酸性蛋白酶提交

酸性蛋白酶的研究进展姓名：石宏志班级学号：090432215中文摘要：提起酶不了解的人都会觉得很神奇，为什么人类、动物、植物体内都会有酶，酶究竟是什么东西。

此文就对酸性蛋白酶从菌种培养、工艺流程、在生产生活中的应用、产过程中的注意事项及最后酶的提纯做了简单的陈述。

酸性蛋白酶，酶的一种，它的研究进展从这里我们就可以窥一斑而见全身了。

Abstract:Mentions enzyme don't understand people would think very magical, why do humans, animals, plants body will have enzymes, enzyme what exactly. The article from strains of acid protease training, processes and the application in production and life, and production process the matters needing attention and finally enzyme makes simple the purification of statement. Acid protease, one of the enzymes, the research progress of it from here we can peep one spot and see whole body.中文关键字：酸性蛋白酶，扩培，发酵，盐析，结晶Key words：Acid protease, enlarge cultivates, fermentation, salting-out, crystallization前言21世纪科技领头羊可以说是非生物工程莫数，从DNA双螺旋结构的推出，到多利克隆羊的出世；从原来对污染海洋的石油用燃烧方法，到现在的微生物处理；从原始的青草喂牲畜，到现在的蛋白饲料等等，这诸多变化之中无一脱离了生物催化剂——酶。

高效、绿色环保、投入小收获大众多优秀辞藻被冠在酶身上。

蛋白酶做为一种重要的工业酶制剂，作为一种较早被人们了解的酶类现在正在人类的生活中发挥巨大的作用，特别是酸性蛋白酶以其作用的广泛性、高效率越来越多的受到了人们的关注。

酸性蛋白酶(acidic protease)是指在酸性(pH 2~5)环境下催化蛋白质肽键水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。

其在食品、酿造、饲料、毛皮与皮革、胶原纤维和医药等工业领域中的应用很广。

近年来，酸性蛋白酶作为高效率酒精发酵的优选促进剂和新型饲料添加剂的应用得到人们的重视。

下面就对酸性蛋白酶的生产做简单的介绍。

1．酸性蛋白酶的概述酸性蛋白酶(acidic protease)在1954年首先由吉田在黑曲酶中发现。

该酶广泛存在于霉菌、和担子菌中，细菌中极少发现，其最适pH3~4，相对分子质量30000~40000，等电点（pH3~5）。

酸性蛋白酶主要是一种羧基蛋白酶，大多数在其活动中心含有2个天冬氨酸残基。

酶蛋白中酸性氨基酸含量高，而碱性氨基酸含量低。

不同微生物的酸性蛋白酶其氨基酸组成虽有所差别，但性质基本相同，许多性质也与动物胃蛋白酶相似，其活动中心肽键也基本相似，它对DFP、PCMP （对氯汞苯甲酸）及EDTA不敏感，但能为DNA（二重氮乙酰亮氨酸甲酯）及EPNP （1，2环-3-对硝基苯养基丙烷），SDS（十二烷基磺酸钠）等抑制。

DNA，EPNP 之所以能引起酶失活是由于活性中心天冬氨酸残基被酯化。

DNA只同有活性的酸反应，而同失活的酶不能反应。

P-BPB（对溴酚乙酰溴）虽然也可同酶的1个天冬氨酸残基反应，但同它反应的天冬氨酸的位置与以上两种抑制不一样，故不能引起青霉酸性蛋白酶失落。

2．生产工艺2．1菌种的选择及培养生产酸性蛋白酶的菌种很多，例如生产工艺是以黑曲霉为发酵菌种的，黑曲霉<A.niger>一种黑色球体，体形比细菌大（如右图）这种霉菌可以从霉变的食物中提出，该霉菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC.NO. 1100。

黑曲霉具有多种活性较强的酶系，如CX酶、淀粉酶、酸性蛋白酶等，可将原料中的纤维素等大分子化合物降解转化为动物易消化利用的养分，并为白地霉、酵母菌提供必需的糖、氨基酸等。

但在试验中发现，黑曲霉培养时间超过60h,就会有孢子产生。

为延长黑曲霉作用时间，采用二次发酵工艺，即：第一次固体发酵培养基→接种黑曲霉（30℃静止培养3d）→第一次发酵→加适量麸皮、尿素及等量酱渣→接种白地霉、酵母菌（30℃静止培养）→第二次发酵。

时间由实验确定，60℃烘干、备用2．1．1培养基的配制在黑曲霉生产蛋白酶时，培养基中除需要高浓度的有机氮外，还得添加1%～3%的无机氮。

蛋白胨对黑曲霉生产酸性蛋白酶有很强的诱导作用。

就黑曲霉3.350研究表明只有几种有机氮可以将它代替，其中已豆饼、蚕蛹、鱼粉的石灰水解物为最好。

以下的培养基适合大多数黑曲霉生产酸性蛋白酶，其组成是豆饼粉、玉米粉、和鱼粉比为6 ：1：1混合物5%，豆饼石灰水解物10%，NH4Cl 1%，CaCl20.5%，Na2HPO40.2%，pH5.5～6.0。

2．1．2培养条件影响黑曲霉生产酸性蛋白酶的主要因素是培养基的pH和通风量。

黑曲霉3.350产酶的最适pH5.5～6.0。

通风量是影响黑曲霉生产酸性蛋白酶的另一个重要因素，通风量不足，虽不影响菌体生长，但不能产酶。

实验表明：在500L发酵罐中，使用黑曲霉3.350发酵生产酸性蛋白酶的时候，前24h前的通风量为0.25VVm，24～48h 0.5VVm，48～72h 1.0VVm。

