毕赤酵母表达系统研究进展
改良毕赤酵母分泌表达外源蛋白能力的研究进展
象， 并对不 正 确 折 叠 构 象 蛋 白 进 行 严 格 筛 选 的 主
1
主要的内质网驻留蛋白及其折叠加 工外源蛋白的分子机制
内质网腔是将分泌表达蛋白折叠成天然构
要场 所
［11］
。 内 质 网 驻 留 蛋 白 包 括 3 类 ：折 叠 酶 、 分
子伴侣和凝集素伴侣。几种主要 的 内 质 网 驻 留 蛋 白对多肽 /蛋 白 质 的 折 叠 加 工 分 子 机 制 如 图 1 所 示。
and facilitate the folding progress by consuming ATP ； Foldase PDI further accelerates the protein folding process by formation of correct disulfide bonds mediated in a cycle of Pdi and Ero1 ； Nascent glycoproteins are bound by calnexin and mediated to correct folding and processing of the N － glycans． Correctly folded and processed proteins are released to transport vesicles ，while failed folding leads to binding by the BiP complex and targeting to ERAD．
bip参与内质网功能的而共表达bip的同时再共表达辅分子伴侣能够更pdi基因pdi似乎与新合成的scfv在折叠过程的不同阶段相互作用推测bip主要辅助未折叠或部分折叠scfv转运和保持折叠状态而pdi通过它的二硫键催化或异构化活性促进scfv的折叠23共表达pdi可能对富含半胱氨酸外源蛋白的分泌表达有胱氨酸的美洲板口线虫necatoramericanus分泌性蛋白naasp1时发现共表达pdi可以有效提多拷贝菌株分泌表达该蛋白能力
巴斯德毕赤酵母表达系统研究系统进展
➢翻译后修饰
毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白糖链结构的差 异而具有潜在的抗原性，使其在医药工业上的应用受到 一定的制约。它们在哺乳动物体内可被免疫系统清除而 失去效能，而且有引起超敏反应的危险性。
解决糖基化策略：
①尝试胞内表达，避免目的蛋白的糖基化；
②对非活性中心的糖基化位点进行突变改造，清除糖基 化；
稀有密码子制约翻译速率
此时需要进行全基因的合成，使编码序列 符合毕赤酵母密码子的偏爱性和具有更高的
➢基因剂量
相对剂量效应
一般情况下，随着整合拷贝数的增加，表达量也会增加， 例如，1-8整合拷贝数范围内，HBsAg表达量成比例升高。 但也有例外，如小牛溶菌酶的表达随着拷贝数从1-3的上 升反而减少，这可能与mRNA翻译、蛋白折叠效率有关。
重组子在酵母细胞中的命运
导入毕赤酵母的重组质粒能通过同源重组整合到 染色体上，不同的整合方式可产生不同表型的转化子：
（1）同源双交换：表达载体线性化后，两端分别为5’AOX1和 3’AOX1序列，与基因组的同源序列发生双交换后，导致毕赤 酵母基因组内AOX1编码区被表达单元所替换，胞内醇氧化酶 只能来自AOX2基因，酶活性大大降低。因此转化子表现为甲 醇利用缓慢，表型为Muts。
若整合发生在his4位点处，可能出现表达单 元丢失现象，这可能是由于基因组中突变的his4与表 达单元中的his4基因之间发生了基因转换（gene conversion）所致，所以一般选择AOX1位点整合。
his4
用于转化子筛选的基因标记
用于毕赤酵母转化子筛选的基因标记主要有营养 缺陷型互补基因和显性基因：
二、巴斯德毕赤酵母简介
Pichia pastoris
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能 够在低 廉的甲醇培养基中生长，甲醇能高效 诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达， 因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属 强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵 母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵 母没有合适的自主复制型载体，所以外源基 因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA 上，因此能够稳定遗传。目前已有500多种 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功 表达。
毕赤酵母表达外源蛋白糖基化研究进展
毕赤酵母表达外源蛋白糖基化研究进展杨婕【摘要】Pichia pastoris as the host for the expression of recombinant proteins, has not only the advantages of prokaryotic expression system such as inexpensive in culture, ease of genetical manipulation, high levelsof protein expression, but also has post-translational protein processing capabilities like other higher eukaryotes such as protein folding, formation of disulfide bond and glycosylation. Gly-cosylation is an important form of posttranslational modification in secreted proteins and affects the structure and function of these pro-teins. In this review, we discuss protein glycosylation and humanized glycosylation engineering in Pichia pastoris.%毕赤酵母作为表达外源蛋白的宿主，不仅具有原核生物表达系统的优点，如培养成本低、遗传操作简单、表达效率高等，还可以对表达的外源蛋白进行翻译后修饰加工，如蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化等，因而有其独特的优势。
在分泌蛋白修饰中，糖基化是一种重要修饰方式，影响蛋白的结构与功能。
毕赤酵母表达研究进展
利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。
影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。
生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展_夏姗
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏21.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039；2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071；3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。
而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。
我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。
［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer⁃mentationXIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2*1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China*Corresponding author,E-mail:liuzhm@［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently.High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ⁃est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ⁃um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questionsexisting in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentationcourse综述doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.02620世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。
生物抗菌肽毕赤酵母表达系统研究进展
中 国 病 原 生 物 学 杂 志 2009 年 9 月 ! ! 第 4 卷第 9 期 ! Sept emb er 2009, ! V ol. 4, N o. 9 J ournal of Pathogen Biology
综述 生物抗菌肽毕赤酵母表达系统研究进展
孔凡红, 仲维霞, 崔勇, 王洪法*
*!
