第六章 微生物菌种的筛选与保藏

单株纯种分 离
一、采样
从自然界种采集含目的菌的样品
1. 环境条件对土样本中微生物分布的影响
（1）营养环境 ①高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土壤 中：耐渗透压酵母，柠檬能产生菌，氨基能产生菌； ②富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉酶产生 菌； ③森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌； ④含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中：蛋 白酶产生菌； ⑤油田土：石油分解菌 ；
生产性状的劣化,遗传标记的丢失, 原有的典型性状的 不典型等
菌落及细胞形态的改变 生长速度缓慢 代谢产物生产能力下降，即负突变 致病菌对宿主侵染力下降 抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱
2. 菌种退化的原因：基因自发突变
退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步 演变过程。
（2）水分 ①离地表5-15cm土样 ②含水过多、过少都不理想
（3）温度：采样以秋季为好 （4）通风 （5）酸碱度：
细菌、放线菌：中性或偏碱； 霉菌、酵母：偏酸
2 .采样方法
（1）去除表层土 （2）取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆
料袋中 （3）植物根、茎、叶、花、果实。
适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育
（5）抑制圈
适用：抗生素产生菌的选育 工具菌：对目的抗生素敏感的微生物 例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株 工具菌可使用金黄色葡萄球菌 方法
目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落 代谢物积累：用打孔器（6CM）将菌落连同周围琼
脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培 养4-5天，使新产生抗生素积累于小琼脂块中 测定：取107工具菌涂布于球脂培养基，将小琼脂 块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块 中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低
2、平皿反应快速检出法——定性或半定量 （1）纸片培养显色法
滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基 用接种环接种 保湿恒温培养 据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量
（2）透明圈法
根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产 物的产量
淀粉平板透明圈：淀粉酶 碳酸钙平板透明圈：产酸 酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶
反应产生H2 和CO2，H2与O2反应生成水 厌氧指示剂
（3）厌氧分离（培养）技术
高层琼脂柱技术 厌氧罐技术 厌氧手套箱技术
厌氧培养箱
四 、筛选
1、初筛：通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行，每 株一瓶
目的：淘汰80%-90%的分离菌株中的低产菌
（1）培养条件：主要通过查阅资料及需要而预先决 定：如培养基组成，通风量（装液量，摇瓶机转数）， pH、温度、培养时间等。
(2) 向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育 (3) 从自然界中分离菌种
从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中 有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。
从自然界中分离筛选菌种的一般步骤 筛选目标→设计方案
采样
增殖培养
平板分离
性能考察(生 产性能试验、 菌种鉴定）
筛选(初筛、 复筛)
种量，培养温度… 2、小型台式发酵罐发酵工艺条件 溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡
剂…
第二节 菌种退化、复壮与保藏
在生物进化中： 遗传性的变异是绝对的，稳定性是相对的；
在变异中： 退化性的变异是大量的，进化性的变异是个别的。
一.菌种的退化 1、菌种退化degeneration的表现
3 注意
记录：时间，地点，环境情况等 样品袋应封好口，防止水分失去 土样应在分离前破碎 尽快分离
红树林
二. 增殖培养（富集培养） 适用：样品中目的菌数量不够多时 目的：提高样品中目的菌的数量和比例 原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得
以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制
（四）菌种保藏机构 1、中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM
中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC(归口中国科学 院)
中国科学院微生物研究所(AS) 中国科学院武汉病毒研究所(AS-IV) 中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科
学院) 中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF) 中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会) 中国食品发酵工业研究所(IFFI)
复壮方法 1、纯种分离法
平板表面涂布法
纯种分离法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
菌落纯 （菌种纯）
细胞纯 （菌株纯）
平板划线分离法 琼脂培养基浇注法 用“分离小室”进行单细胞分离 用显微操纵器进行单细胞分离 用菌丝尖端切割法进行单细胞分
离
2、通过宿主体复壮：病原菌
对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆 虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。例如，苏云 金芽孢杆菌经过长期人工培养会发生毒力减退、杀虫 率降低等现象，可用退化的菌株去感染菜青虫的幼虫， 然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。如此反复 多次，就可提高菌株的杀虫率。根瘤菌属经人工移接, 结瘤固氮能力减退,将其回接到相应豆科宿主植物上, 令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮 性能就可恢复甚至提高。
自发突变率10-8~10-9 加速退化的因素:传代次数过多;不适宜的培养条件。
3.防止退化的措施 （1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件：培养基；培养温度等
保藏培养基：
细 菌：营养琼脂 放线菌：高氏一号 霉 菌：察氏培养基 酵母菌：YPD
（3）利用不易衰退的细胞传代：霉菌、放线菌： 无性孢子或有性孢子
（3）变色圈法
淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶 支链淀粉平板喷稀碘液：
蓝色圈：异淀粉酶 无色圈：液化型淀粉酶 葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶 木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶
