人成骨细胞原代培养

人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定

中国组织工程研究第19卷第32期 2015–08–06出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155www.CRTER .org肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。

通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaAccepted: 2015-07-01人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红1，张阳春2，张常然1，杨兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700)文章亮点：1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。

骨骼肌细胞原代培养

骨骼肌细胞原代培养骨骼肌细胞是我们身体中最重要的肌肉组织之一，通过细胞的原代培养可以帮助我们更好地研究肌肉的生理和病理过程。

本文将介绍骨骼肌细胞原代培养的方法和意义。

一、骨骼肌细胞原代培养的方法1. 细胞来源骨骼肌细胞可以从人体或动物体内获得。

人体来源的骨骼肌细胞可以通过手术获取，动物来源的骨骼肌细胞可以通过解剖或抽取组织获得。

2. 细胞分离将获得的骨骼肌组织进行消化，分离出单个的骨骼肌细胞。

常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶，通过适当的温度和时间来进行消化。

3. 细胞培养将分离出的骨骼肌细胞放入培养皿中，加入适当的培养基，提供细胞所需的营养物质和生长因子。

培养基的配方和组成会因实验目的的不同而有所差异。

4. 细胞传代原代培养的骨骼肌细胞会在培养过程中逐渐增殖，达到一定的细胞数量后，可以进行细胞传代。

传代可以保持细胞的稳定性和生物学特性。

二、骨骼肌细胞原代培养的意义1. 生理研究通过骨骼肌细胞原代培养，可以研究肌肉的生理功能和调控机制。

例如，可以研究肌肉收缩机制、肌肉代谢和能量平衡等方面的问题。

2. 病理研究骨骼肌细胞原代培养还可以用于研究肌肉疾病的发生机制和治疗方法。

例如，可以利用培养的肌肉细胞模拟某些疾病的发生过程，寻找治疗的靶点和药物。

3. 药物筛选骨骼肌细胞原代培养可以用于药物的筛选和评价。

通过在培养的肌肉细胞中加入不同的药物，观察细胞的反应和变化，可以评估药物的疗效和毒副作用。

三、骨骼肌细胞原代培养的注意事项1. 细胞来源的选择在进行骨骼肌细胞原代培养前，需要选择合适的细胞来源。

不同的细胞来源可能会影响培养结果和实验的可行性。

2. 培养条件的优化骨骼肌细胞原代培养需要适宜的培养条件，包括培养基的配方、温度、湿度和CO2浓度等。

这些条件需要根据实验的要求进行优化。

3. 细胞的纯度和活性在骨骼肌细胞原代培养过程中，需要保证细胞的纯度和活性。

细胞的纯度可以通过筛选和分离的方法进行提高，细胞的活性可以通过细胞活力试剂盒进行检测。

iCell原代软骨细胞培养体系

iCell原代软骨细胞培养体系
产品编号：PriMed-iCELL-020
产品规格：500ml/kit
产品价格：1980
产品介绍：
iCell原代软骨细胞培养体系是一个为体外生长的人、大鼠、小鼠、兔等哺乳动物的软骨细胞设计的理想的完全培养基方案。

本体系是一个基于碳酸氢盐的缓冲体系，可以在孵育的5%的CO2的气体环境下维持一个围绕pH7.2的酸碱缓冲体系。

本体系是一个无菌的液体混合系统，其中包含必须和非必须氨基酸、维生素、激素、生长因子、微量元素和一些其他的有机和无机化合物以及一个低浓度的胎牛血清（5%）。

本培养体系是基于固定配方配制的液态培养体系，可以为体外培养的人、大鼠、小鼠、兔等哺乳动物的软骨细胞提供一个确定适宜的平衡营养环境，并且可以选择性的促进软骨细胞的扩增。

运输和保存：
放置于含有生物冰袋的保温箱中低温运输（体系中的各组分请按上述列表中的条件进行储存）
产品使用：
1.本产品仅能用于科研
2.本产品未通过直接用于活体动物和人的审核
3.本产品未通过用于活体诊断的审核。

