PCR技术的基本原理

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引物
引物（primer），是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增
形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引
物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定
在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结
合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的DNA
为模板，引物是从3'端开始延伸， 其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，
PCR技术的基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的
寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即
“长产物片段”)结合。引物在与新链结时， 由于新链模板的5'端序列是固定的， 这就等于
这次延伸的片段3'端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内
、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产
引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。
10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增
片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶
序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制
链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又
可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放
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类型
引物设计原则
常用引物设计软件
类型
引物设计原则
常用引物设计软件
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编辑本段类型
存在有自然中生物的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为
DNA引物）。一般所说引物，指DNA引物，以下简称引物。
编辑本段引物设计原则
。（2）体外人工合成DNA中，可与模板结合的单链核苷酸片段。
所属学科：
细胞生物学（一级学科）；细胞遗传（二级学科）
定义4：
含游离3'-羟基并引发聚合反应的寡核苷酸序列。
所属学科：
遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）
所属学科：
生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科）
定义2：
列。
所属学科：
水产学（一级学科）；水产生物育种学（二级学科）
定义3：
（1）DNA复制时，由引物酶催化合成的DNA复制的RNA引导序列
物片段”则以算术倍数
增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就
能保证足够纯DNA片段供分析
1. Polymerase Chain Reaction 具体内容点击： 聚合酶链式反应，简称PCR。又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 由美国科学家PE（Perkin Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年化学诺贝尔奖。 是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6. 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%间，Tm值最好近72℃
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm
9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
大几百万倍。(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终
的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩
增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理
所有的DNA的复制都是从一个固定的起始点开始的，而DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链，不能从头合成DNA链，新DNA的复制是如何形成的？经大量实验研究证明，DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶从RNA引物3’端开始合成新的DNA链。
引物
科技名词定义
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
11. 引物应具有特异性。
论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的D
NA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称
平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多
数情况下，平台期的到来是不可避免的。
8. 5′ 端和中间△G值应相对较高3′ 端较低
△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）