通讯作者 ! E m ail: w an g_hongf a@ yahoo. com. cn 作者简介 ! 孔凡红 ( 1984- ) , 女 ( 汉族 ) , 山东邹城 人 , 在读硕 士 ,
主要从事生物制品的研究。 E mail: k on gfan1025@ 163. com
中 国 病 原 生 物 学 杂 志 2009 年 9 月 ! ! 第 4 卷第 9 期 ! Sept emb er 2009, ! V ol . 4, N o. 9 J our nal of Pathog en Biology 表达系统有一定优点 : 成 本低、 易 于操 作、 遗传 背景 清楚 、 能被 大规模培养、 有大量可供选择利 用的克 隆和表 达载体。但 运用 该系统表达抗菌肽 则比较 困难 , 主 要表现 在 3 个方 面 : 1) 大肠 埃希菌是原核生物 , 不具有真核生 物的基 因表达调 控机制 和蛋 白质翻译后加 工修 饰 能力 , 其 产 物往 往形 成 没 有活 性 的包 涵 体 , 须经过变性、 复性等处理才能应用 ; 2) 抗菌肽的 宿主细 胞毒 性。宿主细胞表达的抗菌肽会反馈性 抑制大 肠埃希 菌的增 殖 , 影响抗菌肽的进一步表达 ; 3) 容 易被降 解。抗菌肽 本身带 有大 量的正电荷 , 对蛋白酶非常敏感 , 在大 肠埃希 菌中容 易降解 , 难 以实现大量表达。因此 抗菌 肽基 因只能 以融 合 蛋白 的形 式在 大肠埃希菌中表达。但也不乏有成功 的例子 , 目前 已有多 种抗 菌肽进入 # 期临床试 验阶 段 [ 6] ; 用 脂质 体包 装的 2 螺旋 型阳 离子肽 CM 3 喷剂 也已完成用于治疗支气 管和肺部 感染的 临床 实验
毕赤酵母蛋白表达系统研究进展
P． pastoris 是甲醇营养型酵母中的一种，可以在 含有甲醇的培养基上快速生长。与其他蛋白表达系
收稿日期： 2010-11-02 基金项目： 福建省科技厅资助项目（ 2009N0032） ，福建省教育厅资助项目（ JA08041） 作者简介： 杨梅，女，博士，教授，研究方向： 生物化学与分子生物学； E-mail： myang@ fjnu． edu． cn
3 外源蛋白的表达及其影响因素
目前，毕赤酵母蛋白表达系统在国内外应用都 很广泛，已成功表达许多外源蛋白。但由于毕赤酵 母本身仅分泌少量蛋白，因此外源蛋白占培养基中 总蛋白的绝大多数。有些外源蛋白的表达量可达到 g / L 以上水平，如 Hao 等［27］成功表达的重组人复合 α-干扰 素 （ cIFN） 的 表 达 量 达 到 1． 24 g / L； Huang 等［28］表达的截短的 1，3-1，4-β-D-葡聚糖酶的表达 量为 3 g /L。虽然许多外源蛋白都可以在毕赤酵母 中高效表达，但仍然有些蛋白表达量相对较低或不 表达，在同一表达系统中表达不同的外源蛋白，其表 达量千差 万 别，外 源 蛋 白 的 表 达 受 多 方 面 因 素 的 影响。 3． 1 外源基因自身的内在特性
母属（ Candida） 和汉逊酵母属（ Hansenula） 等。毕赤 酵母（ P． pastoris） 作为甲醇酵母的一种，是单细胞低 等真核生物，已发展成为广泛应用的表达宿主。与 其他表达系统相比，毕赤酵母具有不可比拟的优势， 其既有原核生物繁殖快、易于培养、培养基廉价和试 验过程简单可行等特点，又具有强有力的启动子，还 可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，具备 了典型的真核生物表达体系的特点。毕赤酵母表达 系统已发展成为一个较为理想的蛋白表达系统，被 国内外广泛应用于生产外源蛋白。目前，已有 500 多种外源蛋白在该表达系统中获得表达［4］。
毕赤酵母表达系统研究进展
Ａｄ ｖ ａ ｎｃ ｅ ｓ ｏ ｆ Ｐｉ ｃ ｈｉ ａ ｐ ａ ｓ ｔｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ
第 ４卷 第 ９期
２ ０ １ ３年 ９月
黑 龙 江 科 学
ＨＥＩ Ｌ０ＮＧＪ Ｉ ＡＮＧ Ｓ Ｃ Ｉ ＥＮＣＥ
Ｖ０ Ｉ ． ４ Ｎｏ ． ９
Ｓ ｅ ｐ ｔ ｅ ｍｂ ｅ ｒ ． ２ ０ １ ３
毕 赤 酵 母 表 达 系 统研 究进 展
马银 鹏 ， 王玉文 ， 党 阿丽 ， 孔祥辉 ， 张介驰 ＇
ＭＡ Ｙｉ ｎ — ｐ ｅ ｎ ｇ ，Ｗ ＡＮＧ Ｙｕ — ｗｅ ｎ ，ＤＡＮＧ Ａ． １ ｉ ，Ｋ ＯＮＧ Ｘｉ ａ ｎ ｇ ． ｈ ｕ ｉ ’ ，Ｚ ＨＡＮＧ Ｊ ｉ ｅ — ｃ ｈ ｉ ＇
（ １ ． Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｈ ｅ ｉ ｌ ｏ ｎ ｇ ］ ｉ ａ ｎ ｇ Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍ ｙ ｏ ｆＳ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ， Ｈ ａ ｒ ｂ ｉ ｎ １ ５ ０ ０ １ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ ． Ｉ ｓｔ ｎ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｆＡ ｏ ｄ ｖ ａ ｎ ｃ ｅ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｈ ｅ ｉ ｌ ｏ ｎ ｇ ｉ ｆ ａ ｎ ｇ Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍ ｙ ｆＳ ｏ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ， Ｈ ａ ｒ ｂ ｉ ｎ １ ５ ０ ０ ２ ０， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
