuJY 等 发 现,细 菌 Ba
种改良和良种选育 等 方 面 发 挥 着 重 要 作 用,但 是 不
①
化生产等优点,在诱 导 产 生 发 根 的 过 程 中 还 可 以 导
入外源基因,达到改良改进药用植物品种的目的 [３].
常见的中药材有 ３０％ 以上来源 于 药 用 植 物 的 根 部,
毛状根培养生产药用次级代谢产物
2毛状根生长机理 毛状根生长机理
2.1发根农杆菌Ri质粒及其作用机理
发根农杆菌属土壤农杆菌， 革兰氏阴性。发 根农杆菌能侵染多种植物, 诱发被感染植物的 受伤部位长出毛状根。 发根农杆菌之所以具 有这种致根性， 是因为它具有能诱导毛状根 产生的 Ri 质粒。Ri 质粒是发根农杆菌染色体 外的一个约250kb的大质粒， 在Ri质粒上有 T-DNA。当发根农杆菌感染植物时， Ri 质粒 上的 T-DNA 可以转化并插入到植物细胞的基 因组中，其整合和表达的结果是产生了大量的 毛状根。
4毛状根合成次生代谢产物 毛状根合成次生代谢产物
培养基进行培养，主要影响因素有 光照、温度、 PH 、培养基成分 （碳源、氮源、激素等）等，经过 培养毛状根产生并积累次级代谢产 物,经分离提取可做药品、色素、调 味品、香料、兴奋剂、杀虫剂等。
5结语 结语
随着毛状根诱导技术的不断 成熟，毛状根培养取得了显 著的发展，目前需要解决的 主要问题是如何进行大规模 培养，如何提高次级代谢产 物的产量。
badboy11植物被发根农杆菌感染后在伤口处就会形成不定根不定根除菌后能迅速生长传基因稳定生长迅速于培养次生代谢产物含量高等特点
毛状根培养生产药用 次级代谢产物
Bad Boy
1毛状根概念及特点 毛状根概念及特点
1.1 植物被发根农杆菌 感染后，在伤口处就会 形成不定根，不定根除菌后能迅速生长， 并 产生多个分枝， 呈毛发状， 该不定根又被称 为毛状根 。 1.2 毛状根具有遗传基因稳定、 生长迅速、 易 于培养、 次生代谢产物含量高等特点。关于 毛状根诱导的技术发展很快，特别是利用毛状 根大量生产药用植物活性成分的研究， 成为 研究热点。
3毛状根培养步骤 毛状根培养步骤 外植体的选择及处理 毛状根的转化 毛状根的鉴定除菌
《细胞工程》课程说明书
[4] http://61.187.179.69/ec2006/C217/kcms-1.htm
四、教学信息
教学目标
通过本课程的学习使学生掌握细胞工程的基本操作技术、原理及研究对象的特点，为从事生物学相关领域的研究奠定良好的基础。
扩展专题2:科研论文介绍-研读及撰写（2学时）
第17周
课程总结、扩展与答疑（2学时）
答疑
教学方法
与手段
通过教材进行基本内容讲授，多媒体辅助，小组讨论等教学手段相结合。
学习方法
课上听讲，要点分析，分组讨论，课堂小结，课后复习、浏览教学网站、去开放实验室实践。
五、实践教学（独立设课另安排）
六、成绩考核
平时成绩
思考与作业练习见课件
第3周
第3章植物组织与器官培养（4学时）
3.1植物组织培养（2学时）
3.2植物胚胎培养
3.3毛状根培养（2学时）
思考与作业练习见课件
第4周
第4章人工种子与植物脱毒（2学时）
4.1人工种子
4.2植物脱毒
第5周
第5章植物细胞培养与次级代谢产物制备（2学时）
第6章原生质体培养与诱变（2学时）
第6周
第7章细胞融合与体细胞杂交（4学时）
7.1细胞融合（2学时）
第7周
7.2体细胞杂交（2学时）
第8章多倍体与单倍பைடு நூலகம்植物（4学时）
8.1多倍体植物（2学时）
思考与作业练习见课件
第8周
8.2单倍体与纯合二倍体植物（2学时）
视频文献拓展等参考课件
第9周
劳动周
第10周
第9章植物离体受精（2学时）
毛状根培养生产药用次级代谢产物
Bad Boy
1毛状根概念及特点 毛状根概念及特点
1.1 植物被发根农杆菌 感染后，在伤口处就会 形成不定根，不定根除菌后能迅速生长， 并 产生多个分枝， 呈毛发状， 该不定根又被称 为毛状根 。 1.2 毛状根具有遗传基因稳定、 生长迅速、 易 于培养、 次生代谢产物含量高等特点。关于 毛状根诱导的技术发展很快，特别是利用毛状 根大量生产药用植物活性成分的研究， 成为 研究热点。
3毛状根培养步骤 毛状根培养步骤 外植体的选择及处理 毛状根的转化 毛状根的鉴定除菌
3.1外植体的选择及处理 外植体的选择及处理
3.1.1现已成功诱导出毛状根的植物外 植体材料有叶片、 茎段、 子叶、 愈伤组织等。 3.1.2 外植体材料预先在无激素的固 体培养基上培养1~3d， 可以提高毛 状根的诱导率。
4毛状根合成次生代谢产物 毛状根合成次生代谢产物
培养基进行培养，主要影响因素有 光照、温度、 PH 、培养基成分 （碳源、氮源、激素等）等，经过 培养毛状根产生并积累次级代谢产 物,经分离提取可做药品、色素、调 味品、香料、兴奋剂、杀虫剂等。
