抑菌试验操作规程

抑菌试验操作规程

1．范围

本规程适用于所有益生菌抑菌活性的测定。

2．试验前准备

设备及器材：高温蒸汽灭菌锅，超净工作台，酒精灯，恒温摇床，恒温水浴锅，恒温培养箱，平皿（直径9cm），牛津杯（内径6mm，外径8mm，高10mm），移液管（10ml），微量移液器及吸头（1ml、200ul）。

3．操作步骤

3.1 病原菌的制备

3.1.1 病原菌：鸡致病性大肠杆菌，鸡致病性大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。

3.1.2病原菌扩培：在超净工作台内，挑取一环病原菌接种于100 ml无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200 rpm，培养8~12h，即为扩培好的病原菌悬液。

3.2 检测样品的制备

3.2.1 乳酸菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶置于恒温培养箱内，37℃静置培养24~48h，即为扩培好的乳酸菌菌悬液。

3.2.2 芽孢杆菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶置于恒温摇床内固定，在适宜条件下培养14~18h，即为扩培好的芽孢杆菌菌悬液。

3.2.3 无细胞发酵上清液的制备：在超净工作台内，吸取扩培好的乳酸菌（或芽孢杆菌）菌悬液10ml，移入到无菌的50ml离心管中，旋紧离心管盖，于8000 rpm/min，离心15min，离心结束后，于超净工作台中，吸取5ml上清液，用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤，即为无细胞发酵上清液。

3.3 双层平板的制备

3.3.1 制备琼脂含量为2.0%的MH肉汤培养基，冷却至60℃左右，用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到水平放置的无菌平皿中，洁净工作台中晾干；3.3.2 用无菌镊子取6个事先灭过菌的牛津杯均匀放在上述倒有琼脂的平皿中，

放置牛津杯时动作要轻；

3.3.3 制备琼脂含量为1.0%的MH肉汤培养基，冷却至55℃左右（琼脂培养基可置于55℃的恒温水浴锅中保温），每100ml MH软琼脂培养基接种0.1ml指示菌，混合均匀；用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到事先放好牛津杯的平板上，于超净工作台中晾干后，立即进行抑菌试验。

3.4 加样

在牛津杯的孔中加入200μl菌悬液（或无细胞发酵上清液），同时以相应的培养基作为阴性对照。加样前要在双层平板上做好标记，以免错加或漏加。加样后的平板，不能随意移动，要保持水平轻拿轻放。

3.5 培养及结果观察

加样结束后，将平板置于恒温培养箱中，37℃培养12~14h，即可观察结果。用游标卡尺测定抑菌圈直径，当抑菌圈直径大于10mm，即认为检测样品对指示菌有抑菌作用。

童京京

2015-1-15