微生物工程工艺原理 第四篇 发酵产物的提取与精制
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发酵产物的提取与精制
❖ 2、絮凝作用 ❖ 絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子
量聚电解质），在悬浮粒子之间产生架桥作用而使 胶粒形成粗大的絮凝团的过程。
❖ 常用的絮凝剂 ❖ 聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、
磷酸氢二钠
❖ 絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤 速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质 和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等， 提高了滤液质量
（一）凝聚和絮凝技术
❖ 凝聚和絮凝能有效改变细胞、菌体和蛋白质 等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使 它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。
❖ 常用于细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、 细胞的（分泌胞内产物）碎片以及蛋白质等 胶体粒子的去除。
❖ 但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两 个概念，其具体处理过程也是有差别的。
菌种对过滤速度影响
❖ 真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可 达10μm，发酵液容易过滤，不需特殊处理。 其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来， 故可采用鼓式真空过滤机过滤。
❖ 放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。 如链霉素发酵液菌丝仅0.5~1.0μm左右，还含 有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一 般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。
✓该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入
很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。
• 撞击破碎法
✓一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬
浮液冷却至-25˚C至-30 ˚C形成冰晶体， 利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细 胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由 于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物 的变形所引起的。
一般工艺过程
❖ 一般说来，下游加工过程可分为4个 阶段：培养液(发酵液)的预处理和固 液分离；初步纯化(提取)；高度纯化 (精制)；成品加工。
发酵产物提取与精制技术 发酵产物提取与精制工艺的设计
提取与精制的常用技术
蒸发浓缩技术是使溶剂蒸发而达到提高溶质浓度目的的操作。
蒸发 浓缩
常压蒸发浓缩 减压蒸发浓缩
提取与精制的常用技术
结晶技术是利用溶液达到过饱和状态而使溶质以结晶形式析出的操作。
结晶
降温结晶法 加热结晶法
提取与精制工艺的设计原则
1. 工艺设计须满足产品的纯度要求
例如：赖氨酸的生产
3. 工艺设计须尽可能降低生产成本 例如：耐高温淀粉酶的提取
喷雾干燥 固体酶制剂
淀粉酶发酵液 超滤除菌 超滤浓缩 液体酶制剂
沉淀法提取 冷冻干燥 固体酶制剂
提取与精制工艺的设计原则
4. 工艺设计须尽可能提高得率
例如：谷氨酸的生产
谷氨酸发酵液 分批等电点提取
离心分离 干燥 谷氨酸
谷氨酸发酵液 超滤除菌 真空浓缩
赖氨酸发酵液 超滤除菌
离子交换提取 真空浓缩
喷雾干燥 食品级赖氨酸
溶解 调节pH至5.0
脱色 重结晶 分离与干燥 医药级赖氨酸
提取与精制工艺的设计原则
2. 工艺设计须满足产品的稳定性要求 例如：活性干酵母的生产
干燥
加热干燥 冷冻干燥