5结语 结语
随着毛状根诱导技术的不断 成熟，毛状根培养取得了显 著的发展，目前需要解决的 主要问题是如何进行大规模 培养，如何提高次级代谢产 物的产量。
2毛状根生长机理 毛状根生长机理
2.1发根农杆菌Ri质粒及其作用机理
发根农杆菌属土壤农杆菌， 革兰氏阴性。发 根农杆菌能侵染多种植物, 诱发被感染植物的 受伤部位长出毛状根。 发根农杆菌之所以具 有这种致根性， 是因为它具有能诱导毛状根 产生的 Ri 质粒。Ri 质粒是发根农杆菌染色体 外的一个约250kb的大质粒， 在Ri质粒上有 T-DNA。当发根农杆菌感染植物时， Ri 质粒 上的 T-DNA 可以转化并插入到植物细胞的基 因组中，其整合和表达的结果是产生了大量的
浅谈毛状根及在药用植物中的应用
2.1发根土壤杆菌诱导毛状根的过程
①发根农杆菌识别受伤植物释放的诱导物。 ②发根农杆菌识别信号分子后，向受伤细胞作趋化性
运动，并与宿主细胞发生粘接。 ③ Ri质粒的vir区基因被乙酰丁香酮等物质括化，使Ri
质粒上的T-DNA片段被切割下来并转入植物细胞。 ④T-DNA基因进入寄主细胞的细胞核并整合到核基因
②用反义技术来调控代谢途径：利用反义技术将 反义 DNA 或 RNA 片段导入植物细胞，使其某 一代谢途径关键酶的活性得到控制，从而影响 活性成分的含量。
医学ppt
3.2获得毛状根转基因植物
以Ri质粒为载体转入外源功能基因，获得药 用植物的转基因植株。
通过转基因技术，一、可以对克隆出的目的 基因进行功能验证；二、导入外源功能基因， 可以改善药用植物的某些特性。
毛状根及在药用植物中的应用
医学ppt
1
主要内容
1 2 3 34 5
3
毛状根简介及特点 形成过程及影响因素 培养技术的应用 存在的问题及解决方法 参考文献
医学ppt
1.1毛状根简介
植物被发根农杆菌感染后，在伤口处 就会形成不定根，不定根除菌后能迅速 生长，并产生多个分枝，呈毛发状，该 不定根又被称为毛状根。
次生代谢产物是指药用植物体内一大类 化合物。 它们是细胞生命活动或植物生长发育正 常运行的非必需小分子化合物。 其产生和分布通常有种属、器官、组织 以及生长发育时期的特异性。
医学ppt
药用植物器官培养生产次生代谢物的路线图
3.1.2提高毛状根生产能力的技术
研究药用 研究药用
= 植物毛状
植物毛状 根的目的
有两个非常主要的功能区即转移区T-DNA 区(即TL-DNA和TR-DNA)和致病区Vir区；
药用植物毛状根的诱导及其应用
药用植物毛状根的诱导及其应用植物毛状根培养是植物组织培养中的一种，因其不仅克服了植物生长缓慢、有效成分积累有限的不足，且具有不依赖外源植物激素等优点，近年来研究较多。
文章介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况，并总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用，旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据。
标签：毛状根；药用植物；次生代谢产物；发根农杆菌；生物转化1 药用植物毛状根的诱导1.1 毛状根的发根机制毛状根（hairy roots）是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染植物后，在植株创伤表面诱导产生的一种特殊表现型。
早在1907年，Smith和Townsend 就发现发根农杆菌能够诱导植物产生毛状根，此后，学者们发现无论是发根农杆菌还是根癌农杆菌A. tumefaciens，其致病原因均是由大分子质粒引起的[1-2]，但发根农杆菌的致病质粒与其他Ti质粒（根瘤诱导质粒）功能既有差异又有联系[3]。
直到1982年，美国科学家Chilton[4]发表文章阐述其发根机制：发根农杆菌中Ri质粒上T-DNA进入宿主植物细胞引发了毛状根的产生。
Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250 kb的大质粒，其上面存在2个与转化有关的功能区，即T-DNA（转移区）和Vir（致病区）。
T-DNA的主要功能是在转化时进入植物细胞并插入到寄主植物基因组中，表达决定毛状根生长和冠瘿碱合成的基因；Vir区的作用是协助T-DNA区完成转化。
Vir区上有7个操纵子VirA-G，轉化时，植物伤口产生小分子酚类化合物与VirA的表达产物结合，激活其他Vir基因，使T-DNA被剪切、转移并最终整合到宿主细胞基因组中。
因此，单子叶植物不能合成特异性小分子酚类化合物是其难以被侵染诱导出毛状根的主要原因[5-7]。