（ １ ． 黑龙江省科学 院微生物研究所 ， 哈尔滨 １ ５ ０ ０ １ ０ ； ２ ． 黑龙江省科学 院高技术研究 院 ， 哈尔滨 １ ５ ０ ０ ２ ０ ）
毕赤酵母外源基因表达系统研究进展
Ａｂ ｔａ ｔ ｓ ｒ ｃ ： Ｐｉｈ ａ ｐ ｓ ｒｓ ｈ ｒ ｒ ｌｇ ｕ ｅ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｙ ｔｍ ａ ｅ ｎ ｕ ｉｚ ｄ ｔ ｒ ｄ ｃ ｔｒ ｃ ｉ ｅｌｖ ｌ ｆ ａ ｃ ｉ ａ ｔ ｉ ｅ ｅ ｏｏ ｏ ｓｇ ｎ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｓ ｓ ｅ ｈ ｓｂ ｅ ｔ ｉｅ ｏ ｐ ｏ ｕ ｅａ ｔａ ｔ ｅ ｓ ｖ — ｏ ｌ ｖ ｅ ｏ ａ ｒ ｔ ｆｉ ｔａ ｅｌｌ ｒａ ｄ ｅ ｔａ ｅｌ ｌｒ ｐ ｏ ｅ ｎ ｆ ｉ ｔ ｒｓ ，Ｉ ｌ ｂ ｍ ｐｏ ｅ ｒ ｄ ｌ ｏ ｔ ｎ ｄ ａ ｔｇ ｖ ｒ ｉ ｙ ｏ ｎ ｒ ｃ ｌ ａ ｎ ｘ ｒ ｃ ｌ ａ ｒ ｔ ｉｓ ｏ ｎ ｅ ｅ ｔ ｔｗｉ ｅ ｅ ｌｙ ｍｏ ｅ ｗ ｅ ｙ ｆ ｒ ｉ ｍａ ｙ ａ ｖ ｎ ａ ｅ ｏ ｅ ｅ ｕ ｕ ｌ ｄ ｉ ｓ ｓ Ｓ ｃ ｈ ｒ ｍｙ ｅ ｅ ｅ ｉ ｉ ｅ ｔ ｎ ￣ｔ ｒ ｒ ｅ ｃ ｉ ｅ ｅ ｅ ａ ｃ ａ ｏ ｃ ｓｃ ｒｓｖ ａ ．Ｉｓ ｍａ ｙ ｆ ｕ ｅ ａ ｅ ｄ ｓ ｒ ｄ ｈ ｒ ．Ｔｈ ｅ ｆａ ｕ ｅ ｃｕ ｅ ｈ ｏ ｔｓ ｒ ｉ ．ｔ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓ ｎ ｓ ｂ ｓ ｅ ｅ ｔ ｒ ｉ ｌｄ ：ｔ ｅ ｈ ｓ ｔａｎ ｓ ｎ ｓ ｈ ｘ ｒｓ ｉ ｏ ｖ ｃ ｏ ｓ ｈ ｒ ｎ ｆ ｒ ａ ｉｎ ｍｅ ｈ ｓ ｎ ｈ ｔ ｇ ａ ｉｎ ｏ ｈ ｔ ｒ ｔｇ ｎ ｔ ｅｇ ｎ ｍｅ ｏ ． ａ ｔ ｒｓ ｈ ｌ ｍｓ — ｅ ｔ ｒ ，ｔ ｅｔａ ｏ ｍ ｔ ｔ ｏ ，ａ ｄ ｔ ｅｉ ｅ ｒ ｔ ｆ ｅ ｉ ｅ ｅ ｅ ｅ ｉ ｏ ｔ ｅ ｏ ｆＰ ｐ ｓ ｉ ，ｔ ｅ ｇ ｙ ｙ ｓ ｏ ｄ ｎ ｏ ｔ ｎ ｓ ｎ ｈ ｏ ｌｔ ｎ ｏ ｈ ｅ ｅ ｏ ｏ ｏ ｓ ｐ ｏ ｅｎ ａ ｄ ｈ ｇ ａ ｉ ｆｔ ｅ ｈ ｔ ｒ ｌｇ ｕ ｒ ｔ ｉ ｎ ｉ ｈ—ｄ ｎ ｉ ｅ ｍｅ ｔ ｔ ｎ ａ ｄ ｏ ｈ ｒ ． ｏ ｅ ｓｔ ｆ ｙ ｒ ｎ ａｉ ｎ ｔ ｅｓ ｏ Ｋｅ ｒ ｓ Ｍ ｅ ｈ ｌｔｏ ｈ ｃ ｙ ａ ｔ Ｐｉｈ ａ ｐ ｓ ｒｓ Ｅｘ ｒｓ ｉｎ ｓ ｓｅ ｙ ｗｏ ｄ ： ｔ ｙｏ ｒ ｐ ｉ ｅ ｓｓ ｃ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ａ Ｐａ ｔ ｒ ｓ Ｈ ｅ ｅ ｏ ｏ ｏ ｓ Ｇｅ ｅ Ｅｘ ｒ ｓ ｉ ｎ Ｓ ｓ ｅ ａ ｅ ｎ ｔ ｅ Ｐｉ ｈｉ ｓ ｏ ｉ ｒ ｒ ｌ ｇ ｕ ｎ ｐ ｅ ｓｏ ｙ ｔ ｍ
巴斯德毕赤酵母新启动子PGCW14的调控结构和应用研究
摘要巴斯德毕赤酵母表达系统是分子学领域内被广泛应用于重组蛋白生产的主要系统之一，既具有操作简单，生长快等特点，又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。
在外源蛋白表达系统中，影响蛋白表达的一个主要因素是启动子活性。
启动子作为基因表达的重要调控元件，通过与转录因子相互作用控制基因转录的起始和表达水平，在转录水平上起重要作用，因而启动子活性的高低在很大程度上影响着蛋白的表达水平。
在毕赤酵母表达系统中，醇氧化酶基因的启动子P AOX1是最常用的启动子，已实现了各种外源蛋白的高效表达尤其是人源蛋白的表达。
但P AOX1是甲醇诱导型启动子，在食品、医药上的应用受到限制，且甲醇的储存和运输等存在火灾隐患，因此毕赤酵母非甲醇诱导的启动子在不断被开发。
根据本实验室对毕赤酵母转录组的研究数据，在以甘油为碳源的培养基中，转录水平最高的是被命名为GCW14(NCBI编号：XM_002490678) 的细胞壁蛋白基因，该基因为组成型表达，推断GCW14具有潜在的高活性启动子。
此外，根据已有的实验数据证明：敲除毕赤酵母基因组上的GCW14基因会降低以Gcw14p为锚定蛋白的CALB的表面展示酶活力，说明壁蛋白Gcw14p与外源蛋白表面展示的效果有关。
本研究将壁蛋白Gcw14p的启动子P GCW14应用于南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）的毕赤酵母表达中，并与启动子P AOX1、P GAP、P TEF1的活性进行比较；对P GCW14启动子进行突变，初步探索该启动子的作用元件；将活性提高的突变启动子应用于CALB的表达中，提高CALB的酶活力，也为提高毕赤酵母外源蛋白的表达奠定基础。
主要研究内容如下：(1)为了比较P GCW14和其他3种启动子P AOX1、P GAP、P TEF1表达CALB的能力，构建了4种不同启动子的CALB表面展示重组菌：X33/ pPG14-CALB、X33/pZαA-CALB、X33/pPGAP-CALB和X33/pPTEF1-CALB。
巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展
源的培养基 中生长 ， 因为其细胞 中含有 甲醇代谢途 径的必需 酶， 如醇氧化酶（ Ｏ ） 二羟丙酮合成酶 和过氧化氢酶 等 ， ＡＸ、 其
中 Ａ Ｘ是甲醇酵母代谢途径 中的第 １ Ｏ 个酶 ， 它催化 甲醇被氧
化 为 甲醛 和过 氧 化 氢 ， 氧 化 氢 进 一 步 由过 氧 化 氢 酶 分 解 成 过
萄糖作碳 源时 ， 菌体中只有 １ 个或几个很小 的过氧化物酶体 ；
