NGS测序技术与分析流程图
《NGS基础培训》课件
数据分析
对原始数据进行处理、分析和 解读，提取有用的信息。
样本准备
样本类型
根据研究目的和实验需 求选择合适的样本类型
，如血液、组织等。
样本采集
确保采集过程的无菌操 作，避免污染和交叉感
染。
样本保存
选择适当的保存方式， 确保样本在实验前后的
稳定性和一致性。
样本量
根据实验需求确定所需 的样本量，确保实验结 果的可靠性和可重复性
伦理问题
隐私权保护
NGS技术可能涉及个人基因信息，需 确保这些信息不被滥用或泄露。
基因歧视
防止基于基因信息的歧视，确保公平 对待。
临床试验和患者权益
确保临床试验的公正性和患者的知情 同意权。
基因编辑技术的伦理界限
关于基因编辑技术的使用范围和目的 ，应明确其伦理界限。
法律问题
知识产权保护
法律责任和赔偿
对基因的表达产物转录本进行注 释，包括转录本的序列、表达量
、变异等信息。
蛋白质注释
对蛋白质进行注释，包括蛋白质 的序列、结构、功能等信息。
变异检测
单核苷酸变异（SNV）
检测基因组中单个碱基的变异。
结构变异（SV）
检测基因组中的大片段结构变异，如拷贝数 变异、倒位、易位等。
插入和缺失（INDEL）
检测基因组中的片段插入和缺失。
。
数据质量控制
数据完整性
评估原始测序数据的完整性， 确保数据没有缺失或损坏。
数据准确性
对测序数据进行质量评估，确 保数据的准确性和可靠性。
数据重复性
评估测序数据的重复性，确保 数据的一致性和可重复性。
数据可比性
对不同样本或实验条件下的数 据进行可比性分析，确保数据
ngs高通量测序流程
ngs高通量测序流程英文回答：NGS (Next-Generation Sequencing) is a high-throughput sequencing technology that has revolutionized the field of genomics. It allows for the rapid and cost-effective sequencing of large amounts of DNA or RNA samples. The NGS workflow involves several steps, including sample preparation, library construction, sequencing, and data analysis.The first step in the NGS workflow is sample preparation. This involves extracting DNA or RNA from the biological sample of interest. The quality and quantity of the extracted nucleic acids are crucial for the success of downstream steps. Various extraction methods and kits are available depending on the sample type.Once the nucleic acids are extracted, the next step is library construction. In this step, the DNA or RNA isfragmented into smaller pieces, and adapters are added to the ends of the fragments. These adapters contain sequences that are necessary for the attachment of the fragments to the sequencing platform. The size selection of the fragments is also performed to ensure that only the desired fragment lengths are sequenced.After library construction, the samples are ready for sequencing. There are different sequencing platforms available, such as Illumina, Ion Torrent, and PacBio. Each platform has its own advantages and limitations in terms of read length, throughput, and error rate. The choice of platform depends on the specific research needs and budget.During the sequencing process, the DNA or RNA fragments in the library are amplified and attached to a solid surface, such as a flow cell in the case of Illumina sequencing. The fragments are then sequenced using fluorescently labeled nucleotides, and the emitted signals are detected and converted into digital data.Once the sequencing is complete, the raw data undergoesquality control and data analysis. Quality control involves checking the sequencing quality scores, read length distribution, and other metrics to ensure the reliability of the data. Data analysis involves aligning the reads to a reference genome or transcriptome, identifying genetic variations, and quantifying gene expression levels.NGS has a wide range of applications in genomics research, including genome sequencing, transcriptome analysis, epigenetics, metagenomics, and personalized medicine. It has enabled researchers to study complex biological processes at an unprecedented level of detail and has led to significant advancements in our understanding of genetics and disease.中文回答：NGS（Next-Generation Sequencing）是一种高通量测序技术，已经彻底改变了基因组学领域。
二代测序分析流程
二代测序分析流程Next-generation sequencing (NGS) has revolutionized the field of genomics by allowing researchers to rapidly sequence large amounts of DNA and RNA. 二代测序（NGS）已经彻底改变了基因组学领域，使研究人员能够快速测序大量的DNA和RNA。
This technology has enabled the analysis of entire genomes, transcriptomes, and epigenomes, providing a wealth of data that can be used to study genetics, disease, and evolution. 这项技术使得对整个基因组、转录组和表观基因组的分析成为可能，为研究遗传学、疾病和进化提供了大量的数据。
One of the key challenges in NGS is the analysis of the data generated, which requires a complex and multi-step process to extract useful information. 二代测序面临的关键挑战之一是分析生成的数据，这需要复杂且多步骤的过程来提取有用的信息。
The NGS analysis pipeline typically involves several key steps, including quality control, read mapping, variant calling, and downstream analysis. 二代测序分析流程通常包括几个关键步骤，包括质量控制、读片段比对、变异检测和下游分析。
ngs与其他检测序技术流程的对比图文
NGS技术特点及优势
精准度高 检测全面
高通量测序
世和的技术在单次检测中对每个碱基覆盖600 次以上，杜绝假阳/阴性结果
单次检测中同时发现多个基因的多种突变 包括 单碱基突变、碱基缺失、碱基插入和基因融合
上一代传统基因检测
技术局限，假阳/阴性错误率高
单次反应只能针对一种突变进行检 测，并只能检测一种突变类型
分析
8
Copyright © 2013. GENESEEQ Technology Inc. All rights reserved.