1.2 药用植物毛状根诱导情况目前，已有近百种药用植物成功诱导出毛状根，总结发现其中76%为草本植物，也有少量藤本及木本植物，比例分别占到7%，17%；在植物学分类方面，已诱导出毛状根的药用植物科属分类较为分散，其中豆科、茄科、菊科和唇形科占有相对较大的比例（表1）。
黄芩毛状根培养体系的研究-Ⅱ
黄芩毛状根培养体系的研究-Ⅱ黄芩（Radix scutellariae）是一种常用的中药材，其根具有较高的药用价值。
然而，由于黄芩的生长环境限制和人工种植困难，进一步研究黄芩的栽培技术成为重要的任务之一。
近年来，细胞培养技术的发展为黄芩栽培提供了新的途径。
在前期研究的基础上，本文将探讨黄芩毛状根培养体系的研究进展。
首先，本文选取了适合黄芩毛状根生长的培养基。
经过多次试验和改良，最终确定了一种富含植物生长调节剂的培养基配方，包括激素、氮源、炭源和无机盐等组分。
通过调整培养基的配方和浓度，使黄芩毛状根的生长得到了明显提升。
其次，本文研究了不同生长因子对黄芩毛状根生长的影响。
实验结果显示，外源植物生长调节剂对黄芩毛状根的生长具有显著的促进作用。
特别是生长素和赤霉素等植物生长调节剂，在一定浓度范围内，能够增加黄芩毛状根的长度和数量。
此外，光照、温度和湿度等环境因素也对黄芩毛状根的生长具有一定影响。
然后，本文探究了适宜黄芩毛状根生长的体外条件。
通过调整培养器的容积和通气量，优化了黄芩毛状根的培养条件。
结果表明，黄芩毛状根在较小的培养器中生长得更好，而过高或过低的通气量会影响其生长速度和品质。
此外，本文还研究了黄芩毛状根的营养需求和抗病性等方面的问题，为进一步改进黄芩毛状根培养体系提供了科学依据。
最后，本文对黄芩毛状根培养体系的应用前景进行了展望。
黄芩毛状根不仅可以作为中药材使用，还可以用于提取有效成分制备药物。
目前已有一些研究表明，黄芩毛状根具有一定的抗菌和抗炎作用，对多种疾病具有治疗效果。
因此，通过进一步研究和优化黄芩毛状根培养体系，有望提高其产量和质量，为黄芩的应用开发提供更多可能性。
综上所述，黄芩毛状根培养体系的研究具有重要的意义和应用价值。
通过不断优化培养条件和培养技术，有望提高黄芩毛状根的产量和质量，满足人们对黄芩的需求。
此外，黄芩毛状根的应用前景广阔，将为中药材的开发和利用带来新的机遇和挑战。
丛枝菌根真菌与胡萝卜毛状根双重培养体系研究
热带作物学报2020, 41(8): 1535 1542Chinese Journal of Tropical Crops丛枝菌根真菌与胡萝卜毛状根双重培养体系研究张金莲1,2，刘金华3，包涵4，李冬萍1，宋娟1，黄京华4*，陈廷速1*1. 广西农业科学院微生物研究所，广西南宁 530007；2. 厦门大学公共卫生学院，福建厦门 361102；3. 浙江养生堂天然药物研究所有限公司，浙江杭州 310007；4. 广西大学农学院，广西南宁 530001摘要：以发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）K599诱导胡萝卜产生毛状根，接种丛枝菌根（AM）真菌摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）建立双重培养体系，研究不同消毒方法、超声波、低温预处理和培养基pH对摩西斗管囊霉孢子萌发的影响及其与胡萝卜毛状根建立双重培养体系的最佳条件。
研究结果表明：消毒方法3孢子萌发率最高，孢子污染率最低，15 d孢子萌发率达48.88%，而污染率仅为9.98%；超声波处理能降低孢子污染率11.17%~14.53%；低温预处理可有效提高孢子的萌发率，4 ℃低温处理10 d和15 d效果较好，其萌发率分别为70%和65%；AM真菌孢子在水琼脂培养基萌发最佳pH为6.5，萌发率达到48.50%，pH<5.5或pH>8.0均抑制孢子萌发，pH 5.5和pH 8.0的萌发率分别为15.43%和16.06%。
消毒孢子先于水琼脂萌发后，再挑取萌发管多，菌丝较长的孢子并将菌丝生长方向正对毛状根方向进行转接，可以提高双重培养的成功率。
MSR培养基为双重培养的最优培养基。
胡萝卜毛状根与AM真菌双重培养可为菌根真菌繁殖及相关分子机理研究提供可行有效的途径。
