高质量的小麦种子总RNA的快速提取方法

Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ－Ｑｕａｌｉｔｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｗｈｅａｔ Ｓｅｅｄｓ
Ｌｉ Ｈａｏ１，２ Ｚｈａｎｇ Ｐｉｎｇｐｉｎｇ２，３ Ｚｈａ Ｘｉａｎｇｄｏｎｇ１ Ｈｅ Ｚｈｏｎｇｈｕ２，４ Ｘｉａ Ｘｉａｎｃｈｕｎ２＊
１ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｈｕｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ａｎｈｕｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｃｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， Ｈｅｆｅｉ， ２３００３９； ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｈｅａｔ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉห้องสมุดไป่ตู้ｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， １０００８１； ３ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ， ４３００７０； ４ ＣＩＭＭＹＴ Ｃｈｉｎａ Ｏｆｆｉｃｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， １０００８１ ＊ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ， ｘｉａｘｉａｎｃｈｕｎ＠ｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ
其他所有溶液均用 ０．１％ ＤＥＰＣ 处理后高压灭菌。研
（４） １４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 １５ ｍｉｎ。弃上清，加
钵和玻璃器皿锡纸包裹，２００℃烘烤 ４ｈ 以上。枪头、 入 １ｍｌ ７０％乙醇，轻轻摇动离心管以悬浮洗涤沉
离心管等均用 ０．１％ ＤＥＰＣ 水浸泡过夜后高压灭菌。 淀，１４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ５ｍｉｎ。弃上清，真空抽干。
法、异硫氰酸胍法和 ＣＴＡＢ 法（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３）等， 我们将冷酚法和 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂一步法相结合并加以改
也有许多适用于植物组织 ＲＮＡ 提取的试剂盒。由于 进，在 ５ｈ 左右就可获得高质量的总 ＲＮＡ，其纯度、
灌浆期种子含有大量的多糖、蛋白质以及其他次生 完整度都非常高，完全可以满足进一步实验要求。
（３） 取 ０．５ｍｌ 上 清 到 另 一 个 ２ｍｌ 离 心 管 。 加
（６）紫外分光光度计检测同前。
１．５ 双链 ｃＤＮＡ 合成和 ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ 分析
取纯化后的总 ＲＮＡ ５μｇ 按 ＴａＫａＲａ Ｍ－ＭＬＶ 反 转录试剂盒说明书操作进行双链 ｃＤＮＡ 合成。双链 ｃＤＮＡ 用限制性内切酶 ＰｓｔⅠ、ＭｓｅⅠ双酶切并添加 接头后用 Ｍ００、Ｐ００ 引物进行预扩增，预扩增产物用 水稀释 ２０ 倍再用添加选择性碱基的引物进行选择 性扩增。取 ５μｌ 加入选扩产物加 ２μｌ 上样缓冲液，在 ６％的变性聚丙烯酰胺凝胶上，控温不超过 ４２℃， ６０Ｗ 电泳 ２ｈ ２０ｍｉｎ 左右，直至二甲苯青移至距凝胶 底部约 ５ｃｍ 处。电泳结束后按标准的银染程序对凝 胶进行染色。
ＲＴ－ＰＣＲ、ＤＤＲＴ－ＰＣＲ、ＳＳＨ 分析等研究工作的基础。 剂复杂、步骤繁琐、提取时间较长等缺点（龚莉桂等，
目前常用的提取 ＲＮＡ 的方法有 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂一 ２００２； 姚红艳等， ２００３； 赵双宜等， ２００２）。
步法（于冰等， ２００４）、冷酚法（奥斯伯等， １９９８）、热酚
为了缩短提取时间，简化步骤，降低实验成本，
分子植物育种 ８７８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ
１ 材料与方法
ｂｕｆｆｅｒ，１．２％琼脂糖凝胶，１５Ｖ／ｃｍ 电泳 １５ｍｉｎ，溴化乙
１．１ 植物材料
锭染色 １０ｍｉｎ，在 Ｑｕａｌｉｔｙ Ｏｎｅ 凝胶成像系统下拍照。 （６）取 ２μｌ 总 ＲＮＡ 溶液加入 ２ｍｌ 水，混匀，紫外
分子植物育种，２００６ 年，第 ４ 卷，第 ６ 期，第 ８７７－８８１ 页 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， ２００６， Ｖｏｌ．４， Ｎｏ．６， ８７７－８８１
