酸性蛋白酶及其在畜牧业中的应用_肖竞

30BBL0R87CBPS BPRBVESE0P .J!!，所产酸性蛋白酶最适 IJ 为 !@ #， 在 IJ !@ " W 6@ " 之 间 稳 定 。 此 酶 在 IJ G@ "， 6"K 条件下， <67E? 内酶活保持不变，并且对 (.- 和胃蛋白酶抑制剂不敏感，其酶动力学特性与 野生型酶的动力学特性非常相似。
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株，采用高温、超剂量常规诱变方法，获得了产耐高 温酸性蛋白酶的菌株 3# $ <6，其所产酸性蛋白酶最适 IJ 值为 !@ 6，最适温度为 6"K ，A"K 下恒温 GL 的酶 活比出发菌株高 HG@ != ；稀释 <"" 倍的酶溶液 H"K 下保温 #"7E? 酶存活率为 M!@ %= 。他们初步认为该 酶的耐热性是由于酸性蛋白酶在形成过程中与其它蛋 白质或其它因子复合成耐热蛋白酶之故。黄遵锡等 ’ <AAA + 以黑曲霉 N2#"<A 为出发菌株，经紫外线和亚 硝基胍诱变处理，获得高产酶菌株 . $ < $ <，产酶活 力约是原始出发菌株的 G 倍。李永泉等 ’ <AAA + 以宇佐 美曲霉白色突变株 &< 为出发菌株，通过微波诱变和 亚硝基胍、硫酸锂复合诱变剂点试平板法诱变，选育
菌所产酸性蛋白酶与黑曲霉产 3 型酸性蛋白酶的性 质相近，最适 ,- 也在 %/ $。就酶的 ,- 值稳定性而 言，曲霉和根霉所分泌的酸性蛋白酶一般在 ,- " . 1 较稳定。酸性蛋白酶对 ,- 值的这种要求，可能与其 酶活性中心含有的羧基有关 。 !" # 温度 酸性蛋白酶一般在 5$6 以下较为稳定，但也随 产酶微生物的不同而有所差异。如根霉属所产酸性蛋 白酶在 %$6 下只能保持 %$789，而曲霉属的斋藤曲霉 所产酸性蛋白酶在 5$6 稳定， 556 处理 ’$789 才会 失活。黑曲霉 :;、 :%’5 菌株所产酸性蛋白酶在 2$6 保温 "< 后仍有 ($= 的酶活力存在。青酶属产的门冬 氨酸蛋白酶，最适 ,- 值条件下， 5$6 时达到最大酶 活。酵母菌所产酸性蛋白酶经 1$6 处理后还剩少许 酶活力，经 #$6 处理后酶活完全丧失。 !" $ 抑制剂 通常酸性蛋白酶的抑制剂主要是重氮酮化合物和 十二烷基硫酸钠。霉菌来源的酸性蛋白酶通常并不受 胃蛋白酶抑制剂—— — 对 ! 溴苯的抑制，但却对 > ! 溴 代琥珀酰亚胺和高锰酸钾敏感。此外，并非每种酸性 蛋白酶都会被胃蛋白酶抑制剂或链霉素胃蛋白酶抑制 剂 & ; ! ?@ ) 抑制，如黑曲霉所产酸性蛋白酶 3’ 、 3"， ;ABCDE8F8G7 E8HIAJEG7 所 产 酸 性 蛋 白 酶 4 对 其 均 不 敏 感。某些青霉属的微生物和根霉属的中华根霉所产酸 性蛋白酶见光会被 "+ % ! 丁二酮作用而失活，这可能 与酶的活性部位含酪氨酸以及色氨酸有关。另外，沙 门拍干酪青霉产的门冬氨酸蛋白酶可被 ’+ " ! 环氧 ! % ! & 对硝基苯 ) 丙烷 & K?>? ) 、重氮乙酰 L0 ! 亮氨酸 甲脂 & L3> ) 及胃蛋白酶抑制剂所抑制，这与门冬氨酸
营养研究
酸性蛋白酶 及其在畜牧业中的应用
肖 竞 孙建议 李卫芬 & 浙江大学饲料所，动物分子营养学教育部重点实验室，杭州 %’$$"( ) 摘 要 酸性蛋白酶能在酸性环境中水解蛋白质，广泛用于制革工业、医药业、酿造业和饲
料工业。酸性蛋白酶作为一种新型的饲料添加剂，可以明显促进幼龄动物的生长发育，降低断奶 带来的应激效应，饲用效果非常显著，是一类应用前景非常广阔的酶制剂。本文对酸性蛋白酶的 酶学特性及其在畜牧业中的应用研究进展进行了综述。 关键词 酸性蛋白酶； 仔猪； 畜牧业； 应用
饲料博览
!""# 年第 # 期
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营养研究