（4）生长圈法
工具菌：
营养缺酸型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积 累的产物
菌落形态明显不同于目的菌
方法：106~107 工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂 培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌
4. 方法
（1）控制营养成分 ① 纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌 ② 可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种 ③ 酒精废水，可以增殖废水利用菌
* 多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素
（2）控制培养基pH 细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸 但非目的菌的生长不能被完全抑制
三. 纯种分离 目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得
纯培养 1、纯种分离的一般方法
（1）稀释平板法 倾注平板或涂布平板 （2）划线法
稀释分离涂布平板
划线分离
（3）组织培养法 适用于分离高等真菌及植物病原菌 高等真菌：如香菇→切1小块菌盖→10%漂白粉消
毒处理→无菌水冲洗→臵琼脂平板上→培养→长出 菌丝体 或：→悬挂在有琼脂培养基的三角瓶内→培养→长 出菌丝体 注意：对蔓延性霉菌： ① 加1%去氧胆酸钠 ② 察氏培养基：0.01%蔗糖，0.1%山梨糖
（2）分析测定：最好定量，如较困难时可采取半定 量方法
2、复筛：每株3~5瓶，可提前培养种子，使接种 量比较一致，3~5%接种量，
培养条件可同初筛
分析测定：定量，注意副产物
复筛可进行多次，逐步淘汰，留下3~5株甚至最好 的1株
好氧培养
五、培养工艺条件试验与生产试验 1、摇瓶发酵条件 培养基组成，初始pH，通风量（装液量），接
中国海洋微生物菌种保藏管理中心（MCCC）
中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部)
中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，南京 卫生部药品生物制品检定所(NICPBP) 中国预防医学科学院病毒研究所
中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管理局)
中国医学科学院医药生物技术研究所 四川抗生素研究所(SIA)，四川 华北制药厂抗生素研究所(IANP), 石家庄
刚果红与纤维素等多糖物 质形成红色复合物
淀粉遇碘变蓝 抑菌圈
3、厌氧性微生物的分离法 （1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh
煮沸法：将培养基臵沸水中煮沸15分钟，驱除其中的 溶解氧，勿再摇动，Eh可降至0.1V 以下
培养基预还原：将培养基中加入还原性物质：半胱氨 酸，巯基化生物，Na2S，抗坏血酸等降低Eh
3、砂土管保藏法 方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂土管中→ 干
燥→ 封口 → 保藏 措施：无营养，缺氧，干燥 适用：产孢子（芽孢）微生物 保藏期：1~10年
4、冷冻干燥保藏 方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮 → 加入安醅管
中→低温冻结（-25—-40℃）→抽真空（至 0.01mmHg） → 真空封口 → 检查真空度 → 保藏 措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 适用：各大类 保藏期：5~15年或更长
（二）原理
挑选典型培养物（typical culture）的优良纯种， 并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢 不活泼、生长受抑制的休眠状态。
措施 低温：生长温度低限约为-30℃，水溶液中酶促
反应温度低限-140℃ 干燥 缺氧 避光 缺乏营养 添加保护剂：甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白、海
（4）采用有效的菌种保藏方法
二. 菌种的复壮 rejuvenation 狭义复壮
在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测 定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛 选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性 状的相应措施；
广义复壮 在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常
有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期 从中选择到自发的正突变个体。也称生产育种。
第六章 微生物菌种的筛 选与保藏
本章要点 如何按目的要求筛选菌株 微生物菌种保藏方法 了解国内外各大菌种保藏机构
种 （speci
es）
≠
菌株
>
（strain）
第一节 从自然界中分离筛选菌种
生产菌株来源 1、索取或购买 2、自己选育
(1) 用原有菌株进行遗传改造进行育种
① 诱变育种 ② 基因重组育种
藻糖。 添加酸度中和剂
（三）菌种保藏方法 1、斜面保藏法 方法：接种适宜斜面培养基 → 培养 → 4℃保藏
措施：低温：4℃ 适用：各大类 保藏期：1~6个月 用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间 2、石蜡油封藏法 方法：斜面或半固体接种 → 培养 → 加无菌液蜡 高出培养 基1cm→4~15℃保藏 措施：低温，隔氧 适用：不能利用石油的各大类 保藏期：1~2年 优点：简便
（3）控制培养温度 30℃左右培养，可培殖嗜温微生物 50~60℃培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株
（4）热处理——增殖芽孢细菌 样品悬浮液经80℃、10分钟处理，杀死营养体， 再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌
（5）添加抑制剂 10%酚数滴：抑制细菌霉菌生长，增殖放线菌 抗生素：抑制细菌放线菌，增殖酵母、霉菌 多粘菌素B：抑制G-细菌 青霉素：抑制G+细菌 制毒菌素：抑制真菌 放线菌酮：抑制真菌
刃天青 偶氮间苯四酚 resazurin
氧化还原指示剂，在缺氧环境下由粉红变为无色。
（2）创造无氧环境 物理除氧
空气臵换法：干燥器或厌氧培养罐 抽真空 76mmHg→充入N2 （反复3次）→充入CO2
10% +H2 10% + N2 80%
化学除氧
H2 + O2 → H2O (钯作催化剂） GASPAK罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠化学
5、甘油悬液低温冷冻保藏法 方法：菌种培养 → 15~30%甘油缓冲液悬浮 →
加入保藏管中 → 臵 -70℃冰箱保藏 措施：低温（-70℃）、保护剂（15~50%甘油） 适用：细菌、酵母菌 保藏期：约10年
6、液氮保藏法 方法：菌种培养 → 保护剂悬浮 → 加入保藏管中
→ 臵液氮瓶中 措施：超低温（-196℃）、保护剂 适用：各大类 保藏期：>15年
3、淘汰已衰退的个体 对S. microflavus“5406”农用抗生菌的分生孢子
采用-10~-30℃的低温处理5~7天，使其死亡率达到 80%左右，结果会在抗低温的存活个体中留下未退化 的个体，从而达到复壮的效果。
三. 菌种的保藏
（一）目的
使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、不 死亡、不被污染，便于研究、交换和使用 。