而在以 甲醇作碳源 时， 过氧化物酶体几 乎 占到整 个细胞体积 的 ８％ ， ０ 因此 ， 当在 Ａ Ｘ基 因前利用 同源重组方式插入外源 Ｏ 蛋 白基因 时， 获得 大量表 达 。在 构建 表达 菌 株时 ， Ｏ 可 ＡＸ 的 １个或 ２个基 因的缺失就会导致菌株对 甲醇利用能力 的改 变， 根据菌株 的基因型可将 毕赤 酵母 分成 ３种表型 ： １ 甲醇 （） 快利用型菌株（ ｔ ， Ｍｕ ） 它含 有 Ａ Ｘ Ｊ基因 ， Ｏ 能够快速利用 甲
的 表达 。
１ 巴氏 毕 赤酵 母 的特 性
巴氏毕赤酵母是一种 甲基 营养型酵母。 甲基营养型酵母 是指一类可 以在 以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长 的 酵母 菌 ， 主要 包 括 ： 逊 酵 母 属 （ ａ ｓ ｕ ） 念 珠 酵 母 属 汉 Ｈ ｎｅ ｌ 、 ｎａ （ １、 ） 球拟 酵母 属 （ ｏｕｏｓ ） 克 勒克 酵母 属 （ ｌ ｃ— Ｔｒｌ ｉ 、 ｐｓ Ｋｏ ｋ ｅ
１ 一醇氧酶 ；２ —过氧化氢酶 ；３ 甲醛脱氢酶 ； 一 甲 一 ４ 酸脱氢酶 ；５ 一二羟丙酮合成酶 ；６ 一二羟丙 酮激酶 ； ７ １一 — ， 二磷酸果糖醛缩酶 ；８ 果糖 ． ６二磷酸化 酶 ； ６ 一 １． ， ９ 甲醛还原酶 一
图１ 巴氏毕赤酵母中甲醇的代谢途径
巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展作者：方园园来源：《绿色大世界》2009年第12期摘要:经过近20年的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经成为目前最成功的真核表达系统之一,被广泛用于医药生产、饲料添加剂开发和科学研究。
介绍了毕赤酵母的生物学特性、常用菌株和表达载体的特点及其研究进展,并阐述了其在外源蛋白的表达方面具有的独特优势。
关键词:毕赤酵母;表达载体;外源蛋白中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1005-569X(2009)12-0037-031 引言巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一类在缺乏葡萄糖或甘油时,能利用甲醇做为唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉价的非选择性培养基中生长,有较宽的生长pH适应范围(3.0～8.0),有较好的发酵基础,非常有利于实现高密度发酵培养,菌体密度可高达100g干细胞/L,它们生长的适宜温度一般为28～30℃,是常用的外源蛋白表达系统。
2 巴斯德毕赤酵母宿主菌株根据对甲醇利用的情况,P.pastoris可划分为三种表型:第一型,即Mut+型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似,称为甲醇利用正表型。
绝大多数毕赤酵母为Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型毕赤酵母的AOX1基因部分敲除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,AOX2虽然与AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培养基内该型毕赤酵母生长缓慢,称为甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,细胞不能进行甲醇代谢,无法在甲醇中生长,为甲醇利用负表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。
后两者表达外源蛋白有时优于野生株,且需甲醇较少,有时其表达量甚至高于Mut+型。
巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展_王炎林
纯化. 毕赤酵母发酵培养的营养要求低, 且诱导物甲醇与其它表达系统诱导物相比十分廉价, 同时培养 基中不含蛋白, 有利于表达产物分离纯化 . 安全性高 . 由于毕赤酵母不含有特异性病毒, 不产生毒素, 有些酵母菌属 (如酿酒酵母等 ) 在食品工业中有着几百年的应用历史 , 是非常安全的基因工程受体系 统 . 大体积高密度连续发酵培养. 巴斯德毕赤酵母可以在简单的培养基 (包括盐、 微量元素、 生物素和 碳源 )上良好生长 , 在甲醇诱导下进行大体积高密度连续发酵培养 , 表达水平稳定, 且能够在较宽的酸 碱度 ( p H3 . 0~ 7 . 0) 变化下生长, 有利于在发酵过程中通过调节 p H 值来抑制蛋白水解酶活性 , 防止蛋 白水解酶对蛋白的降解. 具有较强的且易控制的乙醇氧化酶基因 ( a lcohol ox idase , AOX ) 启动子 , 可严 格控制外源基因的表达. 作为真核表达系统 , 可对目的蛋白进行翻译后加工和修饰 , 即信号肽剪切、 二 硫键形成、 蛋白的糖基化和磷酸化等过程 , 以使外源蛋白得到正确的折叠和修饰. 由于该表达系统有 多种受体菌和表达载体供选择 , 进行胞内表达或分泌表达, 有利于产物的提取和加工等.
AOX1 已被来自酿酒酵母的 ARG4 所代替, 只能依赖 AOX2 基因合成 AOX, 在甲醇中缓慢生长 . 重组菌 和宿主菌用组氨酸和精氨酸筛选, 但重组菌 ( arg4) 在补充精氨酸的最低营养培养基中生长不良, 因此, 一般不推荐用 KM 71 产生 H is 转化子.
+
宿主菌 M C100- 3 的两个 AOX 基因都被去除 , 不能在含甲醇
巴斯德毕赤酵母表达系统已成为应用最广的外源蛋白表达系统之一 , 目前已有 400 多种外源蛋白 在毕赤酵母表达系统中得以成功表达 . 该系统具有以下独特的优点: 表达量高. 各种蛋白质在巴斯 德毕赤酵母中的产生水平约为细菌或哺乳动物细胞等表达系统产量的 10~ 100 倍, 甚至有些蛋白可达 到每升克以上水平. 稳定性高 . 由于巴斯德毕赤酵母无内源型载体, 一般目的基因通过同源重组, 可稳 培养成本低 , 产物易分离 定地整合在酵母染色体上 , 随染色体的复制而复制 , 构建的重组菌十分稳定 .