促进短肽、氨基酸的吸收。由此可见酸性蛋白酶的作 用不仅在于降低幼龄动物的应激反应，更在于其分解 蛋白质为动物提供了大量的小肽，以促进动物的吸收 利用，从而促进动物的生长。 !" # 饲用效果 美国用 &#’ 头小猪进行的 (% 次试验表明，在蛋 白质来源以大豆为主的日粮中，给 ( ) ’ 周龄小猪添 加酸性蛋白酶，增重提高 ($* ) +$* ，饲料利用率 提高 &$* ) (($* 。许怡等 , (##% - 在仔猪饲料中添加 "* 的酸性蛋白酶，结果增重提高 ($* ，饲料转化率 提高 .* 。费笛波等 , (##. - 报道：酵母的酸性蛋白酶 解液中氨基酸总量、必需氨基酸总量分别比对照提高 &#/ 0* 和 0$/ ’* ；鱼粉的酸性蛋白酶解液中氨基酸 总 量 、 必 需 氨 基 酸 总 量 分 别 比 对 照 增 加 .(/ &* 和 ."/ 0* 。此研究结果表明，酸性蛋白酶在非常规饲料 中的应用效果要优于常规蛋白饲料。费笛波等 , (##0 研究表明，在最佳作用条件下 1 酸性蛋白酶对酵母和 鱼粉具有明显降解作用 1 氨基酸总量分别比对照增加 &#/ 0* 和 .(/ &* 。将 ’$$$2 3 4 的饲用酸性蛋白酶制 剂以 $/ (* 的量添加于乳猪及仔猪饲料中，日增重和 饲料转化率分别比对照提高 0/ 00* 和 +/ 0(* 。王敬 勉等 , (##0 - 用酸性蛋白酶产生菌种发酵酒糟蛋白饲 料，以 ’* ) &* 加入到日粮中饲喂蛋鸡，结果试验 组比对照组产蛋率提高 (* ) "* ，饲料成本降低 &* ) #* 。祝国强等 , (##& - 用含 $/ (* 酸性蛋白酶的饲 料饲喂早期断奶仔猪，结果试验组平均日增重比对照ห้องสมุดไป่ตู้组 提 高 ((/ #+* , 5 6$/ $’ - ， 饲 料 利 用 率 提 高 (’/ (&* ， , 5 6$/ $’ - 。吴天星等 , (### - 研究酸性蛋白 酶和甲酸钙复合作用对断奶仔猪生产性能的影响时发 现：酸性蛋白酶和甲酸钙的联合使用使断奶仔猪日增 重 提 高 "%/ $* , 5 6$/ $( - 、 采 食 量 提 高 (0/ "* , 5 6$/ $( - ，料重比降低 ’/ $* , 5 6$/ $’ - ；同时使断奶仔 猪腹泻频率降低 &&/ &* , 5 6$/ $( - ；酸性蛋白酶和甲 酸钙使断奶仔猪对饲料中干物质、粗蛋白、钙和磷等 成 分 的 表 观 消 化 率 分 别 提 高 ""/ ’* ， "+/ ’* ， "(/ (* ，"0/ #* 。 $ 结 语
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到一株酸性蛋白酶的高产菌—— — ;##H，遗传性状非常 稳定 。 J8?5 OL> ’ <AA" + 等从 JPQP9870 BR>SD>9E?ET8R7P 中获得一种酸性蛋白酶，其最适作用温度为 6"K ， 在 G6K 或 66K ， 酶活 力 只有 最 大活 力 的 A"= ， 若 66K 保温 G"7E?，则活力减半，在 H"K 保持 <"7E?， 酶活力不足 <6= 。 UP? 3LE7>D0 等 ’ !""" + 利用转基因 技术将 3BCD09EFE>7 9E5?EB89>7 中的酸性蛋白酶基因导 入到酵母中，获得分泌该种酸性蛋白酶的酵母突变体
% %" ! 酸性蛋白酶的作用机理及饲用效果 作用机理 由于饲用酶进行催化反应在畜禽消化道内进行， 故其作用条件必须与动物消化道生理条件相适应，而 通 常 猪 和 家 禽 消 化 道 内 温 度 为 G"K 左 右 ， 胃 IJ <@ 6 W #@ 6，小肠 IJ 6 W M，与酸性蛋白酶作用的一些 基本参数相吻合。 畜禽尤其是幼龄动物的消化道内蛋白酶分泌体系 发育不健全，而在生长的中后期，自身虽有内源酶， 但尚显不足，当采用高蛋白饲料饲养时，因其对饲料 蛋白质消化能力较差而易引起腹泻等疾病。尤其是断 奶仔猪，消化道发育不成熟，消化酶分泌系统不健 全，特别是胃酸分泌不足，免疫功能低下，加上断奶 时的生理、营养和环境应激反应，对饲料的营养成分 不易消化和吸收，对病原微生物的抵抗力较弱，易造 成正常肠道菌群平衡紊乱，经常出现较高的腹泻率， 导致早期生长受阻。若在饲料中添加酸性蛋白酶，则 能补充内源酶的不足，使高分子的蛋白质降解为低分 子的肽、胨及各种氨基酸，而易被畜禽消化吸收，从 而降低饲料对断奶仔猪消化道的刺激，降低应激反 应，减少营养障碍，提高饲料利用率，促进生长。 有人报道兔子在出生前后对小肽的利用率大于对 氨基酸的利用率，且出生时达到最大。随着生长发育 逐渐降低，最终与游离氨基酸吸收率相同。而 XP7>R0 N8SLEDS>5> 等 ’ <AAA + 的研究则发现，酸性蛋白酶的酶 解产物主要是分子量在 #"" W H"" 之间的小肽，酸性 羧肽酶的酶解产物主要是分子量在 !"" W G"" 之间的 小肽。吴天星等 ’ <AAA + 发现酸性蛋白酶能提高蛋白表 观消化率，提高小肠绒毛表面短肽和氨基酸的浓度，