原代培养

❖免疫检测：一两种血清学检测 ❖细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名
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细胞克隆
• 克隆（clone）: 指单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。
• 细胞克隆化培养（cell cloning culture）:指将单个细胞在一定支持物上（如软琼脂或甲基纤维素）增殖培养而产生的细胞群落。
• 有均一性
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细胞系（cell line）：原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞谱系所组成。有限细胞系（finite cell line）：不能继续传代或传代数有限连续细胞系(continuous cell line)：可连续传代，即 “已建成的细胞系”（established cell line）
再用0.25%胰蛋白酶-柠檬酸盐消化液处理 • 用EDTA溶液洗细胞，再用0.25%胰蛋白酶-1mmol/L
EDTA消化细胞 • 用1mmol/L EDTA洗细胞，然后用0.25%胰蛋白酶和
200μ/ml胶原酶，配合柠檬酸盐或EDTA消化细胞 • 机械刮削法 • 在培养液中加入分散酶(0.1mg/ml)或蛋白酶(0.1～
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培养液的更换培养液的pH值下降细胞浓度细胞类型细胞形态学
视频
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第四节细胞系与细胞克隆
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组织培养常用术语
原代培养（primary culture）：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。
传代培养（passage culture）：将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代培养。
开蛋壳，玻璃棒挑出鸡胚
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小鼠胚胎的剖取过程（13天）
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Байду номын сангаас

人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达

人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。

方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs，取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定；应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。

结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90，具有成脂和成骨分化潜能。

成骨相关基因在诱导早期部分表达，中期均有表达，基因表达大部分在14天达高峰，与矿化相关的基因表达在21天达高峰。

结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达，其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。

Abstracts:ObjectiveTo investigate the osteogenic related genes expression during in vitro osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells (hBMSCs).MethodshBMSCs were isolated by density gradient centrifugation. Surface markers and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The multiple differentiation potential of hBMSCs were identified using in vitro osteogenic and adipogenic induction. The osteogenic related genes expression of hBMSCs at different induction time point were evaluated by semiquantitative RT-PCR analysis.ResultsThe hBMSCs were derived from bone marrow and expressed CD44 and CD90, markers of mesenchymal stem cell. The second passage of hBMSCs showed adipogenic and osteogenic differentiation potential. During the osteogenic induction process,hBMSCs expressed part of osteogenic related genes in early stage, and all of them in middle stage.The peak expression of most of genes were on the 14th day, and the mineralization associated genes on the 21st day. ConclusionsThe osteogenic related gene expression of hBMSCs shows a dynamic progress during in vitro osteogenic induction, which is consistent with in vivo development of osteoblast.Key words:hBMSCs;in vitro differentiation;osteogenic genes;expression pattern骨缺损的修补和重建是修复重建外科临床面临的常见问题。

成骨细胞培养

成骨诱导液：地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C，OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphatePG(磷酸甘油)和Vc配好放四度，Vc尽量分装保存，减少与空气接触，三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。

用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消化90 min，1 000 r/min 离心10 min，使细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除骨碎片。

所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。

于37 ℃，含体积分数5%CO2培养箱培养。

48 h后换液，以后隔日换液1次。

成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。

将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。

成骨细胞鉴定：活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。

Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。

待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。

碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min，按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。

原代和传代细胞的培养和维持

原代和传代细胞的培养和维持一、原代细胞的培养与维持1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%．在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。

贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。

其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。

2、悬浮细胞的培养凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞．若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。

悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式．二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture)这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。