为了保证活性干酵母的活性，须选择冷冻干燥工艺。
提取与精制工艺的设计原则
提取与精制的目的 提取与精制的常用技术 提取与精制工艺的设计原则
提取与精制的目的
利用分离技术，从发 酵醪中获得目标产物 粗品的过程。
提取
精制
目 的
利用分离技术，将目 标产物粗品进一步纯 化，获得较高纯度产 品的过程。
根据产品规格要求，采用各种分离技术，获得所需要的产品。
提取与精制的常用技术
提取 精制
等电点 沉淀法
微生物技术应用：第四章 微生物发酵产物的分离与纯化
三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化
应作好工序间的衔接工作，从加工产物质量、 产物收率与纯度的平衡、时间与经济性等角度出 发，对影响工艺流程整体纯化效果的加工条件进 行优化：
1 收率与纯度之间的平衡 2 经济性考虑 3 工艺放大 4 纯化过程中对产品的检测
1 收率与纯度之间的平衡
发酵产品有效成分分离纯化过程中，产品的 纯度与产率之间是一对矛盾的关系。比如，微生 物发酵产物为药品时，其有效成分的纯度是衡量 其质量优劣的重要指标，特别是非肠道药物，其 纯度的高低直接关乎用药的安全性。纯化产品产 率的提高往往伴随着纯度的下降，反之对产品纯 度要求的提高意味着纯化成本的提高和产物收率 的降低。
微生物发酵产物的分离纯化
第二节 分离纯化技术
一、细胞破碎技术 二、沉淀分离纯化技术 三、离心分离纯化技术 四、膜分离纯化技术 五、层析分离纯化技术 六、萃取技术 七、冷冻干燥技术
第二节 分离纯化技术
一、细胞破碎技术
（一）发酵液的预处理和固液分离 目的：分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核 酸和蛋白质的沉淀物)；除去部分可溶性杂质和 改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。 方法：高价无机离子的去除方法，杂蛋白质的去 除，发酵液的凝聚和絮凝。
一、建立分离纯化工艺的根据
1.微生物发酵产物的特点
➢另一个特点是欲提取的生物物质通常很不 稳定，遇热、极端pH、有机溶剂会引起失 活或分解。
➢发酵或培养都是分批操作、生物变异性大， 各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一 定的弹性。
一、建立分离纯化工艺的根据
2.原理
（1）物理性质 ① 力学性质：重力、离心力、筛分； ② 热力学性质：状态变化、相平衡； ③ 传质性质：粘度、扩散、热扩散； ④ 电磁性质：电泳、电渗析、磁化；
发酵产物的提取和精制工作
葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质等。
• ③其他真菌细胞壁主要由多糖组成，如几 丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。
（2）常用的细胞破碎方法
• 细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的 方式可分为机械法和非机械法两大类。
• 前者有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、 X-press法；
• 后者有酶解法、化学法、物理法、干燥法 等。
• 滤饼过滤中，过滤介质为滤布。悬浮液通过 滤布时，固体颗粒被滤布阻挡而逐渐形成滤 饼。滤饼至一定厚度时即起过滤作用。
（1）影响发酵液过滤的因素
• 发酵液属非牛顿性液体，粘度大，过滤速 度慢。
• 过滤速度与菌体细胞体积、发酵条件、未 利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期 等有关。
（2）改善发酵液过滤性能的方法
• ④助滤剂法：助滤剂如硅藻土吸附细菌细胞 改变滤饼结构，降低过滤阻力，加快过滤速 度。
• ⑤反应剂法：
3．细胞破碎与分离
• 微生物的代谢产物如果是胞内物质（如有 些酶制剂、干扰素、胰岛素等），那么首 先要收集菌体，进行细胞破碎。
• （1）微生物细胞壁的组成与结构： • ①细菌细胞壁： • ②酵母菌细胞壁比G+菌稍厚，主要成分是
• （3）含有色素、热源物质、毒性物质等有 机杂质。
• （4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、 有机溶剂、酶、机械力等敏感，不适宜条件 下易失活或分解。
2．提取和精制
• 提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度 的、符合质量标淮要求的发酵成品。
• 发酵产物存在形式不同，用途各异，产品 质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。
