微生物工程工艺原理 第十三章 发酵产物的提取与精制方法

国内自20世纪80 年代起也开展了双水相萃取技术研究。


2、双水相的形成
将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物 浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这 就是双水相体系

形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分 子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从 而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。一般认为

萃取效率是以分配定律为基础的

Nernst 分配定律（1891）：在一定温度下，当某一溶
质在两种互不相溶的溶剂中分配达到平衡时，则该溶质
在两相中的浓度之比为一常数，称为分配系数。
C 对萃取操作来讲：萃取相和萃余相中溶质的浓度之
B
K CA
比就是分配系数；用K表示。 在达到平衡时，设溶质在萃取相中浓度为CA ；在萃 余相中为CB 。则：
只要两聚合物水溶液的憎水程度有差异，混合时就可发生
相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就大。

3、常用的双水相体系
高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG) / 葡聚糖(简称
Dextran) 和PEG/ Dextran


高聚物/无机盐体系：硫酸盐体系。常见的高聚物/ 无机 盐体系为: PEG/ 硫酸盐或磷酸盐体系。
(3) 吸附法
P1
P2 1 T1
3
T2
2 4
T1=T2
P1=P2
1—萃取槽； 2—吸附剂； 3—分离槽； 4—泵；
超临界萃取的三种典型流程
6、应用举例

作业：

什么叫双水相萃取，影响双水相萃取的因素有
哪些

什么是反胶团，影响反胶团萃取的因素有哪些 超临界流体萃取的原理是什么
的选择依赖于萃取过程的目的和方向，在PEG/DEX系统
中，蛋白质的分配系数随着DEX相对分子量的增加而增加。 若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于PEG聚合物，应 降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白 质收率，则平均分子量应增加。



（2） pH 值的影响
改变两相的电位差
如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大，则蛋白质在 两相中分配越不均匀。
常见的超临界流体 CO2、氨、乙烯、乙烷、丙烷、丙烯、乙醇、丁醇、 水等 由于CO2的临界温度、临界压力较易达到，而且
化学性质稳定，无毒、无臭、无色、无腐蚀性，容易
得到较纯产品，因此是最常用的超临界流体。
3、某些常用流体的物理特征
4、超临界流体萃取设备
SFE的基本流程是： 由钢瓶提供高纯液体 （CO2）经高压泵系统， 流入保持在一定温度 （高于Tc）下的萃取池。 在萃取池中可溶于SCF 的溶质扩散分配溶解在 SCF中，并随SCF一起 流出萃取池，经阻尼器 减压获升温后进入收集 器，多余的SCF排空或 循环使用。

pH 值的变化也会导致组成体系的物质电性发生变化，也 会使被分离物质的电荷发生改变，从而影响分配的进行。


（3）离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响
在双水相聚合物系统中，加入电解质时，其阴阳离 子在两相间会有不同的分配。同时，由于电中性的约束, 存在一穿过相界面的电势差(Donnan 电势) ,它是影响荷电
相的分离并节省了能源开支。


5、双水相萃取技术的特点
(1) 系统含水量多达75 %～90 % ,两相界面张力极低(10 7～10 – 4
N· - 1) ,有助于保持生物活性和强化相际间的质 m
量传递

(2) 分相时间短(特别是聚合物/ 盐系统) ,自然分相时间一般 只有5～15min。

(3) 双水相分配技术易于连续化操作。

(4) 目标产物的分配系数一般大于3 ,大多数情况下,目标产
物有较高的收率。

(5) 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固 液分离方法相比,双水相分配技术可省去1～2 个分离步骤, 使整个分离过程更经济。

(6) 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。


6、双水相萃取的工艺流程


例如：链霉素在中性下能与二异辛基磷酸酯结合，从而在水相萃
取到三氯乙烷中，然后在酸性下再萃取到水相



二、双水相萃取
1、发展历史
始于20 世纪60年代,从1956 年瑞典伦德大学Albertsson
发现双水相体系

1979 年德国GBF 的Kula 等人将双水相萃取分离技术应 用于生物产品分离
大分子如蛋白质和核酸等分配的主要因素。同样，对于粒
子迁移也有相似的影响，粒子因迁移而在界面上积累。故 只要设法改变界面电势，就能控制蛋白质等电荷大分子转 入某一相。

（4）温度的影响
分配系数对温度的变化不敏感
成相聚合物对蛋白质有稳定化作用,所以室温操作活性


收率依然很高,而且室温时粘度较冷却时(4 ℃) 低,有助于
5、超临界流体萃取的典型流程及应用
1. 超临界流体萃取的典型流程 (1) 等温法
P1 2 P2 T1 1 T2 3 4 4 溶质 T1 5 溶质 1 3 T2 2
(2) 等压法
P1
P2
T1=T2
P1>P2
T1<T2
P1=P2
1—萃取槽； 2—膨胀阀； 3—分离槽； 4—压缩机
1—萃取槽； 2—加热器； 3—分离槽； 4—泵；5—冷却器
A、与温度诱导相分离的集成
B、磁场增强双水相


C、超声波加强的双水相
D、亲和沉淀的集成

三、反胶团（胶束）萃取 1、定义
反胶束或称逆胶束(Reversed micelle) 是指当有机溶剂中加入表面
活性剂并令其浓度超过某临界值时，表面活性剂便会在有机溶剂中形 成一种稳定的大小为毫微米级的聚集体。
K
CA
CB