每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。

传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。

应注意如下几点：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。

(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。

细胞生物学实验细胞原代培养

细胞从植块向外迁移，随着培养时间延长，在植块周围形成一圈细胞 — — “ 晕 ” ，称之为生长晕 ( growth hallow)。
• 2、离散细胞培养：有单细胞贴壁或分裂成片
培养观察一般项目
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次。观察的内容包括：
严重者细胞脱壁悬浮。
9．将植块置于12孔培养板的培养孔中央，每孔5块，间隔约2mm，
布局合理，粘膜面向上，轻轻按压每块植块，使其紧贴培养板的
表面；
10．沿培养孔的边缘，缓慢加入约0.5ml的完全MEM培养液，
勿使培养液与植块接触；
11．将培养板置于370 C
、
５％CO2培养箱中预孵育1小时；
12．每孔加完全MEM培养液2ml，轻拿轻放，切勿使植块飘
• 学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。
实验原理
• 模仿体内生长环境，使来自机体的细胞、组织、器官能够在人工培养条件下生存、生长、繁殖。
•
培养用主要仪器设备
1、纯水设备：纯水仪 2、干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、
过滤器及0.22 m滤膜； 3、超净工作台 4、培养设备：普通培养箱、CO2培养箱； 5、贮存设备：冰箱、液氮罐 6、观察设备：倒置显微镜 7、其他设备：天平、离心机、水浴锅等
关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯 (一切操作均需在酒精灯火焰下进行)
将消毒过的所用物品放入超净工作台中
植块培养法培养鸡心肌细胞步骤
一、配M199完全培养液：
M199基础培养液 90％
小牛血清
10％
青霉素链霉素
100IU/ml 100g/ml
过滤除菌。
二、获取心脏
① 消毒鸡胚蛋：泡入70％酒精 ② 取出鸡胚，Hank’s液洗涤。 ③ 取出心脏，放入Hank’s液中。

原代造血干细胞培养

原代造血干细胞培养
1. 细胞来源，造血干细胞可以从骨髓、外周血或者胎盘等多种来源获得，不同来源的细胞可能有不同的特性，需要根据实验目的选择合适的来源。

2. 细胞分离，从原代组织中分离出造血干细胞需要使用适当的分离方法，比如密度梯度离心、免疫磁珠分选等，以保证分离的细胞具有较高的纯度和活力。

3. 培养条件，原代造血干细胞在体外培养时需要提供适当的营养物质、生长因子和培养基，同时也需要控制适当的温度、湿度和气体环境，以提供良好的生长条件。

4. 培养监测，在培养过程中需要定期观察细胞的形态、增殖情况和表型特征，以及对细胞进行鉴定和纯度检测，确保培养的细胞符合实验要求。

5. 应用领域，原代造血干细胞培养在干细胞治疗、造血系统疾病研究、药物筛选等领域具有重要的应用前景，可以为相关疾病的治疗和研究提供重要的实验材料。

综上所述，原代造血干细胞培养是一项复杂而重要的实验技术，需要在细胞来源、分离方法、培养条件和监测等方面进行严格的操
作和控制，以确保获得高质量的细胞用于后续的研究和应用。

骨髓间充质干细胞-MSC-原代培养与传代培养

骨髓间充质干细胞(MSC)原代培养与传代培养准备工作（1）试管、试管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、烧杯、橡皮头、剪刀、镊子、纱布、棉球、酒精灯、滴管、移液器、细胞计数器、生理盐水、PBS、双抗（青链霉素）、75%酒精、95%酒精、培养瓶（50ml，260ml）。

（2）BALB/C小鼠（4~5周龄，18~22g，雌雄不限）、胎牛血清（灭活）、DMEM-LG 培养液（美国GIBCO）（3）针头与注射器：4.5号、7号针头（冲小鼠股骨、胫骨和肱骨骨髓，制单细胞悬液）。

实验前准备（1）实验室消毒，隔离衣消毒，小鼠固定架消毒。

配10%FBS培养液，加双抗（内含青霉素、链霉素各100μg/ml）。

（2）用75% 酒精擦拭无菌操作台面，取各种已消毒的培养用品置于超净台面，无菌室及超净台用紫外灯照射30~60 分钟灭菌。

（3）开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

穿隔离衣，戴手套。

用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。

点燃酒精灯，安装吸管帽。

实验步骤（1）BALB/C纯系小鼠脱臼处死后，75%乙醇浸泡5min后，在无菌操作台上无菌条件下分离双侧股骨及胫骨，在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用10ml注射器（配4.5号针头）抽取适量含10%FBS的完全培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。