• ②变性法：加热变性、酸碱变性、有机溶 剂变性等。
• ③吸附法：吸附剂和沉淀剂的吸附作用。
• （3）色素及其他物质的去除
• ③其他真菌细胞壁主要由多糖组成，如几 丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。
（2）常用的细胞破碎方法
• 细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的 方式可分为机械法和非机械法两大类。
• 前者有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、 X-press法；
• 后者有酶解法、化学法、物理法、干燥法 等。
• 滤饼过滤中，过滤介质为滤布。悬浮液通过 滤布时，固体颗粒被滤布阻挡而逐渐形成滤 饼。滤饼至一定厚度时即起过滤作用。
（1）影响发酵液过滤的因素
• 发酵液属非牛顿性液体，粘度大，过滤速 度慢。
• 过滤速度与菌体细胞体积、发酵条件、未 利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期 等有关。
（2）改善发酵液过滤性能的方法
• ④助滤剂法：助滤剂如硅藻土吸附细菌细胞 改变滤饼结构，降低过滤阻力，加快过滤速 度。
• ⑤反应剂法：
3．细胞破碎与分离
• 微生物的代谢产物如果是胞内物质（如有 些酶制剂、干扰素、胰岛素等），那么首 先要收集菌体，进行细胞破碎。
• （1）微生物细胞壁的组成与结构： • ①细菌细胞壁： • ②酵母菌细胞壁比G+菌稍厚，主要成分是
• （3）含有色素、热源物质、毒性物质等有 机杂质。
• （4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、 有机溶剂、酶、机械力等敏感，不适宜条件 下易失活或分解。
2．提取和精制
• 提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度 的、符合质量标淮要求的发酵成品。
• 发酵产物存在形式不同，用途各异，产品 质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。
• ②变性法：加热变性、酸碱变性、有机溶 剂变性等。
• ③吸附法：吸附剂和沉淀剂的吸附作用。
• （3）色素及其他物质的去除
微生物工程工艺原理_发酵产物的提取与精制方法
率高于60 %。
提取抗生素和分离生物粒子
采用PEG/ Na2HPO4 体系提取丙酰螺旋霉素，最佳 萃取条件是pH= 8. 0～8. 5 ， PEG2000 (14 %) / Na2HPO4 (18 %) ,小试收率达69. 2 % ,对照的乙酸丁 酯萃取工艺的收率为53. 4 %
双水相和其他方法的集成
(4) 目标产物的分配系数一般大于3 ,大多数情况下,目标产
物有较高的收率。
(5) 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固 液分离方法相比,双水相分配技术可省去1～2 个分离步骤, 使整个分离过程更经济。
(6) 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。
6、双水相萃取的工艺流程
双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产 物的萃取; PEG的循环; 无机盐的循环。
7、双水相的应用举例
分离和提纯各种蛋白质(酶） 用PEG/ -(NH4) 2SO4 双水相体系,经一次萃取从α- 淀粉 酶发酵液中分离提取α - 淀粉酶和蛋白酶, 萃取最适宜条件 为PEG1000 ( 15 %) -(NH4) 2SO4 (20 %) ,pH = 8 ,α- 淀粉 酶收率为90 % ,分配系数为19. 6 ,蛋白酶的分离系数高达 15. 1。比活率为原发酵液的1. 5 倍,蛋白酶在水相中的收
(2-7) ×10-4
由以上特性可以看出，超临界流体兼有液体和气体的双 重特性，扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体溶剂相 比，可以更快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程 的实现。
2、超临界流体萃取原理
超临界萃取是利用SCF作为萃取剂，从液体和固体中萃取出
发酵产物提取与精制工作
溶性络合物，可消除对离子交换的影响。 • F3+离用黄血盐反应生成普鲁士监沉淀除去。
发酵产物的提取和精制工作
（2）杂蛋白的去除：
