第十章遗传工程

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第十章遗传工程
•几种重要的基因工程药物已可用真核细胞反应器完成
名称
α干扰素 乙肝疫苗 集落刺激因子 红细胞生成素 组织溶纤酶原激活剂
人生长激素
细胞
应用
酵母菌
治疗癌症抗病毒
酵母菌
预防病毒性肝炎
哺乳动物细胞 治疗血友病
哺乳动物细胞 治疗贫血症 哺乳动物细胞 治疗心脏病
昆虫细胞
促生长，增强免疫功能
第十章遗传工程
•限制性内切酶II及其产生的3种不同末端
•5'突出的粘性末端
•P
•EcoR I
•3'突出的粘性末端 •Pst I
•平末端
•P •P
•P •P
•EcoR V
•P
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第十章遗传工程
同切酶和同粘酶
同切酶: 识别相同的位点, 但生成不同的末端.
同粘酶: 识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端
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常用宿主
大肠杆菌: 繁殖快, 易培养, 易分离产物 噬菌体: 转化效率高, 易于保存 酵母: 繁殖最快的真核生物, 适于有蛋白质加工
的基因表达
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第十章遗传工程
•lacZ
•
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第十章遗传工程
•
三、转基因技术的应用
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第十章遗传工程
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第十章遗传工程
第二节 动物细胞工程
l 细胞工程：是利用细胞生物学和分子 生物学的方法，在细胞水平上进行的 遗传操作。分为微生物细胞工程、植 物细胞工程和动物细胞工程。
一、细胞融合 二、动物克隆技术
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第十章遗传工程
一、细胞融合
1、细胞融合：也称体细胞杂交，是一种在同 种或不同物种体细胞间，在融合剂存在的条 件下，自然的或人工的细胞水平的杂交过程， 获得的杂种细胞具有双亲的遗传属性。
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•同切酶
•Sma I
•5´ ... C C C^G G G ... 3´ •3´ ... G G G^C C C ... 5´
•Xma I
•5´ ... C ^ C CG G G ... 3´ •3´ ... G G GC C ^ C ... 5´
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•同粘酶
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连接酶及其对底物的要求: T4 Ligase, Ecoli Ligase
•底物:
•自由5’末端和自由3’末端, 5’末端带磷 酸基团 •反应条件：Mg++，ATP存在
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•其它工具酶
•聚合酶(polymerase): DNA聚合酶I, klenow片段, Taq, Pfu, 末端转移酶 •外切核酸酶(exonuclease): exo III, S1核酸酶, DNase I •脱磷酸酶(dephosphatase): 碱性磷酸酯酶CIP •磷酸化酶,激酶(kinase) •逆转录酶(reverse transcriptase) •RNase H, RNase A •甲基化酶(methylase)
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第十章遗传工程
载体及其构成基本要素
l 能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列 ARS和着丝粒, 端粒
l 方便插入外源片段: 单酶切位点 l 选择标记: 药物抗性 l 报告基因: 插入筛选标记
l 易分离提取 l 高产率（多拷贝） l 强启动子 l 多宿主
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第十章遗传工程
植物体几乎所有的体细胞都能在体外培养成新的
完整植株，单个性细胞（如花粉和未受精的子房 培养）也能未经两性结合而发育成新植株。
动物克隆技术的发展经历从胚胎细胞的克隆到体 细胞克隆的过程。胚胎细胞克隆是指将胚胎细胞 核移植到去核的卵母细胞中，由于胚胎细胞的全 能性，它比较容易经培养和移植获得基因相同的 个体。由于该技术产生的新个体并非是亲代的自 我复制，而是等同于多生了几个双胞胎，并未引 起世人注意。体细胞克隆可达到亲代个体的自我 复制。
□人生长激素是治疗侏儒症，青少年增 高和促进创伤组织修复的药物，生长激素 具有种属特异性，从动物脑组织来源的生 长激素不能用于人类，之前只能从刚死亡 的人大脑垂体中分离纯化，来源极有限； 而且发现长期应用会对人类有毒副作用。
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•该方法用于合成人胰岛素
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•19-15
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• 目前有几十种基因工程药物，常用的有 ：干扰素、白细胞介素、乙肝疫苗、人胰 岛素和人生长激素等。
• 人类最早的商业化基因工程药物是人胰 岛素和人生长激素，于80年代初投放市场 ，用大肠杆菌来生产，是基因工程 发展的 里程碑。
•
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□胰岛素是治疗糖尿病的重要药物，之 前从猪或牛的胰腺中提取分离，含量少而 且会有毒素。
3、PCR法
l PCR（polymerase chain reaction,聚合酶 链反应)：体外有引物介导的特定DNA序列 的酶扩增。
l PCR技术的原理：利用DNA本身的特性，变 性与复性,以达到扩增DNA分子的目的。
l PCR反应条件（反应体系组成）：模板、引 物、dNTP、Taq DNA聚合酶、缓冲液、灭 菌水、石蜡油。
2、细胞融合过程：两个细胞紧密接触→细胞 膜合并→细胞间出现通道或细胞桥→细胞桥 数增加扩大通道面积→两细胞融合为一体。