荧光原位杂交(FISH)检测——以HER2为例
FISH检测乳腺癌细胞HER2扩增代表性图例
无扩增
无扩增
高倍扩增
扩增
DNA序列测定的意义
DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如 在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因 表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求 对DNA一级结构的详细了解。
1、成本较高 2、引入PCR过程会在一定程 度上增加测序的错误率，并且 具有系统的偏向性，同时读长 也比较短 3、对数据注释和报告解读要 求高
19
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点突变、小片段插入/缺失
点突变 扩增 融合/重排 插入/缺失
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NGS与液体活检结合可有效解决传统检测面临的挑战
• 高敏感度检测 低丰度突变
组织、胸水、 ctDNA
NGS测序技术与分析流程图
数据格式示例
• Fastq 格式
• Color Space 格式
精品课件
Phred score
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质量控制
精品课件
利用galaxy进行原始数据处理
https:///
精品课件
Galaxy History ' VGN FASTQ'
https:///u/jjv5/h/unnamed-history-1
Ion torrent
Ion Torrent 测序原理
精品课件
精度
• Examples:
• • 90% confidence (10% error rate) =
Q10
• • 99% confidence (1% error rate) =
Q20
• • 99.9% confidence (.1% error rate) =
精品课件
测序实验流程：
• 4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100 多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系 统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。
精品课件
454 Pyrosequencing
精品课件
精品课件
454 的特点与主要应用
• 读长较长，400－600bp • 通量较低，1Run 1M 序列，400－600Mb • 相对成本较高 • 主要应用：de novo测序
第一代测序技术
• Sanger测序
1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是 噬菌体X174的，全长5375个碱基
精品课件
• Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基， 其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用 来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入 一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为： ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显 影后可以根据电泳带的位置精品确课件定待测分子的DNA序列
NGS基础培训课件
生物信息分析问题
总结词
生物信息分析是ngs数据分析的核心步骤，但也存在一些问题。
详细描述
生物信息分析主要包括数据预处理、比对、变异检测和注释等方面。数据预处理主要包括质量控制、降噪和过 滤等步骤；比对主要包括与参考基因组进行比对和可视化等步骤；变异检测主要包括单核苷酸变异、插入缺失 和结构变异等检测；注释主要包括基因和通路富集分析、疾病关联分析和突变类型分析等步骤。
建库原理
核酸提取
核酸提取的目的是富集目标序列，去除其他杂质。
末端修饰
在建库过程中，需要将DNA或RNA某种方法将中的序列进行富集和去除不需要的序列。
03
ngs数据分析流程
下一代测序技术是继第一代测序技术Sanger后，发展起来的 高通量测序技术，能够一次处理大量序列信息。
测序流程
下一代测序的流程主要包括样本准备、构建、测序反应 、数据分析等环节。
测序原理
链终止法
链终止法是利用核苷酸特异性的终止剂，使得ddNTP可以终止DNA聚合酶的 延伸反应。
高通量测序
高通量测序是下一代测序技术的主要特点，能够在短时间内对大量序列进行 测序。
数据预处理
质量控制
使用FastQC等工具对原始数 据进行质量控制，检测数据中 是否存在可疑序列、高通量测
序的偏差等。
去除批次效应
将不同批次的数据进行归一化处 理，以去除批次效应，便于后续 分析。
数据过滤
根据质量控制结果，对数据进行过 滤，去除低质量的数据。
序列比对
选取比对算法
使用比对算法将序列与参考基 因组进行比对，如Bowtie、
随着技术的不断进步，NGS在生命科学研究中的 应用领域越来越广泛，从基因组学到转录组学、 表观组学等多个领域。
NGS系列讲座——NGS基本原理ppt课件
3’
5’
5’
TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT
21 bp
5’
TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTAGCGC
26 bp
5’
TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTA
22 bp
11
Sanger 测序
Prime
5’ T G C G rC G G C C C A G T C T T G G G C
ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG
3’
5’
5’
TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCT
21 bp
5’
TGCGCGGCCCAGTCTTGGGCTAGCGC
26 bp
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Sanger 测序
Prime
5’ T G C G rC G G C C C A G
ACGCGCCGGGTCAGAACCCGATCGCG
NGS系列讲座（一）—— NGS简介及原理
2017/06/01 魏冬凯
1
Outline 二代测序技术背景 Solexa测序原理
2
Outline 二代测序技术背景 Solexa测序原理 其他平台测序技术简介
3
什么是DNA测序？测序的研究对象是什么？
DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片 段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C） 与鸟嘌呤的（G）排列方式。
38
测序种类
Single-Read Sequencing(SR)
Paired-End Sequencing(PE) Index Sequencing(PE)
39
测序种类
《NGS基础培训》课件
2023《ngs基础培训》课件contents •ngs基本概念及发展历程•ngs工作原理及测序技术•ngs在临床疾病研究中的应用•ngs在生物进化研究中的应用•ngs在环境科学中的应用•ngs技术在未来医学中的应用前景目录01ngs基本概念及发展历程下一代测序技术(NGS)是一种高通量的生物学技术，可以对基因组进行大规模、并行、快速、准确的测序。
NGS技术具有高速度、高通量、高灵敏度、高准确性、低成本和可重复性等优点。
ngs定义与特点ngs发展历程人类基因组计划完成了人类基因组的初步测序。
2005年2007年2010年2012年第一台下一代测序仪(Solexa)问世，标志着NGS时代的到来。
测序技术的快速发展，使得一天内能够完成人类基因组的测序。
单分子测序技术(PacBio RS)的出现，打破了基因组测序的限制。
ngs应用领域生物进化研究等药物研发和个性化治疗罕见疾病研究遗传疾病诊断和预防肿瘤诊断和治疗02ngs工作原理及测序技术总结词双端测序技术是NGS中应用最为广泛的技术之一，可以有效测定生物体基因组的变异情况。
详细描述双端测序技术是一种基于高通量测序平台的技术，它可以从生物体的两端同时进行测序，从而获得基因组的正反方向序列。
这种方法可以大大提高测序的精度和效率，同时减少测序成本。
双端测序技术总结词单端测序技术是一种简单有效的NGS技术，适用于对特定基因或DNA片段进行深入研究。
详细描述单端测序技术只对DNA的一条链进行测序，因此可以快速获得大量序列数据，并且可以有效降低测序成本。
但是这种方法无法测定基因组的整个序列，需要结合其他技术进行分析。
单端测序技术序列组装和基因组构建是NGS技术的关键环节，对于后续的基因组分析和研究至关重要。
详细描述序列组装是将测序得到的数千个序列片段进行拼接和排列，从而得到完整基因组序列的过程。
基因组构建是在序列组装的基础上，根据生物体的基因组结构特点构建基因组图谱的过程。
下一代测序NGSDNA序列分析技术共33页PPT
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒
45、法律的制定是为了保证每一个人 自由发 挥自己 的才能 ，而不 是为了 束缚他 的才能 。—— 罗伯斯 庇尔
谢谢你的阅读
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
《NGS基础培训》课件
诊断罕见遗传病
通过分析患者的基因变异，对罕见的遗传病进行确诊和病理 分析。
预测遗传风险
通过对家族遗传史的研究，预测患者或亲属患某种遗传疾病 的风险。
肿瘤个性化治疗
靶向治疗
通过基因测序找到肿瘤的特异基因变异，设计个性化治疗方案，提高治疗效 果和减少副作用。
免疫治疗
分析肿瘤细胞的免疫逃逸机制，为患者提供更加精准的免疫治疗。
单细胞RNA测序
通过对单个细胞进行RNA测序，研究细胞异质性和基因表达的复杂性，具有 更高的灵敏度和分辨率。
单细胞DNA测序
通过对单个细胞进行DNA测序，研究基因组变异和遗传多样性，具有更高的 灵敏度和分辨率。
空间转录组测序技术
空间RNA测序
通过对组织样本进行空间定位，研究基因表达的空间分布和细胞异质性，为研究 复杂的生物组织提供新的工具。
VS
详细描述
序列组装是将测序得到的数千至上百万条 序列拼接成较大片段的过程，需要使用高 效的算法和计算资源。基因组构建是在序 列组装完成后，利用生物信息学手段将获 得的基因组组装成完整的图谱。这些步骤 对于研究生物体的基因组变异、基因结构 和功能等具有重要意义。
03
ngs在临床医学中的应用
遗传疾病的诊断与预测
数据质量控制与处理
数据质量评估
采用FASTQC等工具对数据质量进行评估，确保数据质量符 合要求。
数据过滤与去噪
使用Trimmomatic、Novoalign等工具进行数据过滤和去噪 ，以提高数据质量。
基因变异检测与注释
基因变异检测方法
采用SOAPsnp、GATK等工具进行基因变异检测，并依据SNP位点在基因组 上的位置进行注释。
《ngs基础培训》课件
NGS基础培训课件
利用生物信息学工具对高质量序列 数据进行比对、组装、变异检测等 分析，以获得基因组组装、基因注 释、变异检测等结果。
03
ngs相关技术
短读长测序技术
总结词
高效、快速、简便
详细描述
短读长测序技术是一种高效的基因测序方法，其使用高通量的测序仪对基因组进行测序。该技术具有快速、简 便等优点，可以在短时间内完成大量基因组的测序。短读长测序技术一般使用聚合酶链式反应(PCR)扩增特定 的DNA片段，然后对这些片段进行测序。
长读长测序技术
总结词
高分辨率、低误差率
详细描述
长读长测序技术是一种基因测序方法，该技术使用一 种名为"连接酶"的酶将DNA片段连接起来，然后对这 些连接后的DNA片段进行测序。长读长测序技术具有 高分辨率、低误差率等优点，可以更准确地检测基因 变异和染色体结构变异。该技术在基因组组装、基因 注释和疾病研究等方面具有广泛的应用。
临床应用合规性挑战
01
总结词
02
详细描述
03
总结词
临床应用合规性是NGS技术在 医学领域应用中必须考虑的重 要因素。