酵母表达系统概述及相关研究进展
酵母表达系统的研究进展和前景( XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院)摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而成功的应用，表达出的重组蛋白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。
近年来，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体取得了新的进展。
本文主要从上游设计，重组表达，分离纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对未来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。
关键词：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物引言酵母作为一种表达外源基因的宿主菌, 既具有操作简单, 生长快等特点, 又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。
在表达某些基因工程产品时, 可以大规模生产, 从而有效地降低成本。
常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统, 甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。
酿酒酵母（Saccharomyces. cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。
但由于酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。
其中毕赤酵母（P. pastoris）是继S. cerevisiae之后被迅速推广的一种外源基因表达的宿主菌。
酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。
因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。
但是，可以通过基因敲除或改造用酿酒酵母表达亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物质及其中间体（如青蒿素，色素）。
与原核和其它真核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母作为重组蛋白表达系统有以下优点[1]：（1）生长速率快，易于高密度培养（2）在几乎不含蛋白质的培养基中具有高水平产率（3）消除了内源毒性和噬菌体感染（4）易于对具有明确特征的酵母表达载体进行操作（5）对毕赤酵母的噬菌体对人没有病原性（6）具有多种翻译后修饰包括多肽折叠，糖基化，乙酰化，甲基化，蛋白质降解调控以及定位至亚细胞结构（7）能够构建分泌的蛋白，这样只需从生长培养基中提纯而不必收集酵母本身细胞。
毕赤酵母表达系统中启动元件的研究进展
毕赤酵母表达系统中启动元件的研究进展蒋慧慧【摘要】毕赤酵母是真核细胞常用表达系统之一,具有细胞密度高、纯化方法简单、转录后修饰功能完善等优点.作为重要的调控元件,表达系统中启动元件的功能强弱与表达效率的高低密切相关.目前,毕赤酵母表达系统中常用的启动元件分为三类,分别是以p A OX为代表的甲醇诱导型、以pGAP为代表的非甲醇诱导型,还有一些新型工业酵母启动子也是理想的表达系统启动元件.充分了解这些酵母启动子的最新研究进展,可以为工业酵母表达系统的优化提供重要的发展思路.【期刊名称】《巢湖学院学报》【年(卷),期】2017(019)003【总页数】6页(P67-72)【关键词】毕赤酵母;启动子;诱导型;组成型【作者】蒋慧慧【作者单位】巢湖学院,安徽巢湖 238000【正文语种】中文【中图分类】Q939.5毕赤酵母（Pichia pastoris）是为数不多的商业化真核表达系统之一，自上世纪70年代Phillips Petroleum公司成功开发出P.pastoris高密度培养方案，迄今已有超过600种蛋白质成功利用这一微生物细胞工厂实现基因克隆并表达[1]。
进入21世纪，P.pastoris在结构基因组学、蛋白质组学等方面也有应用[2]。
毕赤酵母表达系统之所以如此受青睐，不仅因为其具有营养成分单一、细胞密度高、纯化方法简单、转录后修饰完善等优点，还与该系统中可供选择的受严密调控、功能各异的启动元件密不可分。
毕赤酵母等真核表达系统的表达效率很大程度上取决于启动元件的功能，而启动功能的强弱往往决定于它的结构和转录条件。
目前，酵母等大多数真核生物启动元件所共有的结构模式已得到普遍认可，如图1所示[3]，包括上游启动子和核心启动子两部分，其中位于转录起始位点上游的TATA区与原核生物Pribnow区类似，是富含TA的保守序列[4]；TATA区的中心位置一般位于-20到-30，主要负责转录起始位点的确定；而-40到-110区的CAAT区、GC区属上游激活序列，主要控制转录起始的频率；增强子则能使连锁基因转录频率明显增加。
巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
第28卷第1期 农业科学研究2007年3月 Vol.28No.1 Journal of Agricultural Sciences Mar.2007文章编号:167320747(2007)0120068204巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展魏凡华1,2,3,曹瑞兵3,吴 润1,陈溥言3(1.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021; 2.甘肃农业大学,甘肃兰州 730071;3.南京农业大学农业部疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京 210095)摘 要:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,对Pichia pasto2 ris基因结构、载体元件以及影响外源基因表达的因素等进行了较为全面的综述.关键词:巴斯德毕赤酵母;基因表达系统;研究进展中图分类号:TQ926.1 文献标志码:A 目前,大肠杆菌类原核表达系统虽然较为成熟,但表达产物以包含体形式存在,无翻译后的糖基化等修饰加工过程,并且可能还会有细菌毒素.昆虫细胞表达存在不正确的糖基化,产物复杂,不易纯化,而哺乳动物细胞表达成本高,产量低.甲基营养型巴斯德毕赤酵母(Pichi a p astoris)已发展成为能够生成多种外源蛋白的卓越表达系统.1 巴斯德毕赤酵母菌株一般用于外源基因表达的Pichi a p astoris菌株有Y211430,M2C10023,GS115,KM71,SMD1168等.根据利用甲醇的能力,可将巴斯德毕赤酵母分为3型[1]:①Mut+型为甲醇快利用型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,绝大多数毕赤酵母为Mut+表型.②Muts型,此型毕赤酵母(如KM71)菌细胞AOX2基因编码的醇氧化酶可依赖15%AOX活性,为甲醇慢利用型.③Mut2型(如M2G10023),此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,为甲醇不利用型.研究发现,蛋白酶缺陷型毕赤酵母,如SMD1163, SMD1165和SMD1168可有效降低外源目的蛋白的酶解.一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用Muts表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用.甲醇慢利用型有时比Mut+型菌株能够达到更高的表达量[2].2 Pichi a p astoris表达载体载体是由许多元件构成的,包括启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点和信号肽序列等,典型的表达载体含有乙醇氧化酶基因5′AOX1启动子和3′AOX1终止子,其中含有供外源基因插入的多克隆位点,以组氨醇脱氢酶基因HIS4作为互补筛选标志或ZeocinR作为筛选标志.2.1 启动子Pichia pastoris含有两个基因编码醇氧化酶: AOX1和AOX2,二者序列有92%同源性,但是AOX1表达水平高于AOX2.AOX1启动子的表达受甲醇严格调控[3].