新思路、新技术、新方法 Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｉｎｋｉｎｇ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
高质量的小麦种子总 ＲＮＡ 的快速提取方法
Ｔｒｉｚｏｌ 为 Ｓｉｇｍａ 公 司 产 品 （ 编 号 Ｔ９４２４），
（２）加 ３０μｌ ＤＮＡａｓｅ 的 Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，静置 ２ｍｉｎ。
ＲＮＡａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡａｓｅ 为 Ｐｒｏｍｅｇａ 公 司 产 品 （ 编 号 加水补足至 ５００μｌ，加 ５００μｌ 体积比为 ４９：４９：２ 的水饱
Ｍ６１０１），Ｍ－ＭＬＶ 反转录试剂盒为 ＴａＫａＲａ 公司产品 和酚：氯仿：异戊醇，旋涡振荡 ３ｍｉｎ。冰上静置 １０ｍｉｎ。
（编号 Ｄ６１３０），其他试剂均为国产分析纯试剂。
１４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ５ｍｉｎ。取上清到另一个 ２ｍｌ 离
提取缓冲液（１０ｍｌ）：７ｍｌ ＤＥＰＣ－Ｈ２Ｏ 中加入 ０．５ｍｌ 心管用 ５００μｌ 体积比为 ２４：１ 的氯仿：异戊醇，旋涡振 １ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ （ｐＨ９．０）、１ｍｌ ２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｌ １０％ ＳＤＳ、 荡 ３ｍｉｎ。１４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ５ｍｉｎ。
从电泳结果可看出（图 １），加样孔中没有明显的 亮带，说明蛋白质污染很少。总 ＲＮＡ 的 ２８Ｓ ｒＲＮＡ 和 １８Ｓ ｒＲＮＡ 条带清晰，且两个条带的亮度呈明显 ２：１
分旋涡溶解。
倍比关系；溴酚蓝前面的 ５Ｓ 条带很弱，说明总 ＲＮＡ
１．２５ｍｌ （２．５ 倍体积）无水乙醇和 ５０μｌ （１／１０ 倍体积） ３ｍｏｌ／Ｌ 的 醋 酸 钠 （ｐＨ５．２）。 旋 涡 振 荡 １ｍｉｎ， 并 在 －８０℃放置 ３ｈ。
２ 结果与分析
２．１ 总 ＲＮＡ 琼脂糖胶电泳检测
（４） １４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ２０ｍｉｎ。弃上清，加入 １ｍｌ ７０％乙醇，轻轻摇动离心管以悬浮洗涤沉淀。短 时离心，弃上清，真空抽干。加入 ５０μｌ ＤＥＰＣ－Ｈ２Ｏ，充
（２）加 ０．５ｍｌ 体积比为 ４９：４９：２ 的水饱和酚：氯仿： 异戊醇，旋涡振荡 ３￣５ｍｉｎ。１４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ５ｍｉｎ。取 ０．５ｍｌ 上清到另一个 ２ｍｌ 离心管。加 １ｍｌ Ｔｒｉｚｏｌ，旋涡振荡 ３￣５ｍｉｎ。加 ０．２ｍｌ 氯仿，旋涡振荡 ３￣５ｍｉｎ。１４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ５ｍｉｎ。取 ０．７５ｍｌ 上清 到另一个 ２ｍｌ 离心管。加 ０．５ｍｌ 氯仿，旋涡振荡 ３￣５ｍｉｎ。１４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ５ｍｉｎ。
供试材料为小麦品种济南 １７、豫麦 ３４，２００４ 年 分光光度计检测。
冬种植于中国农业科学院作物科学研究所温室。每 个材料有开花后 １５ｄ 高温胁迫处理和对照、３０ｄ 高温 胁迫处理和对照共 ４ 个样本。
１．２ 主要试剂
１．４ 总 ＲＮＡ 的纯化
（１）总 ＲＮＡ ２５μｇ 加入 １０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １０￣２０μｌ 再加入 ＤＮＡａｓｅ （１Ｕ／μｌ） ３０μｌ，加 ＤＥＰＣ－Ｈ２Ｏ 补足至 １００μｌ。３７℃，３０ｍｉｎ。
摘 要 提取高质量的ＲＮＡ 是从基因表达水平上研究小麦种子发育的必要条件。现有提取方法难以快速得 到高纯度的小麦种子总 ＲＮＡ。本试验将冷酚法和 Ｔｒｉｚｏｌ 一步法相结合，在 ５ｈ 左右就可得到高质量的总 ＲＮＡ。通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计检测，提取的总 ＲＮＡ 具有清晰的 ２８Ｓ ｒＲＮＡ、１８Ｓ ｒＲＮＡ 条带， ＯＤ２６０／ＤＯ２８０ 比值在 １．９０￣２．００ 之间。将提取的总 ＲＮＡ 用于反转录，可获得高质量的 ｃＤＮＡ，在 ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ 分析上可得到清晰的条带。说明这种方法获得的总 ＲＮＡ 纯度和完整度非常高，完全满足分子生物学研究的 要求。 关键词 小麦种子， 总 ＲＮＡ 提取