临床应用合规性包括多个方面 ，如伦理审查、数据安全和隐 私保护、检测标准和流程等， 需要严格遵守相关法规和标准 。
应对临床应用合规性挑战需要 从多个角度进行考虑和规范， 包括制定完善的技术规范和标 准、加强监管和审查力度等。
检测方法
通过对肿瘤组织样本进行NGS 检测，分析肿瘤细胞的基因变
异情况，如EGFR、BRAF、 KRAS等。
适用人群
适用于肿瘤患者，特别是需要 进行靶向治疗、免疫治疗等个
性化治疗的患者。
检测目的
帮助医生确定治疗方案、判断 预后和复发风险。
ngs测序原理
ngs测序原理
NGS（Next Generation Sequencing，下一代测序）技术是一种
高通量测序技术，有别于传统的Sanger测序方法。
下一代测
序技术包括454测序、Illumina测序、Ion Torrent测序、
Pacific Biosciences测序和Oxford Nanopore测序等。
在NGS测序过程中，首先需要将待测DNA样本进行如PCR （聚合酶链式反应）等预处理步骤，将DNA复制成DNA片段。
然后，这些DNA片段会被连接到测序芯片或流动式细胞，形成DNA文库。
接下来，DNA文库会通过各种方法进行扩增和放大，以确保有足够的DNA分子可供测序。
然后，DNA文库会被断裂成更小的片段，并附上序列化的DNA适配器。
然后，DNA文库将被放置在测序仪中，并进行测序。
不同的
测序平台采用不同的测序原理。
例如，Illumina测序使用的是“桥式扩增”和“准确的核酸递归消融”原理，454测序使用的是“荧光标记的双脱氧核苷酸”原理，Ion Torrent测序使用的是“电化学检测”原理，Pacific Biosciences测序使用的是“单分子
实时测序”原理，Oxford Nanopore测序使用的是“纳米孔测序”
原理。
测序完成后，测序数据会转化为电子信号，并通过计算机软件解析成序列信息。
然后，这些序列信息可以用于基因组组装、基因变异分析、RNA测序等多种生物信息学研究。
总之，NGS测序技术通过高通量、并行化的方式，实现了对
大量DNA序列的快速测序，为生物学研究、临床诊断、药物研发等提供了强大的工具。
ngs高通量测序流程
ngs高通量测序流程英文回答：NGS (Next-Generation Sequencing) is a high-throughput sequencing technology that has revolutionized the field of genomics. It allows us to sequence millions or evenbillions of DNA fragments simultaneously, providing us with a wealth of genetic information in a short amount of time. The NGS workflow involves several steps, including library preparation, sequencing, and data analysis.The first step in the NGS workflow is library preparation. This involves preparing the DNA or RNA samples for sequencing by fragmenting the DNA, adding adapters to the fragments, and amplifying them using PCR (Polymerase Chain Reaction). The adapters contain sequences that are recognized by the sequencing machine and allow the fragments to be attached to a solid surface, such as a flow cell.Once the library is prepared, the next step is sequencing. This is where the actual DNA or RNA fragments are read by the sequencing machine. There are several different NGS platforms available, such as Illumina, Ion Torrent, and Pacific Biosciences, each with its own sequencing chemistry and read lengths. The sequencing machine reads the DNA or RNA fragments by incorporating fluorescently labeled nucleotides or by detecting changesin electrical current as the DNA or RNA strands pass through nanopores.After the sequencing is complete, the next step is data analysis. This involves processing the raw sequencing data to obtain meaningful results. The data analysis pipeline typically includes steps such as base calling, quality control, alignment to a reference genome, variant calling, and functional annotation. There are several software tools and bioinformatics pipelines available to perform these analyses, such as BWA, GATK, and ANNOVAR.NGS has a wide range of applications in genomics research, including whole genome sequencing, targetedsequencing, RNA sequencing, and epigenetic analysis. For example, whole genome sequencing can be used to identify genetic variations associated with diseases, while targeted sequencing can be used to analyze specific genes or regions of interest. RNA sequencing can be used to study gene expression patterns, and epigenetic analysis can be used to study modifications to the DNA that affect gene regulation.