以甲醇为碳源生长时,约5%的mRNA 由AOX1基因转录.P GA P(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是最近在毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,GA P启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简单.Vassilen利用GA P启动子表达乙肝表面抗原获得高表达[4],Genzyme也利用GA P启动子表达人几丁质酶,不仅获得高表达,而且还可以避免蛋白酶水解[5].Phongdara在H ansenul a pol y mor p ha克隆到酸性磷酸酶(p HO1)基因启动子[6].这些启动子丰富了甲醇酵母对启动子的选择.2.2 选择标记选择标记一般为对应于营养缺陷型受体的野生型基因,常用HIS4,也可用来源于酿酒酵母的AR G4基因和SUC2基因.kanr基因和Shbler基因能够作为细菌和酵母菌的选择标记,因此较其他表达载体更易于筛选.2.3 信号肽序列可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自身的收稿日期:2006205220作者简介:魏凡华(19802),男,宁夏隆德人,硕士研究生,主要从事微生物学与免疫学研究.信号肽和酵母本身的信号肽.有些蛋白的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可试用甲醇酵母信号肽.目前可供选择的酵母信号肽有α2交配因子的前导肽序列、酸性磷酸酶信号肽和蔗糖酶信号肽等.其中酿酒酵母α2交配因子前导肽序列的使用最为广泛.酶切割位点周围氨基酸序列及外源蛋白的3级结构可以影响信号肽的加工效率.Waterham 等也利用定向肽在巴斯德毕赤酵母中成功地将PG AP 启动下的β2半乳糖苷酶定向输送到过氧化物酶体[7].2.4 表达载体的种类Invit rogen 公司开发出了若干系列的表达载体可供选择.当前常用的巴斯德毕赤酵母表达载体可分为2类.①胞内表达载体.如p HIL 2D2,p AO815,p PIC3K ,PICZ ,p HWO10,p GA PZ.②分泌表达载体.如p HIL 2S1,p PIC9K ,p PICZα,p GA PZ α[8].目前主要采用酵母内源性的信号肽来引导外源基因表达产物的分泌,常用A2因子信号肽.许多蛋白的正确构像和翻译后加工(如糖基化等)都是在分泌途中完成的.3 基因整合证明表达载体构建正确后,转入巴斯德毕赤酵母中诱导表达.毕赤酵母转化方法最常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合.ZeocinR 抑制细胞壁的形成,因此PICZ 系列不能使用原生质体法进行转化.转化时,载体DNA 必须切成线状才能与染色体进行同源重组,将整个载体连同外源基因整入宿主染色体.通常有以下几种整合方式:①双位点互换.发生在染色体AOX1位点和表达质粒中的P AOX1及转录终止区,产生的表达菌的表型为His +Mut -[9].②AOX1单位点互换.发生在染色体和表达质粒的AOX1区.产生的表型是His +Mut +.③His 单位点置换.发生在染色体His 位点和表达质粒的His 位点,使得1个或多个表达单位插入在His 位点,产生的表型也是His +Mut +.巴斯德毕赤酵母载体在宿主染色体上大多为单拷贝整合,由于PAOX1的强启动性和整合后的稳定性,所以单拷贝也能获得较高的产量.4 重组蛋白翻译后修饰Pichi a p astoris 能进行与高等真核细胞相似的许多翻译后修饰,包括二硫键形成、信号序列加工、折叠、O 2连接和N 2连接糖基化等.巴斯德毕赤酵母对分泌的外源蛋白的糖基化已成为研究的热点.巴斯德毕赤酵母对外源目的蛋白的糖基化作用具有2个主要特征:①极少出现过度糖基化.一般情况下Pp 能产生较酿酒酵母明显要短的高甘露糖型寡糖链,且较均一,长度在8～14个之间,使产物更加稳定.②糖链中不含具有潜在致敏作用的α21,32甘露糖[10].然而,一些在天然分泌时不被糖基化的蛋白,由巴斯德毕赤酵母表达时却可能发生糖基化.如人体内合成的胰岛素样生长因子I 为非糖基化蛋白,而由巴斯德毕赤酵母表达时,却有15%发生了糖基化作用[11].不合适的糖基化和寡聚体可能会在机体内产生免疫反应或毒副作用,解决这一问题的可能方法主要是尝试胞内表达,利用基因工程改造糖基化位点[12],用糖苷酶进行处理,降低抗原性[13].5 影响外源基因表达的因素影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的因素主要包括:外源基因自身的特性、表达框的拷贝数、染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性、翻译后修饰以及培养条件等[14].5.1 外源基因自身的特性外源基因在P.p 中表达时,其自身就是影响表达水平的重要因素.许多高A +T 质量分数的基因常会由于提前终止而不能有效转录,不合适的mRNA 5′非翻译区的核苷酸序列和长度也可能会影响基因的正常表达.Sreekrishna 等通过调整人血清白蛋白的mRNA5′非翻译区与醇氧化酶的5′非翻译区相同后,HSA 的表达量可以提高50倍以上[15].赵翔等研究证明,Pichia pastoris 有密码子偏爱倾向[16].所以一般需要进行全基因合成,使编码序列符合毕赤酵母偏爱密码子用法和具有更高的G +C 质量分数.5.2 表达框染色体整合位点巴斯德毕赤酵母中的稳定高效表达主要通过整合性载体实现.整合性载体的表达盒稳定,可以多位点整合而获得多拷贝以及进行不同整合方式.AOX1和组氨酸脱氢酶(HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白.Sreekrishna 等认为,由于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因能够发生基因转换,所以首选aox 1位点作为整合位点.5.3 宿主菌的甲醇利用表型原则上,如果是胞内表达,应尽量用Mut -细胞,这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而蛋白纯化更易进行.现在无需甲醇诱导的组成性表达载体p GA PZ 和p GA PZα已经构建成功,它们常能生产比诱导型载体p PICZ 和p PICZα更高的外源96 第1期 魏凡华等:巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展蛋白.Doring等研究表明,在生产哺乳动物膜转运蛋白时,p GA P比pAOX1更理想.5.4 基因剂量一般来说,高拷贝整合可以提高表达量,但许多实例表明,含单拷贝表达框的宿主菌足以得到最佳产量.Jeffrey等发现,重组CD40L的最高产量是在有8个以上表达框的菌株中获得的[17].不过个别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应,原因可能在于过高表达会对分泌途径产生负反馈抑制.因此,高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准,基因剂量与表达水平的关系取决于特定的外源蛋白.Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法,可以快速地从大量重组菌株中筛选出高表达克隆.5.5 分泌信号不适合的信号肽可导致信号肽加工不完全,或者蛋白分泌水平低,甚至不能分泌.尝试不同的信号肽,对信号肽进行突变改造或人工全合成信号肽等策略可用于实现信号肽正确加工和提高分泌水平[18].韦宇拓等利用菊粉酶的信号肽序列来构建巴斯德毕赤酵母分泌载体并表达了B2葡聚糖酶,结果表明ISP信号肽序列分泌效率不低于利用A因子信号肽的表达载体p P IC9K.Singh等通过定向缺失诱变导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放,可以成为解决这一问题的一种好方法.5.6 发酵系统培养巴斯德毕赤酵母在发酵系统中外源基因的转录水平是过量甲醇诱导时的3～5倍.可有效监控p H、通气量和碳源浓度并及时排出代谢产物,控制维持产物稳定性的因素,可达到最优化发酵条件,使蛋白产量在标准以上水平.现在已建立了较成熟的补料分批培养制度和连续灌注培养方法.5.7 产物稳定性酵母细胞膜上有一种KEXO2样蛋白水解酶,能专一性水解α因子前体中羧基端的肽键.改变培养基的p H值,推荐范围为2.8～6.5,加入适量的酵母提取物和蛋白胨,都能够提高外源蛋白的稳定性,而某些酶抑制剂在增加其稳定性的同时会使一些原先并不明显的蛋白变得非常明显,影响其使用效果.另外,使用蛋白酶缺陷株如SMD1163, SMD1165或SMD1168亦可避免产物降解的发生.在另外一种情况下,如果基因工程产物会影响宿主菌生长代谢活性的话,也可能出现高度降解的情况.6 结束语巴斯德毕赤酵母(Pichi a p astoris)表达系统是近年发展起来的一种新型真核表达系统,具有发酵工艺成熟,易于工业化,培养成本低廉,又具有真核表达系统,可进行蛋白翻译后的修饰、加工和折叠等优点,而得到广泛应用,目前许多诊断用的抗原及治疗用的疫苗都有在P Pichi a p astoris中得到表达.巴斯德毕赤酵母表达系统具有极好的生产应用前景,其主要优势如下:①巴斯德毕赤酵母表达载体整合后具有高稳定性.