依次用7号针头和4.5号针头（或依次过21、23、25号）反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液。

细胞悬液在1000rpm离心5min后收集细胞或进行密度梯度离心。

（2）将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管中，4℃条件下，经500g密度梯度离心25min，小心收集离心液界面上乳白色云雾状的单核细胞层，加入等量无血清培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤（500g离心5min或180g离心10min）2次，去上清，用10%FBS的培养基悬浮细胞（用0.83%氯化胺破碎红细胞，培养液重悬细胞）。

原代培养定义

原代培养定义原代培养，是指在实验室中通过无菌技术，将细胞或组织从生物体中分离出来，以培养基为基础，创造一个适合其生长和繁殖的环境，从而使其在体外进行生长和繁殖的过程。

原代培养是一项重要的实验技术，在生物学和医学研究中具有广泛的应用。

通过原代培养，我们可以观察和研究细胞的特性、功能以及对外界环境的反应。

同时，原代培养还可以为疾病的研究和治疗提供重要的实验基础。

在进行原代培养时，首先需要选择合适的培养基。

培养基中包含了细胞所需的营养物质、生长因子和激素等，以提供细胞生长所需的条件。

然后，将细胞或组织分离出来，通过切割、酶解等方法，将其转移到含有培养基的培养皿中。

接着，将培养皿放入恒温培养箱中，控制好温度、湿度和气体成分等条件，使细胞在体外进行生长和繁殖。

原代培养的成功与否，往往取决于细胞的纯度和活力。

因此，在进行原代培养时，需要严格控制操作的无菌性，避免细菌和其他微生物的污染。

此外，还需要合理选择细胞的来源和处理方法，以确保细胞的活力和功能不受损害。

原代培养的过程中，细胞的生长和繁殖需要提供适当的营养物质和环境条件。

在培养基中添加适当的营养物质和生长因子，可以促进细胞的生长和分裂。

同时，还需要控制好培养环境的温度、湿度和气体成分等因素，以保证细胞在最适宜的条件下进行生长和繁殖。

原代培养的时间长短和成功率会受到多种因素的影响。

例如，细胞的来源、处理方法、培养基的配方和培养条件等都会对原代培养的效果产生影响。

因此，在进行原代培养时，需要根据具体情况进行合理的设计和调整，以提高培养的成功率和细胞的生长质量。

原代培养是一项重要的实验技术，对于生物学和医学研究具有重要意义。

通过原代培养，我们可以观察和研究细胞的特性和功能，为疾病的研究和治疗提供重要的实验基础。

然而，原代培养的成功与否需要严格控制操作的无菌性、合理选择细胞的来源和处理方法，并提供适当的营养物质和环境条件。

只有在合适的条件下，才能实现细胞的生长和繁殖，从而取得准确可靠的实验结果。

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化闵敏;张雪静;马红;许辉;李遇梅【摘要】目的:建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性.初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制.方法:剖宫产手术获得腹部皮下脂肪,0.15％Ⅰ型胶原酶消化法获得人脂肪间充质干细胞并进行体外培养.行MTT细胞增殖实验绘制增殖曲线,使用流式细胞及细胞免疫荧光技术检测细胞表面抗原,行成骨成脂分化鉴定其分化潜能.通过RT-PCR技术检测成骨成脂过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2 (peroxisome proliferator activated receptorγ-2,PPARγ-2)和骨桥蛋白mRNA表达情况.结果:通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的人脂肪间充质干细胞.MTT法显示细胞增殖能力强.流式细胞鉴定结果显示,CD29、CD73、CD105、CD166高表达,CD31、CD34、CD45、HLA-DR 低表达.细胞免疫荧光结果与之相符.hADSCs在特定诱导条件下,具有成骨成脂分化潜能.在成骨分化过程中同时伴有成脂发生.RT-PCR结果显示,与对照组相比,成脂诱导组PPARγ-2 mRNA有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义(P＜0.01).与对照组相比,成骨诱导组骨桥蛋白,PPARγ-2 mRNA均有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论:建立了一种分离培养hADSCs简单可靠的方法.获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性强、干细胞表型以及多向分化等特征.hADSCs体外成骨过程中,三酰甘油的形成对成骨具有一定的促进作用.