酸性蛋白酶的活性，但它可作为其它物质的辅助因子 而对某些酸性蛋白酶产生抑制作用。 $ 酸性蛋白酶的产生菌株 A" 年代前期，国内酸性蛋白酶的生产较少，其 原因主要是由于菌种产酶活力低，生产成本太高所 致。近年来国内外都致力于选育产酶活力高、抗逆性 好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。 目前用于酸性蛋白酶生产的菌种主要有黑曲霉和宇佐 美曲霉及它们的突变株，国外也有用 3BCD09EFE>7 、巢 状曲霉和酵母等菌种生产酸性蛋白酶的报道。 钱 玉 英 等 ’ <AAG + 用 /8! 射 线 诱 变 处 理 黑 曲 霉 /*> 菌株，获得突变菌株 H"G!，产酶活力比出发菌 株提高近 G 倍。章剑林等 ’ <AA6 + 以黑曲霉为出发菌
同 微 生 物 所 产的 酶 稍 有 不 同 。 根 霉 属在 ,- %/ $ 左 右。曲霉属在 ,- %/ $ 以下，翁醒华等报道，宇佐美 曲 霉 突 变 株 0%%1 所 产 酸 性 蛋 白 酶 的 最 适 ,- 值 在 ’/ 2 . %/ $ 之间，但黑曲霉所产的 3 型和 4 型酸性蛋 白酶的最适 ,- 均为 %/ $。青霉属一般在 ,- % . * 之 间，如紫青霉为 ,- %/ $，灰绿青霉为 ,- %/ 5。酵母
文献标识码： 3 文章编号：’$$* ! $$2* & "$$% ) $% ! "# ! $% 中图分类号： ;2’1/ #
酸性蛋白酶包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物 蛋白酶，适宜在酸性条件下水解蛋白质。酸性蛋白酶 用作动物饲料添加剂，可提高动物 & 特别是幼龄动物 ) 对饲料中蛋白成分的消化吸收率，促进其生长。此 外，它还用于制革工业中皮革的脱毛和软化，食品工 业中蛋白质的水解生产高档食品，医药工业中消化剂 和消炎剂的制造等。 近年来，随着集约化畜禽生产的发展，加剧了环 境污染。其中，氮是污染环境的主要物质，因而提高 饲料中蛋白类营养物质的利用效率，降低其排放就显 得尤为重要 。此外，由于我国蛋白质饲料资源严重 缺乏，需要寻求非常规蛋白资源，而动物对非常规蛋 白饲料的利用效率很低。研究表明在饲料中添加酸性 蛋白酶 + 可提高该类蛋白质的可消化性，因此酸性蛋 白酶的开发利用就显得非常重要。 ! 酸性蛋白酶的酶学性质 酸性蛋白酶是一类具有复杂理化性质的化合物， 不同微生物菌种分泌的酸性蛋白酶虽具有一些共同的 性质，但在底物特异性、抑制剂、激活剂等方面均存 在着一定的差异。 !" ! ,- 值 酸性蛋白酶作用的最适 ,- 值一般在 " . *，但不
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蛋白酶中的羧基在其催化反应中起关键作用有关。黑 曲霉所产的 & 型蛋白酶，受二硫代双 ! $ 硝基苯甲酸 ’ ()*& + 、 ,*-* 及 (.- 的抑制，而 . 型酶完全不被 ,*-* 抑制，只被 (.- 及重氮试剂部分抑制，需要指 出的是，上述试剂对 .、 & 两种酶的抑制作用都需要 有 /0! 1 的参加。对啤酒酵母所产的胞外酸性蛋白酶 的研究表明，其可被甲苯磺酰氟 ’ *234 + 和对氟汞苯 甲酸 ’ */2& + 部分抑制。另外，从日本清酒酒曲中分 离出的酸性蛋白酶，其性质类似于 “ 胃蛋白酶” 型酸性 蛋白酶，可被 ,*-* 和胃蛋白酶抑制剂所抑制，但对 对 $ 溴苯和联乙酰试剂不敏感。 !" # 金属离子对酸性蛋白酶的影响 .5 1 对酸性蛋白酶有轻度抑制作用，当其浓度为 67789 : ; 时，酶活下降 <6= ； />! 1 、 2?! 1 对其有激 活作用，当 />! 1 的浓度为 "@ "!789 : ; 时，对酶有明 显的激活作用； /> 、 .9 和 2? 同时添加时，对 酶有协同作用，使酶活提高 < 倍；/0! 1 本身并不抑制