• ①沉淀法：利用蛋白质等电点进行沉淀， 或在酸碱性条件下加入阴离子阳离子进行 沉淀，或加入中性盐破坏蛋白质水化层进 行沉淀。
• ②变性法：加热变性、酸碱变性、有机溶 剂变性等。
丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。
发酵产物的提取和精制工作
（2）常用的细胞破碎方法
• 细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的 方式可分为机械法和非机械法两大类。
• 前者有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、 X-press法；
• 后者有酶解法、化学法、物理法、干燥法 等。
发酵产物的提取和精制工作
• ①机械法：
• （3）含有色素、热源物质、毒性物质等有 机杂质。
• （4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、 有机溶剂、酶、机械力等敏感，不适宜条件 下易失活或分解。
发酵产物的提取和精制工作
2．提取和精制
• 提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度 的、符合质量标淮要求的发酵成品。
• 发酵产物存在形式不同，用途各异，产品 质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。
• 发酵液属非牛顿性液体，粘度大，过滤速 度慢。
• 过滤速度与菌体细胞体积、发酵条件、未 利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期 等有关。
发酵产物的提取和精制工作
（2）改善发酵液过滤性能的方法
• 发酵液难过滤时，需改善过滤性能，降低 滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。
• 改善发酵液性能的方法有调酸、热处理、 添加凝聚剂、反应剂、助滤剂等。
活性炭、烧结陶瓷、烧结金属等，它们填充 在过滤器内构成过滤层，悬浮液通过滤层时， 固体颗粒被滤层颗粒阻拦或吸附，滤液得以 澄清。 • 滤饼过滤中，过滤介质为滤布。悬浮液通过 滤布时，固体颗粒被滤布阻挡而逐渐形成滤 饼。滤饼至一定厚度时即起过滤作用。
发酵产物的提取和精制工作
（2）杂蛋白的去除：
• ①沉淀法：利用蛋白质等电点进行沉淀， 或在酸碱性条件下加入阴离子阳离子进行 沉淀，或加入中性盐破坏蛋白质水化层进 行沉淀。
• ②变性法：加热变性、酸碱变性、有机溶 剂变性等。
丁质或纤维素强度比细菌和酵母菌高。
发酵产物的提取和精制工作
（2）常用的细胞破碎方法
• 细胞破碎的方法很多，根据外加作用力的 方式可分为机械法和非机械法两大类。
• 前者有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、 X-press法；
• 后者有酶解法、化学法、物理法、干燥法 等。
发酵产物的提取和精制工作
• ①机械法：
• （3）含有色素、热源物质、毒性物质等有 机杂质。
• （4）发酵产物稳定性低，对热、酸、碱、 有机溶剂、酶、机械力等敏感，不适宜条件 下易失活或分解。
发酵产物的提取和精制工作
2．提取和精制
• 提取和精制是为了从发酵液中获得高纯度 的、符合质量标淮要求的发酵成品。
• 发酵产物存在形式不同，用途各异，产品 质量要求不同，分离纯化步骤有所不同。
• 发酵液属非牛顿性液体，粘度大，过滤速 度慢。
• 过滤速度与菌体细胞体积、发酵条件、未 利用完的培养基浓度、消沫剂、发酵周期 等有关。
发酵产物的提取和精制工作
（2）改善发酵液过滤性能的方法
• 发酵液难过滤时，需改善过滤性能，降低 滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。
• 改善发酵液性能的方法有调酸、热处理、 添加凝聚剂、反应剂、助滤剂等。
活性炭、烧结陶瓷、烧结金属等，它们填充 在过滤器内构成过滤层，悬浮液通过滤层时， 固体颗粒被滤层颗粒阻拦或吸附，滤液得以 澄清。 • 滤饼过滤中，过滤介质为滤布。悬浮液通过 滤布时，固体颗粒被滤布阻挡而逐渐形成滤 饼。滤饼至一定厚度时即起过滤作用。
微生物技术应用：第四章 微生物发酵产物的分离与纯化
电泳
凝胶电泳 等电点电泳 等速电泳 区带电泳
筛分、电荷
蛋白质、核酸
筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸
筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸
筛分、电荷、浓度差 蛋白质、核酸
离心 离心过滤 离心沉降 超离心
离心力、筛分 离心力 离心力