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•二、动物克隆技术
•1997年英国科学家Wilmut克隆羊的成功标志动物克 隆技术新的里程碑。 •克隆的基本概念：克隆意指无性繁殖（系），可分 为三个层次：基因、细胞、个体 • 个体克隆可分为植物克隆和动物克隆。
•BamH I
•5´ ... G^G A T C C ... 3´ •3´ ... C C T A G^G ... 5´
•Bgl II
•5´ ... A^G A T C T ... 3´ •3´ ... T C T A G^A ... 5´
•Sau3A
•5´ ... ^G A T C ... 3´ •3´ ... C T A G^ ... 5´
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常用载体
质粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬 粒(phagemid), 病毒，PAC，YAC，BAC
•特殊用途的载体
• 表达型载体， 分泌型载体，穿梭载体
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•宿主
•繁殖快, 易于培养, 能够快速得到产物 •对所携带基因的表达产物具有较高耐受性, 具有 克隆最多种基因的可能 •突变率低, 能够稳定忠实的保存被克隆基因
一、利用微生物基因工程生产重组基因工程药物
利用基因工程技术不但能得到大量的具有特殊 功能的基因。而且可以让这些特殊功能的基因 生产出具有特殊功能的蛋白质药物，这是目前 基因工程 领域中最活跃最有成果和极富商业价 值的领域之一，究其原因： （1）蛋白质和多肽是基因表达的直接产物，可 用重组DNA技术进行研究和生产。 （2）具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有 很高医疗价值的药物，用常规分离的方法很难 制取。
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2020/11/28
第十章遗传工程
第一节 遗传工程的概念
l 遗传工程(Genetic engineering):一般认为, 遗传工程是按照人们预先设计的蓝图,将 一种生物的遗传物质绕过有性周期导入另 一种生物中去,使其获得新的遗传性状,形 成新的生物类型的遗传操作。
l 遗传工程有狭义和广义之分，广义的遗传 工程包括细胞工程和基因工程；狭义的遗 传工程就是基因工程。
•3．克隆人不但面临社会、家庭伦理道德问题，也将面临 健康安全问题。
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第三节 基因工程
利用转基因手段对生物进行人为改造的技术
一、目的基因的获得 二、工具酶和载体 三、转基因技术的应用
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第十章遗传工程
一、目的基因的获得
（一）目的基因的获得 1、从基因文库分离基因 l 基因（组）文库：某一生物的全部DNA序
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第十章遗传工程
•动物克隆的基本过程
•以克隆羊为例，动物克隆的基本过程如下图
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第十章遗传工程
•□ 动物克隆的应用：
•1 ． 动 物 资 源 的 种质保存包括地 球上频危动物的 挽救等。
•2．生产移植器 官，培育优良品 种，与转基因技 术相结合研制生 物反应器生产基 因药物。
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第十章遗传工程
PCR原理
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PCR原理
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第十章遗传工程
二、工具酶、载体和宿主
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工具酶
A. 剪切酶类
有目的有选择的把目的片段切开
B. 连接酶类
将目的片段和载体相连
C. 其他工具酶
修饰, 加工等作用
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• □核移植技术
•动物克隆技术并不是象植物那样从体细胞直接发育 成新的个体，而是要将供体复制对象的细胞核转入 到去掉细胞核的卵细胞中才能实现。由于体细胞包 含有全部的遗传信息，从体细胞获得完整的动物个 体是完全可行的。动物体细胞是高度分化的细胞， 克隆羊“多莉”的诞生说明动物体细胞也具有全能 性，因此它是真正意义上的动物克隆。
•3．克隆人。是 全世界注目的焦 点，有人设计了 克隆人的技术路 线
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第十章遗传工程
•□ 动物克隆的危险性：
•1．克隆动物已出现广泛的免疫缺陷或早期夭亡。
•2．克隆动物过程中也极有可能产生遗传性的变异（无性 系变异），这在植物的克隆中已广泛得到研究和验证，会 发生染色体变异，基因组DNA扩增和某些转位因子的激活 。
列的不同DNA片段所构成的群体，即克隆 某种生物全部基因（99%）的总和。包含 外显子和内含子。 l cDNA文库：由某一生物特定器官或特定发 育阶段的细胞内总mRNA逆转录成互补 cDNA分子，其所构建的重组DNA克隆群 体，即具有表达功能外显子序列的总和。 2、化学合成基因
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第十章遗传工程
•二、用真核细胞表达和生产基因工程药物
• 虽然用大肠杆菌细胞表达基因工程药具有许多优点，如 成本低等，但由于原核系统表达的真核基因蛋白有时缺乏生 物活性，其原因由于原核生物缺乏合适的转译后修饰机制。 因此用真核细胞表达和生产基因工程药物已受到重视。
•□ 真核细胞反应器：
• 外源基因在合适的载体带动下转染进入体外培养的哺乳 动物细胞，昆虫细胞或酵母细胞，通过大规模培养细胞表达 外源基因。
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第十章遗传工程
3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
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2020/11/28
第十章遗传工程