关键词：胡萝卜毛状根；发根农杆菌；丛枝菌根真菌；摩西斗管囊霉；双重培养中图分类号：S154.3 文献标识码：AA Study to Develop an in Vitro Dual Culture System with Carrot Hairy Roots and Arbuscular Mycorrhizal FungiZHANG Jinlian1,2, LIU Jinhua3, BAO Han4, LI Dongping1, SONG Juan1, HUANG Jinghua4*,CHEN Tingsu1*1. Microbiology Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, Guangxi 530007, China;2. Public Health Care College, Xiamen University, Xiamen, Fujian 361102, China;3. Zhejiang Yangshengtang Institute of Natural Medication Coopration, Hangzhou, Zhejiang 310007, China;4. College of Agronomy, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530001, ChinaAbstract: Agrobacterium rhizogenes K599 was used to induce carrot hair roots. An in vitro dual culturing system with Funneliformis mosseae and carrot hairy roots was then developed, and factors including methods to obtain ax-enic, supersonic processing, chilling treatment and medium pH that might affect both AM fungal spores germination and dual culturing were optimized. It was found that the third axenic method resulted in the highest germination rate (48.88%) and the lowest contamination rate (9.98%) at 15 days. Supersonic processing helped reduce AM fungal spores’ contamination by 11.17% to 14.53%, while a chilling pretreatment at 4 ℃ for 10 days and 15 days increased the germination rate of AM fungal spores to 70% and 65%, respectively. In water agar, the highest germination rate was achieved at a pH of 6.5 (48.50%), whereas spore germination was inhibited when pH was lower than 5.5 or higher than 8.0, with germination rate decreased to 15.43% at pH 5.5 and 16.06% at pH 8.0. Furthermore, it was found that the success rate of dual culturing was enhanced when sterilized spores were first germinated on agar medium and long hy-phae were then selected for inoculation with their extension direction towards the growth direction of the carrot root. The MSR medium was found to be optimal for dual culture. The successful in vitro dual culture of carrot hairy roots and收稿日期 2019-09-20；修回日期 2019-11-06基金项目 国家自然科学基金项目（No. 31760137）；广西自然科学基金重点项目（No. 2019GXNSFDA245013）；广西科技基地和人才专项（桂科AD16380054）。
第六章毛状根培养
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
2.激素自养性
毛状根诱导的分子机理
1
发根土壤杆菌识别受伤植 物释放的诱导物（乙酰丁 香酮等酚性物质）
2
发根土壤杆菌识别信号 分子后,向受伤细胞作趋 化性运动,并与宿主细胞 发生粘接。
4
T-DNA基因进人寄主细 胞的细胞核，并整合到核 基因组中,然后在寄主细 胞中表达,从植物的感染 点诱导毛状根.