０．４ｍｌ ０．５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、０．１ｍｌ １ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ，每次现用现
（３）取 ５００μｌ 上清到另一个 ２ｍｌ 离心管加 １．２５ｍｌ
配，混匀后冰浴（陈星等， ２００５； 李宏和王新力， １９９９）。 （２．５ 倍体积）无水乙醇和 ５０μｌ （１／１０ 倍体积） ３ｍｏｌ／Ｌ 的
Ｔｒｉｓ 溶液用高压灭菌的 ＤＥＰＣ－Ｈ２Ｏ 直接配制， 醋酸钠（ｐＨ５．２）。旋涡振荡 １ｍｉｎ，并在 －８０℃放置 ３ｈ。
为了研究不同发育时期小麦种子的基因表达情 代谢产物，且在成熟种子中 ＲＮａｓｅ 的活性较高，严重
况，提取高质量的 ＲＮＡ 是进行后续研究的重要前提。 干扰了 ＲＮＡ 的提取，利用常规的提取方法或试剂盒
高质量的总 ＲＮＡ 是 ｃＤＮＡ 文库构建、ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ、 难以得到高纯度的 ＲＮＡ。其他的改良方法也存在试
李浩 １，２ 张平平２，３ 查向东 １ 何中虎 ２，４ 夏先春 ２＊
１ 安徽大学生命科学学院， 安徽省生态工程与生物技术重点实验室， 合肥， ２３００３９； ２ 中国农业科学院作物科学研究所， 国家小麦改良中心， 北 京， １０００８１； ３ 华中农业大学植物科技学院， 武汉， ４３００７０； ４ 国际玉米小麦改良中心中国办事处， 北京， １０００８１ ＊ 通讯作者， ｘｉａｘｉａｎｃｈｕｎ＠ｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ
电泳槽、梳子用 ０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 浸泡 １ｈ 以上，双蒸 加 ２０￣３０μｌ ＤＥＰＣ－Ｈ２Ｏ，充分旋涡溶解。
水淋洗干净。
（５）电泳检测同前。
１．３ 总 ＲＮＡ 的提取
（１）液氮中研磨种子至粉末状。转移粉末到 ２ｍｌ 离心管中约 ０．５ｍｌ 处。加 ０．５ｍｌ 提取缓冲液，旋涡振 荡 ３￣５ｍｉｎ。
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ＲＮＡ ｉｓ ａ ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｓ ａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘ－ ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ． Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｓ ｉｓ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ． Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ， ｃｏｌｄ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｔｒｉｚｏｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｆｏｒ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ａｂｏｕｔ ｆｉｖｅ ｈｏｕｒｓ． Ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ａｎａ－ ｌｙｚｅｄ ｗｉｔｈ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ． Ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓ ｏｆ ２８Ｓ ｒＲＮＡ ａｎｄ １８Ｓ ｒＲＮＡ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＯＤ２６０／ＯＤ２８０ ｗａｓ １．９０ ｔｏ ２．００． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ， ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｃＤＮＡ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ， ａｎｄ ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｌｉｔｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｍａｎｄｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｋｅｙｗｏｒ ｄｓ Ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｓ， Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