中文回答：NGS（Next-Generation Sequencing）是一种高通量测序技术，已经彻底改变了基因组学领域。
ngs hla分型流程
ngs hla分型流程
NGS（下一代测序）HLA分型是通过高通量测序技术对人类白细
胞抗原（HLA）基因进行分型的过程。
HLA基因编码了人体免疫系统
中的重要蛋白质，对于器官移植、疾病易感性和药物治疗反应等方
面具有重要意义。
下面是NGS HLA分型的流程：
1. 样品准备，首先需要从受试者的血液或组织样本中提取DNA。
这可以通过标准的DNA提取方法来实现。
2. 文库构建，提取的DNA样本需要通过文库构建过程进行准备，这包括DNA片段的制备、末端修饰和连接DNA测序接头等步骤。
3. 文库质控，对构建好的DNA文库进行质控，确保文库中的DNA片段长度和浓度符合测序要求。
4. 下一代测序，将文库进行高通量测序，通常采用Illumina
或Ion Torrent等平台进行测序。
在测序过程中，通过对DNA片段
进行大规模的并行测序，可以获得大量的测序数据。
5. 数据分析，得到的测序数据需要进行生物信息学分析，包括
序列比对、HLA基因的定量和定性分析等步骤。
这一步通常需要借
助专业的生物信息学软件和数据库进行。
6. 结果解读，最后，根据数据分析的结果进行HLA基因型的解
读和分型。
这包括确定HLA基因的等位基因，即确定受试者的HLA
基因型。
总的来说，NGS HLA分型是一个复杂的过程，涉及到样品准备、文库构建、高通量测序、数据分析和结果解读等多个环节。
通过这
一流程，可以准确地确定受试者的HLA基因型，为临床诊断和治疗
提供重要的信息。
ngs高通量测序流程
ngs高通量测序流程英文回答：Next-generation sequencing (NGS) is a high-throughput sequencing technology that has revolutionized genomics research. It allows for the rapid and cost-effective sequencing of millions of DNA fragments simultaneously, providing researchers with a wealth of information about the genetic makeup of an organism.The NGS workflow consists of several key steps, including sample preparation, library construction, sequencing, and data analysis. Let me walk you through each of these steps.1. Sample preparation: This step involves obtaining the DNA or RNA samples that will be sequenced. The quality and integrity of the samples are crucial for accurate sequencing results. Various methods can be used to extract DNA or RNA from different sample types, such as blood,tissue, or cells.2. Library construction: Once the DNA or RNA samples are obtained, they need to be converted into a library of fragments that can be sequenced. This involves several enzymatic reactions, including fragmentation, adapter ligation, and amplification. The resulting library contains millions of DNA fragments, each with a unique adapter sequence.3. Sequencing: The prepared library is loaded onto a sequencing platform, such as an Illumina sequencer. The fragments are then amplified and immobilized on a solid surface, forming a DNA cluster. Fluorescently labeled nucleotides are added one at a time, and the emitted light is captured by a camera. This process is repeated multiple times to generate millions of short DNA sequences, called reads.4. Data analysis: The raw sequencing data needs to be processed and analyzed to