菌体、菌体碎片 菌体、细胞 蛋白质、核酸、糖类
二、分离纯化的基本过程
1.一般工艺过程
三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化
应作好工序间的衔接工作，从加工产物质量、 产物收率与纯度的平衡、时间与经济性等角度出 发，对影响工艺流程整体纯化效果的加工条件进 行优化：
1 收率与纯度之间的平衡 2 经济性考虑 3 工艺放大 4 纯化过程中对产品的检测
1 收率与纯度之间的平衡
发酵产品有效成分分离纯化过程中，产品的 纯度与产率之间是一对矛盾的关系。比如，微生 物发酵产物为药品时，其有效成分的纯度是衡量 其质量优劣的重要指标，特别是非肠道药物，其 纯度的高低直接关乎用药的安全性。纯化产品产 率的提高往往伴随着纯度的下降，反之对产品纯 度要求的提高意味着纯化成本的提高和产物收率 的降低。
一、建立分离纯化工艺的根据
1.微生物发酵产物的特点
➢另一个特点是欲提取的生物物质通常很不 稳定，遇热、极端pH、有机溶剂会引起失 活或分解。
➢发酵或培养都是分批操作、生物变异性大， 各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一 定的弹性。
一、建立分离纯化工艺的根据
2.原理
（1）物理性质 ① 力学性质：重力、离心力、筛分； ② 热力学性质：状态变化、相平衡； ③ 传质性质：粘度、扩散、热扩散； ④ 电磁性质：电泳、电渗析、磁化；
三、分离纯化方法的综合运用与工艺优化
发酵产物的提取和精制
固，提高滤液质量。但草酸价格较贵，应注意回收。
②要除去铁离子，可加入黄血盐，与铁离子形成普鲁士蓝沉淀。
内容
1.概述 2.原料与预处理 3.固液分离 4.细胞破碎 5.初步纯化 6.精细纯化 7.成品加工
发酵液或多或少存在悬浮固体，需要使 用固液分离手段使清液和固态物质得到 很好的分离。常用的方法是过滤和离心 分离。
分离因数的极限值取决于转鼓材料的机械强度， 一般超高速离心机的结构特点是特性来选择离心机。
0.01 μm
0.1 μm
10 μm
100 μm
1 mm
10 mm
胶体
微粒
细粒
中等颗粒 过滤离心机
大颗粒
卧螺沉降离心机
超滤+微滤 离心机
碟式或管式离心机
副产物
干燥
细胞产品
目标产物
图5-1 目的产物提取与精制过程的一般工艺流程
整个分离路线一般可分为以下五个主要 步骤：预处理、固液分离、初步纯化、 精细纯化、成品加工。
预处理：采用加热、调整pH、絮凝等措施和单元操作改变 发酵液的理化性质，为固液分离作准备。
固液分离：采用珠磨、匀浆、酶溶、过滤、离心等单元操 作除去固相，获得包含目的产物的液相，供进一步分离纯 化用。
通过有效地改变菌体细胞和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使其 凝聚成较大的颗粒，便于过滤。
（1）凝聚：在中性盐的作用下，由于胶体粒子之间双电子层排斥电 位的降低，而使胶体体系不稳定出现聚集的现象。
发酵液中的菌体细胞或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电 荷。在生理pH下，发酵液中的菌体或蛋白质常常带有负电荷，由 于静电吸引作用，在界面上形成了双电层，这种双电层的结构使 胶粒间不容易聚集而保持稳定的分散状态。
②要除去铁离子，可加入黄血盐，与铁离子形成普鲁士蓝沉淀。
内容
1.概述 2.原料与预处理 3.固液分离 4.细胞破碎 5.初步纯化 6.精细纯化 7.成品加工
发酵液或多或少存在悬浮固体，需要使 用固液分离手段使清液和固态物质得到 很好的分离。常用的方法是过滤和离心 分离。
分离因数的极限值取决于转鼓材料的机械强度， 一般超高速离心机的结构特点是特性来选择离心机。
0.01 μm
0.1 μm
10 μm
100 μm
1 mm
10 mm
胶体
微粒
细粒
中等颗粒 过滤离心机
大颗粒
卧螺沉降离心机
超滤+微滤 离心机
碟式或管式离心机
副产物
干燥
细胞产品
目标产物
图5-1 目的产物提取与精制过程的一般工艺流程
整个分离路线一般可分为以下五个主要 步骤：预处理、固液分离、初步纯化、 精细纯化、成品加工。
预处理：采用加热、调整pH、絮凝等措施和单元操作改变 发酵液的理化性质，为固液分离作准备。
固液分离：采用珠磨、匀浆、酶溶、过滤、离心等单元操 作除去固相，获得包含目的产物的液相，供进一步分离纯 化用。
通过有效地改变菌体细胞和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使其 凝聚成较大的颗粒，便于过滤。
（1）凝聚：在中性盐的作用下，由于胶体粒子之间双电子层排斥电 位的降低，而使胶体体系不稳定出现聚集的现象。