在48h通风量如果未及时增至1.0VVm，就会导致产酶降低，即使恢复了正常的通风量，但为时已晚，酶的活性减少1/3。

如果后期通风量减少到0.25VVm，就会导致产酶偏离正常范围。

可在黑曲霉生产酸性蛋白酶的时候，前期的通风量对酶的影响更为明显。

温度在黑曲霉生产蛋白酶的过程中也起着重要的作用，通常黑曲霉生产蛋白酶的温度控制在30℃。

2．1．3菌种的扩培在扩培之前应该选出催化高效的菌株，一般采取的是紫外线放射的方法获得着类菌株但是效果不是很明显，把筛选出的具有高效发酵能力的菌株进行扩大培养，以得到发酵所需要的大量菌种，扩培工艺流程：原菌种→斜面试管培养→液体试管培养→三角瓶培养→卡氏罐培养3．酸性蛋白酶的提取3．1酸性蛋白酶的盐析工业用粗制酶采用盐析法提取，将培养物滤去菌体用盐酸调节pH4.0以下，加入硫酸铵至浓度55%，静止过夜，倾去上清液，沉淀压滤去母液，于40℃烘干后磨粉。

盐析工艺受率94%以上，干燥后收率60%以上，每克酶活性为20万U左右。

对于医用和啤酒企业所用的酶则需要进一步纯化。

该纯化有两重方法。

甲法：发酵液→离心除去菌体粗酶→加水浸泡（pH3）→过滤，然后把两者滤液→盐（硫55％铵）→压滤→酶泥→溶于pH2.5，0.005mol/L乳酸缓冲液→离子交换树脂脱色→脱色液（收率93%）→40℃→真空薄刮板蒸发器浓缩2倍以上（收率90%）→离子交换树脱盐（收率90%）→喷雾干燥或冷冻干燥→磨粉（淡黄至乳白色粉末，酶活40～60万U/g）。

乙法（单宁酸沉淀法）：Ph5.5左右，在搅拌下向发酵液加入10%单宁酸，使单宁酸的终浓度1%左右，静至1h，离心收集酶与单宁酸的复合物。

再向此复合物中加入10%聚乙二醇（相对分子质量6000），使聚乙二醇用量相当原酶液0.3%～0.5%，不断搅拌，离心除去单宁聚乙二醇聚合物，经此操作酶液浓缩10倍总收率90%以上。

向浓缩酶液中加入糖用活性炭3%脱色，得到浅黄脱色酶液，酶回收率90%～95%，脱色酶液或乙醇在低温西沉淀或用硫酸铵盐析做成浅色酶粉，其活性可达40～60万U以上，总收率70%以上。

3．2酸性蛋白酶的结晶酸性蛋白酶的结晶方法有沉淀和离子交换柱层析两种方法。

这里只介绍离子交换柱层析。

离子交换柱层析使用弱酸性阳离子交换树脂如：粗孔型Amber-lite IRCXE-64,CG-10,Duolite CS101等吸附。

操作方法是：将Duolite CS101（110～170目）装入3×70cm柱中，将溶于0.1mol/L醋酸钠-盐酸（pH3.5）缓冲液的酶液通过柱子，控制流量每小时30ml，收集流出液每分钟10ml，测定酶活性和蛋白含量（Folin法或紫外分光法），然后用水或0.02mol/L醋酸钠-盐酸（pH 3.55）缓冲液洗柱，淀粉酶首先洗脱，然后改用0.5mol/L醋酸钠-盐酸（pH 5.2）缓冲液洗柱，蛋白酶的收率60%～70%，经过盐析，丙酮结晶，收率高于沉淀法结晶。

4．酸性蛋白酶的用途酸性蛋白酶的用途可以说是涉及到生活中的方方面面：医学，农业，日常生活，皮革制造等等。

使用酸性蛋白酶的软化浴（含酸性蛋白酶10～20U/ml、食言3%、芒硝6%，pH2.5～3.0）在裘皮生产中可使出皮率提高5%～10%，皮板抗强度增加30%，收缩温度提高30℃，质量减轻5%～10%；在羊毛处理中使处理时间由100min减少到30min，毛纱断头率下降50%，提花毛毯拉力强度增加67%；在医药中酸性蛋白酶是良好的消炎剂，可用它来化痰止咳、消炎退肿、清洁创面、帮助脱痂等。

到这为止本文已经从酸性蛋白酶的菌种选择，培养基的配制和酶的提取将酸性蛋白酶的生产做了简单的介绍。

参考文献：[1]费笛波,钱玉英,叶玲玲,许尧兴,冯观泉,《黑曲霉菌株酸性蛋白酶的性质及其应用研究》，浙江农业学报，1997年06期[2]于丽萍,邹碧珍,王金英，《提高酶活性的研究》，中国调味品，1998年03期[3]章剑林，黄建宁，袁亚，《耐高温酸性蛋白酶537菌株筛选及特性研究》，浙江农业科学，1995年04期[4]钱玉英，冯观泉，费笛波，叶玲玲，章锦秋，何福恒，《酸性蛋白酶高产菌株6042（Aspergillus niger 6042）的选育和形态鉴定》，浙江农业学报，1994年04期[5] 翁醒华,徐晨明,李永泉,胡华萃,周红军,贺筱蓉，《宇佐美曲霉L336酸性蛋白酶的动力学性质》，菌物系统，1999年01期。