extract meaningful information. This involves several bioinformatics steps, includingquality control, read alignment, variant calling, and functional annotation. The resulting data can provide insights into various aspects of genomics, such as gene expression, genetic variation, and epigenetic modifications.NGS has numerous applications in research and clinical settings. For example, it can be used to study the genetic basis of diseases, identify disease-causing mutations, and monitor the response to treatment. It can also be used in agriculture to improve crop yields and develop disease-resistant varieties.中文回答：NGS（下一代测序）是一种高通量测序技术，彻底改变了基因组学研究的方式。
《NGS基础培训》课件
结构变异检测
总结词
结构变异是指大片段DNA的变异，包括染色体畸变、倒位、易位等，利用NGS技术可以检测出这些 变异。
详细描述
结构变异对于人类遗传学疾病的发生和发展具有重要影响。利用NGS技术，通过对大量样本进行比较 和分析，可以检测出结构变异，并对其进行定位和注释。这对于人类遗传学研究、疾病诊断和治疗具 有重要意义。
基因组组装
总结词
基因组组装是生物信息学中一项重要的任务，利用NGS技术可以对样本基因组进 行高效、准确地组装。
详细描述
基因组组装主要依赖于NGS产生的原始数据，通过对这些数据进行排序、拼接和 gap填充等步骤，得到完整的基因组序列。这种方法能够快速、准确地测定基因 组的全部碱基序列，并且可以识别出基因组中，以 确保满足测序要求。
测序流程测序仪运行将构建好的上机运行，在测序仪中进行高通量测 序。
数据产出
测序仪将产生的原始数据进行整理和分析，生成测序 结果。
质量控制
对测序结果进行质量评估，如读长、覆盖度、准确性 等，以确保数据可靠。
数据分析流程
NGS数据的常见问题解析
数据质量问题
了解NGS数据中可能存在的质量问题，如序列质量低、 测序深度不足等，掌握处理和筛选高质量数据的方法。
01
数据标准化问题
学习对NGS数据进行标准化处理的方法 ，以便在不同样本间进行比较和分析。
02
03
数据偏倚问题
了解NGS数据中可能出现的偏倚现象 ，如序列偏好性、测序偏好性等，掌 握纠正偏倚的方法。
局限性
NGS技术也存在一些局限性，如数据解析的复杂性和准确性问题，以及高昂的技术成本和设备成本等。此外，对 于某些特定类型的样本，如低质量的样本或难以提取的DNA样本，NGS技术的适用性也受到限制。
二代测序实验流程介绍
二代测序实验流程介绍英文回答：Next-Generation Sequencing (NGS) Workflow.Next-generation sequencing (NGS) has revolutionized the field of genomics and has become the standard for a wide range of applications. NGS technologies are capable of sequencing large amounts of DNA and RNA quickly and cost-effectively, enabling researchers to perform comprehensive genomic analyses.The NGS workflow involves several key steps:1. Sample preparation: The first step is to prepare the DNA or RNA sample for sequencing. This involves extracting the nucleic acids from the sample, fragmenting them into smaller pieces, and ligating adapters to the fragments.2. Library preparation: The fragmented DNA or RNAmolecules are then used to create a library of sequencing-ready molecules. This involves amplifying the fragments using PCR and adding sequencing primers.3. Sequencing: The library is then loaded onto a sequencing instrument, where the DNA or RNA fragments are sequenced. NGS instruments use a variety of sequencing technologies, such as Illumina's HiSeq and MiSeq platforms.4. Data analysis: Once the sequencing is complete, the raw data is analyzed. This involves removing low-quality reads, aligning the reads to a reference genome or transcriptome, and calling variants.NGS data can be used for a variety of applications, such as:Genome sequencing.Exome sequencing.RNA sequencing.Single-cell sequencing.Metagenomics.NGS has enabled researchers to make significant advances in our understanding of human health, disease, and evolution. It has also been used to develop new diagnostic tools and therapies.中文回答：二代测序实验流程。