3
发根土壤杆菌Ri质粒上的 vir区（致病区）基因被 乙酰丁香酮等物质活化, 使Ri质粒上的T-DNA片段 被切割下来并转入植物细 胞,但vir区本身不转入。
无菌苗
诱导出的毛状根 进行液体培养
毛状根的诱导过程
无菌植株生长到一定时候,将植株的茎尖、叶片切去,剩
下茎秆和根部,在茎秆上划出伤口,将带Ri质粒的土壤杆 菌接种在伤口处和茎的顶部切口处,接种后继续培养被 感染的植株,经过一段时间（2一4周）的培养后,在接种 部位产生出毛状根。 诱导过程中可通过优化诱导条件，使毛状根生物量增殖 或有效成分含量增多。 要建立起正常的毛状根必须经过除菌以便获得无菌的毛 状根。通常用抗生素除菌即是：将毛状根从母体上切下 后移植到含抗生素的培养基上经数代转移直到完全无菌 为止。
因此，如何更好的开发和利用毛状根培育技术，使其能够达
到基础研究和大规模工业化生产的要求还需要进一步探讨
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
药用植物毛状根的诱导及其应用
药用植物毛状根的诱导及其应用植物毛状根培养是植物组织培养中的一种，因其不仅克服了植物生长缓慢、有效成分积累有限的不足，且具有不依赖外源植物激素等优点，近年来研究较多。
文章介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况，并总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用，旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据。
标签：毛状根；药用植物；次生代谢产物；发根农杆菌；生物转化1 药用植物毛状根的诱导1.1 毛状根的发根机制毛状根（hairy roots）是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染植物后，在植株创伤表面诱导产生的一种特殊表现型。
早在1907年，Smith和Townsend 就发现发根农杆菌能够诱导植物产生毛状根，此后，学者们发现无论是发根农杆菌还是根癌农杆菌A. tumefaciens，其致病原因均是由大分子质粒引起的[1-2]，但发根农杆菌的致病质粒与其他Ti质粒（根瘤诱导质粒）功能既有差异又有联系[3]。
直到1982年，美国科学家Chilton[4]发表文章阐述其发根机制：发根农杆菌中Ri质粒上T-DNA进入宿主植物细胞引发了毛状根的产生。
Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250 kb的大质粒，其上面存在2个与转化有关的功能区，即T-DNA（转移区）和Vir（致病区）。
T-DNA的主要功能是在转化时进入植物细胞并插入到寄主植物基因组中，表达决定毛状根生长和冠瘿碱合成的基因；Vir区的作用是协助T-DNA区完成转化。
Vir区上有7个操纵子VirA-G，轉化时，植物伤口产生小分子酚类化合物与VirA的表达产物结合，激活其他Vir基因，使T-DNA被剪切、转移并最终整合到宿主细胞基因组中。
因此，单子叶植物不能合成特异性小分子酚类化合物是其难以被侵染诱导出毛状根的主要原因[5-7]。
1.2 药用植物毛状根诱导情况目前，已有近百种药用植物成功诱导出毛状根，总结发现其中76%为草本植物，也有少量藤本及木本植物，比例分别占到7%，17%；在植物学分类方面，已诱导出毛状根的药用植物科属分类较为分散，其中豆科、茄科、菊科和唇形科占有相对较大的比例（表1）。
第六章毛状根培养
毛状根培养技术
教学内容
1
毛状根培养技术简介 毛状根诱导培养体系的建立
2
3 3 4
毛状根培养、筛选和鉴定
毛状根培养技术与中药生产
5
展望
1. 毛状根培养技术简介
毛状根（hairy root）概念
毛状根：植物受伤后，被发根农杆菌感染，在 伤口处就会形成不定根，并产生多个分枝，呈
毛发状；这些不定根又被称为毛状根。
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
2.激素自养性
。
受体材料的选择及处理
外植体：植物幼嫩的叶片、茎尖、分生组织等 ；或愈伤组织；或原生质体 外植体处理：在培养基中进行预培养
发根农杆菌感染的方法：
向植物体直接注射 与原生质体共培养
对植物外植体进行接种感染
毛状根的除菌方法
• 抗生素除菌法 抗生素除菌法是将毛状根转移至含有抗生素的 培养基上，经数代转移直到完全无菌为止，常 用的抗菌素有青霉素、头孢霉素等； • 温度除菌法 温度除菌法是将毛状根转移至不含有抗生素的 培养基上，经过39~40℃温度条件处理，再转 移到新培养基上
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes
发根农杆菌一种侵染性非常广泛的土壤细菌， 革兰氏阴性。发根农杆菌能侵染多种植物,诱发被 感染植物的受伤部位长出毛状根，其特征是迅速增
生、高度分化出大量不定根。
培养条件对新疆紫草毛状根生长及紫草素含量的影响