%Objective:To establish the isolation and culture method of human adipose-derived mesenchymal stem cells (hADSCs) derived from human adipose in vitro,so as to explore their morphology,identify cell surface markers,observe biological properties,and discuss the possible causes and mechanism ofthe phenomenon of hADSCs' osteogenic differentiation accompanying with synthesis of triglycerides.Methods:Human adipose tissue were obtained from abdominal operation.The hADSCs were isolated from human adipose tissue by 0.15％ collagenase digesting.The cells were applied to do the experiments:MTT method,flowcytometry,immunofluorescence.Its differentiation potential was proved by osteogenic and adipogenic differentiation.The osteogenic and adipogenic related genes:PPARγ-2,osteopontin expression were detected by real-time fluorescent quantitative PCR technique.Results:After isolation and culture,we obtained a large amount of hADSCs,which grew like swirls.MTT revealed high capability for and proliferation.The flow cytometry showed CD29 +,CD31-,CD34-,CD45-,CD73 +,CD105 +,CD166 +,HLA-DR-,which fit the results of immuno fluorescence.Moreover,these cells could be functionally induced into adipocytes and osteoblasts in the presence of appropriate conditioned media.During osteogenic differentiation,we found it accompanying with the synthesis of triglycerides.RT-PCR results proved that during the differention process,osteogenic and adipogenic related genes began to be expressed gradually,which had statistically significant(P ＜0.01).Conclusion:Highly efficient isolation and cultivation methods for hADSCs have been developed.They are a kind of mesenchymal cells with great application prospect,which characterized with adherent growth,high proliferation,stem cell phenotype and multipotent differentiation.During vitro osteogenic differentiation,the triglyceride formation has a certain role in promoting osteogenesis.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(023)003【总页数】6页(P185-190)【关键词】人脂肪间充质干细胞;鉴定;成骨分化;成脂分化【作者】闵敏;张雪静;马红;许辉;李遇梅【作者单位】江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001;镇江市第二人民医院皮肤科,江苏镇江212002;江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001【正文语种】中文【中图分类】R329.2对于间充质干细胞的研究，最初的对象是骨髓间充质干细胞，并且已经形成了成熟的分离培养方法［1］。

胰蛋白酶预消化后植块法分离培养人胚成骨细胞

马勇江 ☆ ，，９４年生，西省临川市人，族，０４年西北农林科男ｌ７江汉２ｏ技大学毕业，士，师。博讲主要从事哺乳动物胚胎工程与干细胞工程研
究。
ＭａＹ．ｏＹｉＧ，ｈｇＹＩｏａｉｎａｄｃｌｒｆｈｍａｅａｓｅｂａｔｙＪＤｕＺ．ｋＹＺａｎｌｔｎｕｕｅｏｕｎｆｔｌｔｏｌｓｓｂｓｏｔｏｅｐａｔｍｅｈｄｏｅｒｐｉｒｄｇｓｉｎＺｏｇｕｉｃｕｎｎＣ０６１｛７：ｘｌｎｔｏｆｒｙｓｐｅｉｅｔｈｎｇｏＬｎｈａｇＫａＫｕ２０；３）ｔｎｏ０３ — （ｈｎｌ６８Ｃｉａ
天，骨块边缘出现零散的细胞，些细胞的形态主要为梭形、角形或这三多边形。原代培养第ｌ后，成融合层，胞呈圆形、圆形或方形４天形细卵紧密排列，层生长。传代细胞主要呈三角形或方形细胞，胞排列无叠细方向性，现集落样生长趋势。（出人胚成骨细胞的鉴定结果：０９％以上
・
基础研究・
胰蛋白酶预消化后植块法分离培养人胚成骨细胞
马勇江，忠英，玉谷，窦李张媛
术术 ☆
华南农业大学兽医学院，东省广州市５０４；北农林科技大学广１６２西