NGS结果分析流程
结果分析表
在分析结果的整个过程中，分析者一定要在心里时刻记着两点： 1.这个基因可能发生的任何突变形式，防止漏检； 2.测序平台方法的局限性：如homopolymeric stretches的测序问题、ins/del 测不准的问题，随读长延伸信号衰减的问题等。
流程总结： 1,先找是不是有stop gain、frameshift或splicing mutation（GT—AG规则），因 为这些突变形式是公认的致病突变形式，极有可能是致病的； 2,其次我们看missense mutation，结合看是不是SNP（dbSNP，1000 genomic） ，有没有文献报道（HGMD和google），或者预测得分（此处应清楚一般预测 软件的预测打分原理：包括氨基酸的理化性质、保守性等；这也表明得分高 的不一定致病，因为氨基酸的变化也有可能使蛋白功能更强，虽然这种可能 性较小，但像ABCC8、KCNQ1的激活突变导致高胰岛素血症低血糖症）； 3,再次，我们看内含子区的变异，我们应给它一个命名然后去serach HGMD数 据库或google，因为我们知道除了GT\AG外，剪接体识别的保守序列还有其他 的位置，比如分支点等等，其他点的突变也可能产生新的剪接位点；我们还 要看同义突变，虽然不影响蛋白但可能影响剪接。 4,最后，我们要注意是不是可能有大片段的缺失/重复突变的可能，或者其他 的复杂突变形式（如内含子倒位），染色体结构上的变异等。
NGS结果分析流程
一、测序数据初步 分析
√
√
√
√ √
二、结果下载，文 件按要求命名
实验结果文件夹
input文件夹下的相应bam、bai、vcf 分别命成“项目名简写及样本号” 的形式（如图）
打印
1，与实验记录装订 一起，为实验整体情 况记录
试解NGS接头二聚体测序图谱
试解NGS接头二聚体测序图谱第一章主流NGS技术（某曼技术）有个秘密，它对于样本的碱基复杂度有一定要求。
如果文库全部由序列相同的DNA片段（克隆）组成；或者文库的局部碱基序列一样（如PCR引物、接头、barcode等部位）；或者所谓的文库就是接头二聚体，或者引物二聚体。
其中碱基序列相同的部位，就是碱基复杂度低的部位。
这些部位NGS测序会出问题。
典型的图谱如下：这个怪图，是怎么形成的呢？第二章我们从一代测序开始，试图理解它的形成原理。
一代测序的模板DNA不是文库，而是克隆。
也就是说，一代测序的“文库”全部由序列相同的DNA片段组成。
比如：AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTACAGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTACAGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTACAGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTACAGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTACAGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTACAGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTACAGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTAC尽管有这么多分子，但是每个DNA分子的碱基序列是一样的，是一组克隆，其测序图谱是这样的，就像一个分子一样：【本文中的碱基序列是随意编制的，与测序图不匹配，仅为帮助理解举例。
下同。
】如果模板是两种DNA分子等摩尔混合在一起，比如挑克隆时不小心把旁边的克隆也挑了，两个克隆的DNA被提取在同一个试管里（其实，这种情况我们一般称之为污染），假设其碱基序列是这样的：AGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTACAGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTACAGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTACAGACTAGCTAAGACTAGCATACTACAGTACGTACAGTACCATGATCCTAGCTACTACGTACCTAGCATCTATCCTACCACATGATCCTAGCTACTACGTACCTAGCATCTATCCTACCACATGATCCTAGCTACTACGTACCTAGCATCTATCCTACCACATGATCCTAGCTACTACGTACCTAGCATCTATCCTACCA其测序图谱：每个位置都是杂合子，除了碰巧有些位置是纯合子以外。
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测序实验流程：
• 4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100 多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系 统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。
精品课件
454 Pyrosequencing
精品课件
精品课件
454 的特点与主要应用
• 读长较长，400－600bp • 通量较低，1Run 1M 序列，400－600Mb • 相对成本较高 • 主要应用：de novo测序