发酵液中的菌体细胞或蛋白质等胶体粒子的表面，一般都带有电 荷。在生理pH下，发酵液中的菌体或蛋白质常常带有负电荷，由 于静电吸引作用，在界面上形成了双电层，这种双电层的结构使 胶粒间不容易聚集而保持稳定的分散状态。
第十二章发酵产物的提取与精制概论(6)
物 些目标产物存在于细胞内部。目前重组
的 提
DNA技术表达的产品（如肤岛素、干扰素、
取 白细胞介素等），都是胞内产物。首先必
与 精 制
须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进 一步提取。
概
论
第四篇 发酵产物的提取与精制
第
十
二 章
（一）细胞壁的组成与结构
发 酵
细胞破碎 用物理、化学、酶或机械的方
产 法来破坏细胞壁或细胞膜。细胞壁的破碎
制 温度；细胞的变化(因处理时间的不同面引起
概 论
的)也同样影响着对破碎的敏感度。
第四篇 发酵产物的提取与精制
第
十
二 章
破碎方法
发 酵 产
细胞的破碎按照是否外加作用力可分为机 械法与非机械法两大类；机械法中高压匀
物 浆器和珠磨机在工业上得到应用，超声波
的 提
法和非机械法大多处在实验室应用阶段。
取
与
发 酵
（1）特点
产
物 ①自动化程度高、操作连续、处理量大；
的 提 取
②适合于固体含量较大（＞10%）的悬浮液 的分离；
与 ③一般不适合于菌体较小和粘度较大的细菌
精 制 概
发酵液的过滤。（可以离心） ④所得固相的干度较差。
论
第四篇 发酵产物的提取与精制
第 十 （2）工作过程 二 章
发 酵 产 物 的 提 取 与 精 制 概 论
第
十 三、菌体分离方法
二
章 （一）菌体和发酵醪的分离方法
发 酵
离心 过滤
产 物
（二）离心分离
的 提
离心分离可分为以下三种形式：
取 ①离心沉降
与 精 制
②离心过滤 ③离心分离和超离心
《发酵工艺》项目9：发酵产物提取与精制
• 澄清过滤，也称为深层过滤，指颗粒沉积在床层内部的孔道壁上 而并不形成滤饼的过滤方式。
• （2）过滤介质
• 工业上常用的过滤介质有织物状介质、粒状介质 和多孔固体介质等类型。
• 织物状介质包括天然或合成纤维、金属丝等编织 而成的滤布或滤网，是工业生产中最常用的过滤 介质
• 粒状介质有硅藻土、石砾、细砂、锯屑、活性炭、 玻璃渣等，常用于过滤固体含量较少的悬浮液。
• 1.蒸馏 ：蒸馏可分为简单蒸馏和精馏。
• 拉乌尔定律指出：混合液中蒸汽压高（沸点低） 的组分，在气相中的含量总是比液相中高；反之， 蒸汽压低（沸点高）的组分，在液相中含量总是 比气相中高。一般把气相中酒精含量与液相中酒 精含量的比值称为酒精的挥发系数（用K表示）。 实验数据表明，在酒精浓度达到97.6%（体积分数） 前，酒精的挥发系数总是大于1，用常规的蒸馏方 法可以使酒精变浓。
括物理法（超声破碎、渗透压冲击、冻结融 化等）、化学法和酶溶法等
分类
作用机理
研磨法 固体剪切作用 机 械 法 高压匀浆法 液体剪切作用
撞击破碎法 固体剪切作用
特点
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活 ，浆液分离困难
可达较高破碎率，可较大规模操作，不适合革兰氏阳性菌和 丝状菌
破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感产物不适应
• 多孔固体介质有多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料 等。
• （3）过滤设备 • 目前生物工程行业，常用于液-固过滤分离的设备有板框压滤机、
叶片过滤机及真空转鼓过滤机
板框压滤机结构 1-压紧装置；2-可动头；3-滤框；4-滤板；5 固定头；6-滤液出口；7-滤液进口；8-滤布
• 板框压滤机由滤板、滤框和压紧装置及支架等部分组成，许多块 滤板和滤框交替排列，滤板两侧过滤面上罩有滤布。
发酵工程 11 发酵产物的提取与精制
的分配，萃取剂与溶质间的化学反应包括离子
交换和络合反应等。
2、双水相萃取 溶剂萃取法，一般是将水溶液中的溶质萃取到 有机溶剂中，这会使许多生物大分子在有机溶 剂中失活变性。双水相系统中多聚物的水溶液
给生物分子提供温和的环境。双水相萃取可直
接从细胞破碎匀浆中萃取蛋白质，无需分离细 胞碎片。
3、反胶束提取纯化技术 将表面活性剂溶于非极性溶剂（有机溶剂）中， 并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶 剂内形成聚集体，这种聚集体即为反胶束。在
常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、 磷酸钠、磷酸钾、氯化钾、醋酸钠、硫氰 化钾等。在蛋白质的盐析中，以硫酸铵应 用最广。
盐析的操作：pH