成骨细胞原代培养

成骨细胞原代培养
成骨细胞是一类能够形成骨组织的细胞，它们可以通过原代培养的方法进行研究。

下面是成骨细胞原代培养的步骤：
1.选择合适的细胞来源：成骨细胞可以来源于小鼠、大鼠、人等，根据研究需要选择合适的动物或人类来源。

2.预处理组织：从动物或人体中取出骨骼组织，去除软组织和肌肉，然后将骨骼切成小块。

3.分离成骨细胞：用酶等物质对骨骼块进行消化，获得含有成骨细胞和间充质细胞的细胞悬液。

4.培养：将获得的细胞悬液接种在含有成骨细胞培养物的培养皿中，培养温度为37℃，CO2浓度为5%。

5.细胞传代：细胞在生长过程中会不断分裂，可以将细胞培养到达一定密度后用胰酶等物质分离，得到更多的细胞用于后续实验。

通过原代培养方法获得的成骨细胞具有更高的细胞活力和稳定性，适合用于体外研究成骨细胞的生物学特性和调控机制。

现代医学实验学-成骨细胞的培养和骨折模型的制作

3.培养基问题：低糖的DMEM培养基
4.培养瓶培养瓶在接种前，使用1%多聚赖氨酸快速包被（具体方法：每个50ml培养瓶加3-4ml1%多聚赖氨酸，尽量是底壁均铺满液体，拧上盖子，放置30min，倒掉1%多聚赖氨酸液体，用去离子水或PBS 液冲洗两遍），包被的培养瓶，细胞很容易贴壁。
大鼠成骨细胞
2铝
目前认为一些疾病如骨质疏松、骨软化等与铝中毒有关。铝蓄积于骨骼，对骨骼和神经系统等产生危害。文献报道低浓度铝可刺激体外培养的成骨细胞的增殖和分化，铝对成骨细胞的作用不受培养液中生长因子变化的影响。高剂量铝可抑制成骨细胞的生长发育并对其产生一定的毒性作用
3氟
氟一方面作为骨基质构成物参与骨形成过程，另一方面，过量的氟摄入可导致齿、骨等组织及器官的损害。体外研究则表明，氟通过对成骨细胞的有丝分裂的作用促使成骨细胞的生长速度加快、数量增多、功能增强。氟对成骨细胞的作用与铝有所不同，需依赖于培养液中部分生长因子，除去这些生长因子，可消除氟对成骨细胞的作用.
传代培养步骤
1.弃除旧的培养液（可以吸，可以倒，倒的时候小心） 2.用PBS冲洗一遍（加PBS清洗或换液时，不要将细胞冲刷下来） 3.用0.25%的胰酶消化液消化30-45s，在显微镜下观察，细部变圆，间距增大时，可用手拍打瓶侧壁与底壁，会发现细胞很快悬浮。 4.加入含15%的牛血清培养液终止消化 5.用吸管反复细心吹打瓶底，置离心管中后，可以用PBS或DHANKS再吹打，可以反复几次，目的是将细胞尽可能的洗刷干净
样细胞不会引起明显的改变 ,而单次高剂量辐射（ 400 cGy）却使克隆成骨细胞系MC3T3-E1 的 ALP 活性增加. 2 微重力目前认为失重条件下骨形成受到抑制是造成骨质脱钙的主要原因，特别是成骨细胞数目的减少和活性