培养条件对新疆紫草毛状根生长及紫草素含量的影响芦韦华;潘颀;王芳;陈永芳;代宁波【摘要】Arnebia euchroma (Royle) Johnst hairy roots induced by Agrobacterium rhizogenes as test materials, the culture systems of A. euchroma hairy roots were established by two-stage liquid method at the first time. The results showed that it was beneficial to the growth of the hairy roots under the conditions which hairy roots inoculated with SH(no NH4+) liquid medium and pH 5. 8. Trained 12 days,hairy roots proliferation has increased as the highest multiples by an average of 10. 26 times; Hairy roots growth cycle was 25 to 30 days;The results suggested that the total shikonin and its derivatives contents in 4 models of macroporous adsorption resin were all higher than that in CK;For NKA-9,the sadsorption shikonin and its derivatives contents was 2. 38% as the most one that increased by 0. 97 times than CK. The results indicated that adding NKA-9 resin after cultured 10 days, the average shikonin and its derivatives was 3. 64% that increased by 3. 08 times than CK. The conclusion of the experiment is that the liquid cultured can make A. euchroma hairy roots have the qualities of rapid growth rates by the growing stage,and adding macro-porous adsorption resin can increase the content of shikonin and its derivatives by theproducing stage.%以发根农杆菌诱导的新疆紫草毛状根为试验材料,采用二阶段液体培养法,首次建立了新疆紫草毛状根培养技术体系.结果显示:采用SH无铵培养基、pH 5.8时有利于毛状根的生长.培养12 d时毛状根的增殖倍数达最高,平均10.26倍；毛状根生产的继代周期为25～30 d；4种树脂吸附的紫草素及其衍生物含量均较对照(不添加树脂)高,以NKA-9所吸附的紫草素及其衍生物含量最高,为2.38％,较对照提高0.97倍.培养10 d时添加NKA-9树脂,紫草素及其衍生物含量平均为3.64％,是对照的3.08倍.研究表明,生长阶段采用液体培养可以使新疆紫草毛状根快速增殖,生产阶段添加大孔吸附树脂能够提高紫草素及其衍生物含量.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2012(032)008【总页数】6页(P1686-1691)【关键词】新疆紫草;毛状根;液体培养;大孔吸附树脂;紫草素及其衍生物【作者】芦韦华;潘颀;王芳;陈永芳;代宁波【作者单位】新疆农业大学农学院,乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院,乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院,乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院,乌鲁木齐830052;新疆农业大学农学院,乌鲁木齐830052【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+3Abstract：Arnebia euchroma（Royle）Johnst hairy roots induced by Agrobacterium rhizogenes as test materials，the culture systems of A．euchroma hairy roots were established by two－stage liquid method at the first time．The results showed that it was beneficial to the growth of the hairy roots under the conditions which hairy roots inoculated with SH （no NH4＋）liquid medium and pH 5．8．