②可进行胞外表达和胞内表达,胞外分泌表达更有利于蛋白纯化.③发酵培养适合进一步大规模生产.④表达蛋白的加工修饰适中.但巴斯德毕赤酵母的更广泛应用,还有待于对此体系进行进一步的研究和开发.参考文献:[1] CREGG J M,CEREGHINO J L,SHI J,et al.Re2combinant protein expression in Pichia pastoris:a re2view[J].Molecular Biotechnology,2000,16(1):23252.[2] CREGG J M,V EDV IC K T S,RASCH KE W C.Re2cent Advances in the expression of foreign genes inPichia pastoris[J].Teclmology,1993,11(8):9052910.[3] CREGG J M,MADDEN K R,BARRIN GER K J,etal.Functional characterization of the two alcoholoxi2dase genes f rom the yeast Pichia pastoris[J].MolCell Biol,1989,9:131621323.[4] VASSIL EVA A,GHU GH D A,SWAMINA T HANS,et al.Expression of hepatitis B surface antigen inthe methylotrophic yeast Pichia pastoris using theGAP promoter[J].J Biotechnol,2001,88:21235. [5] GOODRIC K J C,XU M,FINN EGAN R,et al.High2level expression and stabilization of recombinanthuman chitinase produces in a continuous constitutivePichia pastoris expression system[J].Biotechnologyand Bioengineering,2001,174:4922497.[6] P HON G DARA A,M ERXKELBACH A,KEU P P,et al.Cloning and characterization of the gene enco2ding a repressible acid phosphatase(p HO1)f rom themethylotrophic yeast Hansennula pol y morpha[J].Appl Microbiol Biotechnol,1998,50:772841.[7] WA TER HAM H R,DIGAN M E,KOU TZ P J,etal.Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehydes23′22phosphate and regulation and use of its promoter[J].Gene,1997,186(1):37244.[8] SEARS I B,CONNOR J,RO SSAN ESE O W,et al.A versatile set of vectors for constitutive and regulatedgene expression in Pichia pastoris[J].Yeast,1998,14(8):7832790.[9] CEREGHION J L,CREGG J M.Heterologous protein07农业科学研究 第28卷 expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris [J ].FEMS Microbiology Rev ,2000,24(1):45266.[10] MON TEINO R ,GARCIA R ,QU IN TERO O ,et al.Variation in N 2linked oligosaccharide structures on heterologous proteins secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris [J ].Protein Expr Purif ,1998,14(2):1972207.[11] BRIERL EY R A.Secretion of recombinant human in 2sulin 2like growth factor I (IGF 21)[J ].Methods Mol Biol ,1998,103:1492177.[12] U RBA TSCH I L ,WIL KE 2MOUN TS S ,GIMI K ,et al.Purification and characterization of N 2glycosy 2lation mutant mouse and human P 2glycoproteins ex 2pressed in Pichia pastoris cells [J ].Arch Biochem Biophys ,2001,388:17121771.[13] CALL EWA ER T N ,L AREY W ,CADIR GI H ,ete of HDEL 2tagged Trichoderma reesei manno 2syl oligosaccharide 1,22alpha 2D 2mannosidase forN2glycan engineering in Pichia pastoris [J ].FEBSLett ,2001,503:1732178.[14] SREEK RISHNA K ,BRAN KAMP R G ,KROPP KE ,et al.Strategies for optimal synthesis and secre 2tion of heterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris [J ].G ene ,1997,190(1):55.[15] SREEKRISHNA K ,BARR K A ,HOARD S A ,etal.Expression of human serum albumin in Pichia pastoris [J ].Yeast ,1990,6(special issue ):447.[16] 赵翔,霍克克,李育阳.毕赤酵母的密码子用法分析[J ].生物工程学报,2000,16(3):2082211.[17] CL ARE J J ,ROMANOS M A ,RA YM EN T F B ,etal.Production of mouse epidermal growth factor in yeast :high level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies [J ].Gene ,1991,105,2052212.[18] 熊爱生,彭日荷.信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响[J ].生物化学与生物物理学报,2003,35(2):1542160.R esearch progress of the expression system of Pichia pastorisW ei Fanhua1,2,3,Cao R uibi ng 3,W u R un 1,Chen g Puy an3(1.School of Agriculture ,Ningxia University ,Y inchuan 750021,China ;2.Gansu Agricultural University ,Lanzhou 730071,China ;3.Nanjing Agricultural University ,Nanjing 210095,China )Abstract :As a eukaryote expression system ,Pichi a p astoris has been widely used in genetic engineering ,has many merit s in t he gene exp ressio n.These factors including t he st ruct ure of gene ,secretion signal peptides ,vector element s ,and factord influenced exp ression levels etc are analyzed.K ey w ords :Pichi a p astoris ;gene expression system ;research(责任编辑、校对 武晓兰)土地面积法定单位及其大致使用场合关于土地面积的法定计量单位,已于1990年12月28日由农业部、国家土地管理局和国家技术监督局联名发部的文件(该文件经国务院批准)中公布(见下表),从1992年1月1日起实施.土地面积法定单位及其大致使用场合名称中文符号国际符号换算关系大致使用场合平方千米,平方公里千米2km 21km 2=106m 2国家版图,地区疆域面积公顷公顷hm 21hm 2=104m 2=15市亩耕地、林地、草地面积平方米米2m2建筑面积,宅基地面积 注:土地面积单位“亩”是非法定单位,应停止使用.17 第1期 魏凡华等:巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