• 454公司可谓新一代测序技术的奠基人。2005年底，454公 司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测 序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》 杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序 （sequencing-by-synthesis）的先河。之后，454公司被 罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。
精品课件
测序实验流程：
• 3、测序反应：携带DNA的珠子与其他反应物混合物，随后 放入PTP板中进行后继的测序。 PTP孔的直径（29um）只 能容纳一个珠子（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中， 测序开始。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生 化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获；
新一代测序介绍
Lynx MPSS
454
Polony Seq
• 三Sol大ex测a 序平台Roc的he前45世4 今A生BI SOLiD
Illumina Solexa
Helicos
Ion Torrent
ABI Ion Torrent
SMRT
精品课件
Pacific Biosciences
Roche-454
B. SOLiD 测序结果示例（Color Space)
A. SOLiD Oligo荧光基团模式图
精品课件
精品课件
SOLiD 的特点与主要应用
• 读长较短，50-75bp • 精度高，可达Q40 • 通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G • 主要应用：基因组重测序、SNP检测等
精品课件
测序实验流程：
• 2、Emu大部分磁珠磁珠携带个独特的片断在自己的微反应器里 进行独立的扩增，而不受其他同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增后仍结 合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验；
第一代测序技术
• Sanger测序
1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是 噬菌体X174的，全长5375个碱基
精品课件
• Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基， 其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用 来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入 一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为： ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显 影后可以根据电泳带的位置精品确课件定待测分子的DNA序列
• Oligo连接测序：通过连接酶连接，再对oligo上荧光基团 进行检测
SOLiD 5500xl
精品课件
ABI SOLiD测序前期制备
A 样品片段化 磁珠连接
B 乳化PCR 3‘末端修饰
精品课件
C 磁珠富集 转到测序玻片
ABI SOLiD测序原理
精品课件
ABI SOLiD荧光结合和结果示例
@SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 T11.0203.3.1113211010332111302330201 +SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 !36!8/8:!:!462>@6=(<8>8.<;2:*9748078 @SRR029969.2 VAB_5551_13_468_F3 length=35 T202312302.3333130131131322113203131 +SRR029969.2 VAB_5551_13_468_F3 length=35 !9),4/3)&$!(&(573(96,'7&91>)43),(95,
• 454测序原理
精品课 DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间，经末端修复与特异 性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA（sstDNA）； 然后和两个44个碱基长的衔接子（adaptor）A、B进行平 端连接。A、B 衔接子各自含有20个碱基的PCR 引物序列、 20个碱基的测序引物序列和4个碱基的对照序列（TACG）， 除此之外，B衔接子的5’端还标记有一个生物素基团，供 后续的分离合适的测序模板使用。
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精品课件
Solexa 的特点与主要应用
• 读长较短，100－150bp • 通量高，25G每天，120-150G每Run • 主要应用：RNA测序、表观遗传学研究
精品课件
ABI SOLiD
• SOLiD Sequencing by Oligo Ligation/Detection
1st cycle extension
diol diol
2nd cycle denaturation
diol
diol diol
2nd cycle extension
精品课件
diol
diol diol
2nd cycle annealing
Illumina Solexa Base Calling
T G C TAC GAT …
精品课件
Illumina solexa
• Solexa 测序原理
精品课件
Illumina solexa
精品课件
Illumina Solexa 桥式PCR
diol diol
1st cycle denaturation
diol diol
1st cycle annealing
n=35 total
diol diol