2、常用溶媒萃取的工艺 （1）单级提炼法
溶剂 提取液
混合器
分离器
残余液 发酵液

（2）多次提炼法
溶剂
提取液
溶剂
提取液
溶剂
提取液
混合器
分wk.baidu.com器
混合器
分离器
混合器
分离器
发酵液 残余液 残余液 残余液

（3）、多级对流萃取
溶剂 最后提取液 提取液 A 90% 第 一 混 合 器 分 离 器 A 70% 提取液 第 二 混 合 器 第 三 混 合 器
第十三章 发酵产物的提取与精制方法
第一节

萃取
萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而 使溶质的得到纯化或浓缩的方法

根据参与溶质分配的两相不同分类： 液固萃取、溶媒萃取、双水相萃取、反胶团萃取、超临
界萃取


一、溶媒萃取法
1、溶媒萃取的基本原理 利用该物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使 之从一种溶剂转入另一种溶剂，从而使杂质去除
阴离子表面活性剂（十二烷基硫酸钠）


（2）pH值
红霉素在pH9.8时，在乙酸戊酯与水相间的分配系数等于44.7， 而在pH5.5时，红霉素在水相与乙酸戊酯间的分配系数等于14.4。


（3）温度
（4）盐析 （5）带溶剂
带溶剂是指这样一种物质，能和被萃取物质形成复合物而易溶于溶
媒中，形成的复合物在一定条件下又容易分解
A 50%
分 离 器
分 离 器
发酵液 一级
残余液 二级
残余液 三级
最后残余液


3、影响溶媒萃取的主要因素
(1)乳化与去乳剂 乳化：液体分散在另一不相溶的液体中的分散体系 乳浊液的形式：水包油、油包水 常用的去乳化的方法：过滤和离心、加热、稀释法、加电 解质、吸附法、顶替法、转型法

常用去乳剂：阳离子表面活性剂（溴代十五烷基吡啶）
凡是对蛋白质所含电荷有影响的因素，如pH，以及对反胶束的 静电状态有影响的因素，均能改变蛋白质的增溶作用。


（3）表面活性剂的浓度和种类
（4）其他（有机溶剂、助表面活性剂、温度）


3、应用举例
纯化和分离蛋白质 如对于溶菌酶和肌红蛋白的混合溶液
(两种蛋白质相对分子量相近,等电点分别为11. 1 和6. 8） ,用
二烷基磷酸盐/ 异辛烷反胶束溶液萃取,并用缓冲液将混合液的
pH 值调至9. 0 ,则溶菌酶完全进入有机相中,而肌红蛋白则留 在水相.
四、超临界流体萃取
超临界流体是处于临界 温度和临界压力以上，介于 气体和液体之间的高密度流 体。在临界温度以上压力不 高时与气体性质相近，压力 较高时则与液体性质更接近， 由此形成的超临界流体的性 质介于汽液两相之间，并易 于随压力调节的特点。
1、超临界流体（SCF）的特性
物质状 密度（g/cm3） 粘度(g/cm/s) 扩散系数(cm2/s ) 态
气态 液态 (0.6-2) ×10-3 0.6-1.6 (1-3) ×10-4 (0.2-3) ×10-2 0.1-0.4 (0.2-2) ×10-5
SCF
0.2-0.9
(1-9) ×10-4
双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产 物的萃取; PEG的循环; 无机盐的循环。


7、双水相的应用举例
分离和提纯各种蛋白质(酶） 用PEG/ -(NH4) 2SO4 双水相体系,经一次萃取从α- 淀粉 酶发酵液中分离提取α - 淀粉酶和蛋白酶, 萃取最适宜条件 为PEG1000 ( 15 %) -(NH4) 2SO4 (20 %) ,pH = 8 ,α- 淀粉 酶收率为90 % ,分配系数为19. 6 ,蛋白酶的分离系数高达 15. 1。比活率为原发酵液的1. 5 倍,蛋白酶在水相中的收

在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂 接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。此极性核具有溶解极 性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池” 。


2、 影响反胶团萃取的因素 （1）溶液的pH
pH影响蛋白质的电荷数量和电荷性质
（2）溶液的离子强度
影响微胶团的静电状态
(2-7) ×10-4
由以上特性可以看出，超临界流体兼有液体和气体的双 重特性，扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体溶剂相 比，可以更快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程 的实现。
2、超临界流体萃取原理
超临界萃取是利用SCF作为萃取剂，从液体和固体中萃取出
特定成分，以达到某种分离的目的。
一般说来，物质的溶解能力与其密度成正比关系。所以，在 临界点附近，温度和压力的微小变化往往会导致溶质的溶解度 发生几个数量级的变化。利用超临界流体的这个性质进行分离 操作效果奇佳，而且过程无相变，能耗较低。因此，超临界流 体已突破了一般流体的范畴。

4、双水相相平衡关系


5、影响物质分配平衡的因素
（1）聚合物及其分子量的影响
不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，水溶液中
聚合物的疏水性按下列次序递增:

葡萄糖硫酸盐< 甲基葡萄糖< 葡萄糖< 羟丙基葡聚糖< 甲基纤维素< 聚乙烯醇< 聚乙二醇< 聚丙三醇
同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其大小

率高于60 %。

提取抗生素和分离生物粒子
采用PEG/ Na2HPO4 体系提取丙酰螺旋霉素，最佳 萃取条件是pH= 8. 0～8. 5 ， PEG2000 (14 %) / Na2HPO4 (18 %) ,小试收率达69. 2 % ,对照的乙酸丁 酯萃取工艺的收率为53. 4 %



双水相和其他方法的集成