毕赤酵母表达系统研究进展作者：齐连权， 陈薇， 来大志， 于长明， 王海涛作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071刊名：中国生物工程杂志英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：2002,22(6)被引用次数：11次1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04)2.查看详情3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 19924.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichiapastoris[外文期刊] 2000(1)5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29)6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08)7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03)8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03)9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03)10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04)11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02)12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 199713.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1)14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊]2001(04)15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)16.Werten M W;van den Bosch T J;Wind R D High yield secretion of recombinant gelatins by Pichia pastoris 199917.Callewaert N;Laroy W;Cadirgi H Use of HDEL tagged Trichoderma reesei mannosyl oligosaccharide 1 2 alpha D mannosidase for N glycan engineering in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(23)18.Hilario E;Lataro R C;Alegria M C High level production of functional muscle alpha tropomyosin in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(04)19.Choi B K;Jimenez Flores R Expression and purification of glycosylated bovine betacasein(L70S/P71S) in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(04)20.Borgheresi R A;Palma M S;Ducancel F Expression and processing of recombinant sarafotoxins precursor in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(08)21.Cregg J M;Cereghino J L;Shi J Recombinant proteinexpression in Pichia pastoris[外文期刊] 2000(01)1.张伍魁.范清林.宋礼华.ZHANG Wu-kui.FAN Qing-lin.SONG Li-hua毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用[期刊论文]-中国生物工程杂志2006,26(1)2.隋少飞.陈松林巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展[期刊论文]-生物技术通报2004(3)3.龙晶.杜立新.LONG Jing.DU Li-xin巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展[期刊论文]-微生物学杂志2007,27(6)4.黄石.邹民吉.徐东刚毕赤酵母分泌表达系统的研究进展[期刊论文]-医学研究通讯2004,33(7)5.杨梅.温真.林丽玉.杨彩云.Yang Mei.Wen Zhen.Lin Liyu.Yang Caiyun毕赤酵母蛋白表达系统研究进展[期刊论文]-生物技术通报2011(4)6.樊建勇.王刚.刘玉峰毕赤酵母表达系统[期刊论文]-国外医学(预防、诊断、治疗用生物制品分册)2003,26(5)7.韩雪清.刘湘涛.尹双辉毕赤酵母表达系统[期刊论文]-微生物学杂志2003,23(4)8.彭彦孟.连继勤毕赤酵母表达系统[期刊论文]-国际检验医学杂志2007,28(7)9.欧阳立明.张惠展.张嗣良.刘志敏.OUYANG Li-Ming.ZHANG Hui-Zhan.ZHANG Si-Liang.LIU Zhi-Min巴斯德毕赤酵母的基因表达系统研究进展[期刊论文]-生物化学与生物物理进展2000,27(2)10.娄瑞娟.罗利龙.张霞.张瑞刚.宋水山.LOU Rui-juan.LUO Li-long.ZHANG Xia.ZHANG Rui-gang.SONG Shui-shan巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前景展望[期刊论文]-生物学杂志2010,27(5)1.张旦旦.窦文芳.许正宏.史劲松基于蛋白酶活性控制的重组人β干扰素毕赤酵母表达体系优化[期刊论文]-中国医药工业杂志 2012(9)2.张淑琼.高娟.曾思遥.蒋再学.陈瑞爱.罗满林犬IFN-α优化基因的真核表达及抗病毒活性的研究[期刊论文]-中国畜牧兽医 2012(8)3.窦文芳.张旦旦.许泓瑜.金坚.许正宏.史劲松.陆震鸣提高重组表达体系相对活性促进外源蛋白表达：人干扰素毕赤酵母表达体系研究[期刊论文]-食品与发酵工业 2011(11)4.曾松荣.王艳萍.杨明重组毕赤酵母发酵牛肉风味肽的中试研究[期刊论文]-中国生物工程杂志 2008(10)5.朱骞.张汇东.葛菲菲.缪勤.曹瑞兵.陈溥言.徐汉坤犬白细胞介素2在毕赤酵母中的诱导表达及生物活性的测定[期刊论文]-农业生物技术学报 2007(4)6.蔡梅红.张素芳.曹瑞兵.郭伟玲.陈溥言重组酵母鸡γ干扰素的抗病毒活性测定及临床初步应用[期刊论文]-微生物学报 2006(1)7.曹瑞兵.周国栋.周海霞.包晶晶.陈溥言猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用[期刊论文]-微生物学报 2006(3)8.龙元.刘钟滨基因工程植酸酶表达的优化途径和方法[期刊论文]-同济大学学报（医学版） 2006(z1)9.季刚鼠抗人CD2基因工程抗体嵌合Fab的构建和表达[学位论文]博士 200610.肖生科.王磊.陈毓荃提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展[期刊论文]-生物技术通报 2004(2)11.赵玉美洲商陆抗病毒蛋白Ⅰ和Ⅱ基因功能的研究及叶片中抗病毒蛋白的分离[学位论文]博士 200412.王强应用建立的DNAshuffling配套技术平台改良tPA分子性质的研究[学位论文]博士 200413.曹瑞兵重组猪α、β和γ干扰素的研制及其抗病毒作用[学位论文]博士 2004本文链接：/Periodical_swgcjz200206010.aspx。