CRISPR技术操作指南

CRISPR技术操作指南

十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR 结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里，CRISPR 方法已迅速席卷了整个动物王国，成为DNA 突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用CRISPR 分析了人类细胞中几乎每个基因单突变（详细报道Science：

CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：张峰建立CRISPR/Cas9

人细胞敲除体系）。就在最近，CRISPR 还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断（gene disruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在小鼠中实现过，但未在灵长类动物中完成过（详细报道Cell：中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴）。

CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达CRISPR 相关酶，也就是Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA，阻止病毒完成其功能。

将CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个Cas 酶，用于切断靶标DNA，比如目的基因中的DNA 片段，

另外一个就是称为导向RNA （gRNA）的RNA 分子，这种分子能通过互补结合靶标。gRNA 也就是细菌细胞中CRISPR RNA 的一个更短的版本，它能与Cas 形成复合物，指导Cas 到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。

“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，她与她的同事解析了细菌细胞中CRISPR 的作用机制。近期，Doudna 研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。

不过CRISPR 技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些gRNA 分子结合的DNA 只是部分与gRNA 互补。在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和TALENS 可能要比Cas - gRNA 更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶标DNA 序列。但是ZFN 和TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比gRNAs 难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的TALENS，以及几十个不同的ZFNs，来证明其中一个有效。

近期《科学家》（The Scientist）杂志汇总了基因编辑过程中Cas 和gRNA 的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。

如何CRISPR 我的靶标？

由于CRISPR 系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达Cas 和gRNA）的细胞进行转染。研究人员可以采用一种Cas 的变体，即Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由RNA 进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切断与gRNA 结合的DNA 链，也能切断其互补链。目前可以从Addgene 购买Cas9 质粒（65 美元），将其直接转染入细胞。

gRNA 的长度约为80 个核苷酸，包含两个区域：gRNA 5' 端前20 个核苷酸对应于靶标DNA，能结合在靶标DNA 上，剩余的

约60 个核苷酸（gRNA 长度取决于表达gRNA 的质粒）形成一个发夹结构，这个结构能帮助gRNA 与Cas9 结合，并由此指导与DNA 的结合。

gRNA 与Cas9 一样，也是通过质粒表达的，从Addgene 可以购买几种这种质粒（65 美元），但是与Cas9 不同的是，我们需要自己定制与靶标相匹配的表达质粒。我们可以设计一个编码20 个碱基，与靶标DNA 结合的片段，将其克隆进表达质粒里（编码gRNA 其它部分的60个核苷酸已经在质粒中了）。唯一的设计要求就是，gRNA 上要有一个片段，能与由任意核苷酸序列（N）+5' 末端两个胞嘧啶核苷酸（-NCC）的DNA 结合。这是因为gRNAs 似乎与相对链包含两个鸟嘌呤残基（-NGG）的DNA 片段结合最好，这种-NGG序列也就是PAM 结构（protospacer adjacent motif）。要在靶标DNA 区域中挑选合适的20 个碱基对，有几个方案可以选择，比如麻省理工学院的CRISPR Design（）；德国癌症研究中心开发的E-Crisp

（/E-CRISP/designcrispr）；还有ZiFiT targeter （/ZiFiT/ChoiceMenu）。另外也可以筛选整个基因组，找到与你的靶标位点相似的其它位点。

其中只有CRISPR Design 和E-Crisp 可以预测哪些gRNA 序列特异性最强，ZiFiT 不具有这种功能。但是由于这些预测位点周边的不确定性，研究人员仍然无法确保gRNA 的严格特异性，因此

专家们通常建议检测至少3-5 个不同的gRNA。这些序列可以通过例如Sigma Aldrich 公司，或者Integrated DNA Technologies 公司合成，每个费用大约为10-20 美元。

虽然Cas9 和gRNA 能通过各自的质粒来表达，但是研究人员也可以选择在同一个质粒中表达gRNA 和Cas9，这对于难转染的细胞来说比较合适，比如免疫细胞。Addgene 公司也提供这种双表达质粒（价格为65 美元）。不过为了快速地测试不同的gRNAs，研究人员可以利用PCR 构建编码gRNA 的DNA 片段，其中包含激活表达的启动子，然后将这个片段与携带Cas9 的质粒一同转染细胞。这种方法无需克隆gRNA 表达质粒，可以节约两天时间，来自Broad研究院的张锋表示。

一旦你已经在细胞中表达了gRNA 和Cas9 酶，那么这一复合物就能完成余下的工作，轻而易举地切断靶标DNA 的两条链。尽管细胞的DNA 修复机制会试图修补片段，但是由于存在一个称为非同源末端连接（nonhomologous end joining）的过程，因此往往最终会删除或添加一个或两个核苷酸，造成移码突变，阻止基因表达。这样通过靶向基因起始位点的周围区域，研究人员就能阻断几乎所有的表达。

如何检测基因编辑的效率？