Trained 12days，hairy rootsproliferation has increased as the highest multiples by an average of 10．26times；Hairy roots growth cycle was 25to 30days；The results suggested that the total shikonin and its derivatives contents in 4models of macroporous adsorption resin were all higher than that in CK；For NKA －9，the sadsorption shikonin and its derivatives contents was 2．38%as the most one that increased by 0．97times than CK．The results indicated that adding NKA－9resin after cultured 10days，the average shikonin and its derivatives was 3．64% that increased by 3．08times than CK．The conclusion of the experiment is that the liquid cultured can make A．euchroma hairy roots have the qualities of rapid growth rates by the growing stage，and adding macroporous adsorption resin can increase the content of shikonin and its derivatives by theproducing stage．Key words：Arnebia euchroma（Royle）Johnst．；hairy roots；liquid cultivation；macroporous resin；shikonin and its derivatives新疆紫草［Arnebia euchroma（Royle）Johnst．）］是中国传统药用紫草类植物中临床药效最好的一种，其中的主要成分紫草素广泛用于医药、食品、化妆品和高级印染等行业［1－2］。
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毛状根诱导的分子机理
1
发根土壤杆菌识别受伤植 物释放的诱导物（乙酞丁 香酮等酚性物质）
2
发根土壤杆菌识别信号 分子后,向受伤细胞作趋 化性运动,并与宿主细胞 发生粘接。
4
T-DNA基因进人寄主细 胞的细胞核，并整合到核 基因组中,然后在寄主细 胞中表达,从植物的感染 点诱导毛状根.
3
发根土壤杆菌Ri质粒上的 vir区（致病区）基因被 乙酞丁香酮等物质活化, 使Ri质粒上的T-DNA片段 被切割下来并转入植物细 胞,但vir区本身不转入。
2.激素自养性
3.遗传稳定性
4.可塑造性
与中药现代化生产
次生代谢产物的 规模化生产 生产药用植物 的活性成分
成功应用 于工业生 产的例子
药用植物人参、紫草、长春花、甜菜胡萝卜 (Daucuscarota)等植物的毛状根能够通过生 物反应器培养来进行其次生物质的规模化生 产。
展望
优：毛状根培养体系是一种非常有潜力的生产次生代谢物的
因此，如何更好的开发和利用毛状根培育技术，使其能够达
到基础研究和大规模工业化生产的要求还需要进一步探讨
毛状根培养反应器
毛状根培养反应器
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的斑质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中LOGO毛状 Nhomakorabea培养技术
毛状根培养技术
1
毛状根培养技术简介 毛状根诱导培养体系的建立 毛状根培养技术与中药生产 展望
2 3 4
什么是毛状根培养 ？
毛状根是一种多分枝的、生长迅速的不定根，
它是将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA转 化到植物细胞的T-DNA上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
毛状根培养技术是20世纪80年代发展起来的基
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
因工程和细胞工程相结合的一项新技术。
发根农杆菌Ri质粒
毛状根培养体系
除菌
无菌苗
诱导出的毛状根 进行液体培养
毛状根的诱导过程
无菌植株生长到一定时候,将植株的茎尖、叶片切去,剩
下茎秆和根部,在茎秆上划出伤口,将带Ri质粒的土壤杆 菌接种在伤口处和茎的顶部切口处,接种后继续培养被 感染的植株,经过一段时间（2一4周）的培养后,在接种 部位产生出毛状根。 诱导过程中可通过优化诱导条件，使毛状根生物量增殖 或有效成分含量增多。 要建立起正常的毛状根必须经过除菌以便获得无菌的毛 状根。通常用抗生素除菌即是：将毛状根从母体上切下 后移植到含抗生素的培养基上经数代转移直到完全无菌 为止。