蛋白质、酶等经过盐析沉淀分离后，产品 夹带有盐分，需脱盐处理。常用的方法有 透析法、电渗析法和葡聚糖凝胶过滤法等。
3、有机溶剂沉淀分离法 与无机沉淀剂相比，有机沉淀剂的优点在于： （1）选择性比较高，即一定浓度的有机沉淀 剂只沉淀分离某一种或某一类溶质组分；（2） 沉淀后所得产品不需脱盐，残留的沉淀剂通过 挥发而易于去除。 有机沉淀剂的缺点是对有些生物大分子如酶类 有失活作用，因而常需在低温下操作。
反 渗 透 RO ） 压 力 差 （ 2-10M P a） （ 透 析 （ DS） 浓度差
电 渗 析 ED ） 电 位 差 （
2、膜分离技术的特点 膜分离技术一般在常温下操作，不需加热，被 分离的物质能保持原来的性质，能保持生物物 质的活性。其选择性强，操作过程简单，适用
范围广。膜分离技术在分离物质过程中不涉及
一、发酵液的预处理
发酵液的特性：
①菌体细小且可压缩，其相对密度与培养
液相似；
②发酵液粘稠，大多为非牛顿流体； ③发酵产物浓度底，处理体积大。
发酵产物的提取精制PPT课件
2．各种分离纯化方法的使用程序
生化物质的分离都是在液相中进行，故分离 方法主要根据物质的分配系数、分子量大小、离子电 荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基础。
例如：纯化某一两性物质时，前一步已利用 该物质的阴离子性质，使用了阴离子交换层析法，下 一步提纯时再应用其阳离子性质作层析或电泳分离便 会取得较好分离效果。
缺点：
间歇操作，不能绝对密封 劳动强度大，随着滤饼堆厚，过滤速度下降
板框过滤机
型号：BAS、BMS、BMY、BAY
BAY40—635/25 B——板框 A——暗流 Y——油压 40——过滤面积m2 635——框内尺寸 25——板框厚度mm
板框过滤机
影响过滤的因素：
2．各种分离纯化方法的使用程序
如有些杂质在各种条件下带电荷性质可能与目 的物相似，其分子形状与大小与目的物相差较大，而 另一些杂质的分子形状与大小可能与目的物相似，但 在某条件下与目的物的电荷性质不同，在这种情况下， 先用分子筛，用离心或膜过滤法除去分子量相差较大 的杂质，然后在一定pH值和离子强度范围下，使目的 物变成有利的离子状态，便能有效地进行层析分离。
难过滤的菌体，可加溶菌酶 在保持产品特性稳定的范围内，pH尽量调节至
等电点
（二）细胞破碎及分离—获得胞内产物
细胞破碎方法
机械法：高速组织捣碎机、匀浆器 化学法：有机溶剂、表面活性剂改变或破坏细胞膜结构 生物法：烈性噬菌体、酶法 物理法：压力差、超声波、温度差
工业上：常用匀浆器、球磨机处理细胞碎片
提高过滤效率的方法
添加电解质、絮凝剂、硅藻土等助滤剂 开始过滤时，压力差不能太大，以免压紧、压
实颗粒，阻塞滤孔，稳定后均匀加料，保持滤 饼疏松。 降低滤液黏度，对热不敏感的高黏度物质，可 用加热等方法降低黏度 适当提高滤饼两侧的压力差，但是有限度
教学课件第四篇发酵产物的提取与精制
以使破碎效率最高； 破碎过程产生热能，要注意热交换； 适用于绝大多数微生物细胞的破碎； 珠磨法的破碎率一般控制在80%。
超声波破碎
1、工作原理 在超声波的作用下，液体发生空化作用，空穴的形成，增大和闭合产
生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎 2、影响因素：声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型 3、特点： 1）适应于实验室规模的应用（操作简单、液量损失少，可加冰或加
（2）影响破碎率的因素： 细胞壁、 压力、温度、通过匀浆器的次数 不适合丝状真菌及包含体的基因工程菌
珠磨
工作原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂，即微球（玻璃 小珠、石英砂、氧化铝d<1mm）一起快速搅拌，细胞与微球之间互 相碰撞、剪切，使细胞破碎，释放内含物。
特点： 微球粒径与目标细胞的直径比应在30-100之间，适宜的微球粒径，可
（2）絮凝剂（按官能团分） 阴离子、阳离子、非离子 丙烯酰胺经不同的改性可成为上述三种类型之一
絮凝剂比凝聚剂贵 絮凝剂的最佳使用剂量：粒子表面积约有一半被聚合物覆
盖时所用的絮凝剂量。
4、添加助滤剂：
一般为惰性助滤剂：是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒 状物质
作用：助滤剂表面具有吸附胶体的能力，并且由此助滤剂颗粒形成 的滤饼具有格子型结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，可以保持 良好的渗透性 使用方法（1）：在滤布上预涂，作为过滤介质使用