成骨细胞培养

成骨诱导液：地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C，OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphatePG(磷酸甘油)和Vc配好放四度，Vc尽量分装保存，减少与空气接触，三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。

用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消化90 min，1 000 r/min 离心10 min，使细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除骨碎片。

所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。

于37 ℃，含体积分数5%CO2培养箱培养。

48 h后换液，以后隔日换液1次。

成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。

将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。

成骨细胞鉴定：活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。

Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。

待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。

碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min，按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化
闵敏，张雪静，马红，许辉，李遇梅
（１．江苏大学附属医院皮肤科，江苏镇江２１２００１；２．镇江市第二人民医院皮肤科，江苏镇江２１２００２）
ＭＩＮＭｉｎ，ＺＨＡＮＧＸｕｅ－ｉｆｎｇ，ＭＡＨｏｎｇ，ＸＵＨｕｉ，ＬＩＹｕ．ｍｅｉ
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，ＡｉｌｆｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＺｈｅｎｊｉａｎｇＪｉａｎｇｓｕ２１２００１；２．ＤｅｐａｔｒｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｙ，ｔｇｈｅＳｅｃｏｎｄＰｅｏｐｌｅｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＺｈｅｎｊｉａｎｇ，ＺｈｅｎｊｉａｎｇＪｉａｎｇｓｕ２１２００２，Ｃｈｉｎａ）
伴有成脂发生。ＲＴ — ＰＣＲ结果显示，与对照组相比，成脂诱导组ＰＰＡＲｙ一２ｍＲＮＡ有时间依赖性递增表达，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。与对照组相比，成骨诱导组骨桥蛋白，ＰＰＡＲｙ一２ｍＲＮＡ均有时间依赖性递增表达，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．ｏ１）。结论：建立了一种分离培养ｈＡＤＳＣｓ简单可靠的方法。获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性

3种磨损颗粒对体外原代培养人成骨细胞的作用

3种磨损颗粒对体外原代培养人成骨细胞的作用王文良;吴岳嵩;焦炳华;杨柳;许建中;娄永华【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2003(25)24【摘要】目的比较 3种不同磨损颗粒对体外原代培养人成骨细胞的作用。

方法PE颗粒、TI 6Al 4V颗粒、Co Cr Mo颗粒加入体外原代培养的人成骨细胞 ,噻唑蓝 (MTT)比色试验检测细胞存活和生长。

用酶联免疫检测仪在 490nm波长处测定其吸光度值 ,可间接反映活细胞数量。

结果不同浓度、不同磨损颗粒对原代培养成骨细胞成活无明显影响。

结论不同浓度、不同磨损颗粒对原代培养成骨细胞成活无明显影响。

【总页数】3页(P2237-2239)【关键词】磨损颗粒;成骨细胞;人工关节;无菌性松动;细胞培养【作者】王文良;吴岳嵩;焦炳华;杨柳;许建中;娄永华【作者单位】第三军医大学附属西南医院骨科;第二军医大学附属长海医院骨科;第二军医大学基础医学部分子毒理学教研室【正文语种】中文【中图分类】R318.17;R329.24【相关文献】1.17β-雌二醇对体外培养人成骨细胞CTGF和PAIP-1基因表达的作用 [J], 翟木绪;彭依群;隋国良;王敏;廖二元2.孕酮对体外培养人成骨细胞增殖和分化的促进作用 [J], 梁敏;廖二元3.不同磨损颗粒对体外培养人外周血单核细胞的影响 [J], 李朋;杨淑野;张锴;贾龙;杜刚强;刘栋;张新军;张德刚;王志刚4.不同磨损颗粒对体外培养人外周血单核细胞的影响 [J], 李朋;杨淑野;张锴;贾龙;杜刚强;刘栋;张新军;张德刚;王志刚;5.铝对体外培养人胚成骨细胞毒性作用的研究 [J], 黄国伟;康静;董亚利;张文治因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。