三、下游加工过程设计应遵循的基本原则 1、时间短 2、温度低 3、pH适中 4、清洁卫生
四、发酵产物提取与精制的过程
1、对未知的发酵产品提取的步骤 （1）确定发酵产物的类型 （2） 确定发酵产物的稳定性
2、发酵产物提取和精制过程包括的阶段
（1）发酵液的预处理
超声波破碎
1、工作原理 在超声波的作用下，液体发生空化作用，空穴的形成，增大和闭合产
生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎 2、影响因素：声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型 3、特点： 1）适应于实验室规模的应用（操作简单、液量损失少，可加冰或加
（2）影响破碎率的因素： 细胞壁、 压力、温度、通过匀浆器的次数 不适合丝状真菌及包含体的基因工程菌
珠磨
工作原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂，即微球（玻璃 小珠、石英砂、氧化铝d<1mm）一起快速搅拌，细胞与微球之间互 相碰撞、剪切，使细胞破碎，释放内含物。
特点： 微球粒径与目标细胞的直径比应在30-100之间，适宜的微球粒径，可
（2）絮凝剂（按官能团分） 阴离子、阳离子、非离子 丙烯酰胺经不同的改性可成为上述三种类型之一
絮凝剂比凝聚剂贵 絮凝剂的最佳使用剂量：粒子表面积约有一半被聚合物覆
盖时所用的絮凝剂量。
4、添加助滤剂：
一般为惰性助滤剂：是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒 状物质
作用：助滤剂表面具有吸附胶体的能力，并且由此助滤剂颗粒形成 的滤饼具有格子型结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，可以保持 良好的渗透性 使用方法（1）：在滤布上预涂，作为过滤介质使用
三、下游加工过程设计应遵循的基本原则 1、时间短 2、温度低 3、pH适中 4、清洁卫生
四、发酵产物提取与精制的过程
1、对未知的发酵产品提取的步骤 （1）确定发酵产物的类型 （2） 确定发酵产物的稳定性
2、发酵产物提取和精制过程包括的阶段
（1）发酵液的预处理
发酵产物的提取与精制..120页PPT
发酵产物的提取与精制..
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
谢谢你的阅读
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
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7、发酵产物的提取与精制
固液分离
• 因为微生物和培养液的密度差小，固体颗粒也小， 离心时通常需要很大的旋转速度，能耗大。 • 此外，像高分子多糖发酵液那样黏度高的发酵液， 用离心法分离是非常困难的。 • 过滤分离：悬浮液通过过滤介质时，固体颗粒被截 留从而实现与液体的分离。滤材通常是滤布、陶瓷 膜、高分子膜等。按过滤机理不同可分为两种：
膜分离技术
• 膜分离：利用具有选择透过性的薄膜，根据膜孔径 的大小使物质透过或被截留，从而达到物质分离的 目的。基本上是一个非常节省能量的过程。
方法 膜结构 应用 微孔过滤 0.02~10μm 无菌过滤；细胞的分离浓缩 超滤 0.001~0.02μm 蛋白、多糖等高分子的分离浓缩 纳米过滤 <2nm 脱盐 反渗透 透析 电渗析 <1nm 氨基酸等低分子物质的分离浓缩； 海水淡化 大分子溶液的脱盐 氨基酸分离；去离子；海水淡化； 废水处理
• 其优点是沉淀不需进行脱盐处理，缺点是容易使蛋 白质变性，并且溶剂的消耗量大，回收率低。 • 为了防止蛋白质变性，要在低温（<0℃）下进行操 作，温度越低，收率越高。
• 因为形成沉淀的推动力是蛋白质分子间的静电引力 和偶极子的范德华力，所以溶液的pH值要控制在 等电点附近（蛋白质分子间排斥力最小）。
• 微生物细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，细胞壁 的形状和强度取决于其组成以及它们之间相互交联 的程度。细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程 度高的是最难破碎的。
革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌
酵母菌
霉菌
壁厚nm 层次 组成
20~80 单层 肽聚糖（4090%）；胞壁 酸
10~13 多层 肽聚糖（510%）；脂多 糖
• 通常是向蛋白质溶液中添加高浓度的(NH4)2SO4、 Na2SO4等无机盐，使蛋白质达到过饱和而析出。