2.1SDS-PAGE配制表 - 360文档中心

SDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程(非还原&还原)

GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程（还原&非还原）编号：SDS-PAGE蛋白电泳检测起草人：部门审核：QA审核：替代：□新订：□日期：日期：日期：修订号：0批准：年月日生效日期：年月日文件分发部门：GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测编号：SDS-PAGE蛋白电泳检测一目的保证产品电泳电泳分子量和纯度检测按规范进行和检定结果的准确可靠。

二范围用于规范电泳电泳分子量和纯度的测定。

三责任质量控制部人员。

四内容1试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。

2 溶液的配制2.1A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取90.75gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用6M盐酸调pH值至8.8,加超纯水定容至500 ml。

贴上标贴，室温储存。

此溶液有效使用期限为三个月。

6M盐酸（调pH用）：浓盐酸50ml，加50ml纯化水，混匀。

2.2、B液: 0.5MTris·HCl pH6.8称取60.5gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用6M盐酸调pH值至6.8,加超纯水定容至1000 ml。

贴上标贴，室温储存。

2.3C液: 30%丙烯酰胺-0.8%N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶液称取300g丙烯酰胺(分析纯),8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解(一般500ml，因为丙烯酰胺具有溶胀性的特点),再定容至1000 ml,用滤纸过滤。

贴上标贴，避光4℃保存。

2.4D液:1%SDS称取2gSDS(分析纯),用超纯水溶解至200 ml.贴上标贴，4℃保存。

2.5E液:10%过硫酸铵GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测编号：称取10g过硫酸铵(分析纯)，用超纯水溶解至100 ml，以1ml/支分装，贴上标贴，－20℃保存。

SDS-PAGE试剂配方

SDS—PAGE电泳所用溶液：30 ％聚丙烯酰胺溶液（100 mL)丙烯酰胺（Arc）29 gN,N’—亚甲双丙烯酰胺(Bis） 1 g用双蒸水定容至100mL，过滤备用,4℃存放丙稀酰胺29。

2g,N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0,过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

5×Tris-甘氨酸缓冲液(1 L)Tris碱15。

1 g甘氨酸（电泳级) 94 g10 %SDS 50 mL使用时稀释5倍使用2×SDS凝胶加样缓冲液（10mL）0.5 mol/L Tris—Cl (pH 6。

8) 2 mL10%（W/V）SDS 4 mL甘油 2 mLβ—巯基乙醇 1.0 mL（DTT（二硫苏糖醇）0。

31g）溴酚兰0。

02g双蒸水0。

5 mL室温存放备用考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R—250 （G—250）1。

0 g甲醇450 mL冰醋酸100 mLddH2O 450 mL0.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95%乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好,但有毒性）甲醇100 mL冰醋酸100 mLddH2O 800 mL医用酒精：冰醋酸：水=4.5：0。

5：5（V：V：V）SDS—PAGE所需溶液:A液-—30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N—N-甲叉双丙稀酰胺0。

8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7。

0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8。

8:18.17g（9。

09g)Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约3mL(1。

5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8。

8,定容至100mL（50mL）。

C液-—1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8:12。

1g（6.05g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约7mL （3。

SDS-PAGE分离胶-浓缩胶配方

SDS-PAGE1、SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳2、Acr：丙烯酰胺；配胶时用30%Acr（质量比Acr：Bis=29:1）3、Bis：甲叉双丙烯酰胺4、DDW：超轻水5、SDS：十二烷基硫酸/磺酸钠，阴离子去污剂（配胶时用10%）6、APS：过硫酸铵NH4S2O4配胶时用10%7、TEMED：四甲基乙二胺，促凝剂8、Tris-Hcl：3羟基氨基甲烷盐酸缓冲液，配胶时（分离胶ph=8.8，浓缩胶ph=6.8）9、DTT：二硫苏糖醇，DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。

10、IMA：碘乙酰胺，碘代乙酰胺用于有机合成，在蛋白组学中组氨酸和半胱氨酸的烷基化试剂，用于多肽测序以及酶抑制剂等，蛋白组学级试剂。

CH>2ICONH>2，是和碘乙酸一样，可通过下列反应不可逆地抑制SH酶类的物质。

1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。

1)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：TBST 缓冲液每2L体积中含：1)抗体去除液每50mL抗体去除液中含：SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

《中国药典》(2020版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。

本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。

本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。

1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。

2.试剂（1）水。

（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。

（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。

（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。

（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。

（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。

建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。

（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。

（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。

（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。

SDS-PAGE实验步骤

试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml）(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。

可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。

2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。

过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。

5. TEMED（四乙基乙二胺）原液。

6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。

7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。

置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

器材电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。

样品制备将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。

放入100℃加热5－10min，离心，取上清点样。

电泳1. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddHO冲洗数次，再用乙醇擦2拭，晾干；2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；3. 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；O 3.0 ml ddH21.0 mol/LTris-HCl pH=8.82.1 ml30% Acr-Bis 2.8 ml 10% SDS 80 ul10%AP 56 ul TEMED 6 ul4. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；5. 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；O 2.0 ml ddH21.0 mol/LTris-HCl pH=6.8 400 ul30% Acr-Bis 600 ul 10% SDS 36 ul10%AP 24 ul TEMED 4 ul6. 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；7. 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;8. 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr；9. 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm 脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。

SDS-PAGE原理、试剂配制和注意事项

SDS是阴离子去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白分子的二、三级结构。

作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。

电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。

电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。

蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。

电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。

过硫酸铵（AP）为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。

在聚合过程中，TEMED 催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS-PAGE凝胶电泳操作

SDS-PAGE凝胶电泳操作一、常规试剂的配制1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；2.1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；5. 10% AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；6. 1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS （1g/L），pH 8.30；7. 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；8. 脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；10. 2×SDS-PAGE上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。

二、样品的处理1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品（1）粉剂（或颗粒）样品称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。

SDS-PAGE配胶试剂盒使用说明书

SDS-PAGE配胶试剂盒使用说明书Cat.No：Lot No：原理：本技术中，待分离的样品在有SDS-PAGE和还原剂的存在下通过加热而变性并被去污剂所包被。

SDS可使蛋白质带上大量的负电荷，其带电荷的多少正好与多肽的长度成正比。

聚丙烯酰胺凝胶上样后，在高电压的作用下，蛋白组分向正极（阳极）迁移。

由于所有的蛋白所带的负电荷与其分子大小成正比，因而蛋白就仅仅根据其分子量的大小不同而被分离—凝胶的分子筛效应。

蛋白质的分子量就可以通过与标准蛋白的凝胶迁移率进行比对而得到。

凝胶电泳后，特定的凝胶条带可以通过染色而观察到，并且可通过被动扩散或电洗脱从凝胶上进行回收。

两种最常用的染色方法是考马斯亮蓝法和银染法，这两种方法的蛋白条带检测灵敏度可分别达到50ng和5ng。

由于考马斯亮蓝法使用简便，并可以对收集的蛋白带作进一步分析，因而较为常用。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳应用范围：1）蛋白质纯度的分析；2）蛋白质分子量的测定；3）蛋白质浓度的测定；4）蛋白质水解的分析；5）免疫沉淀蛋白的鉴定；6）免疫印迹的第一步；7）蛋白质修饰的鉴定；8）分离和浓缩用于产生抗体的抗体的抗原；9）分离放射性标记的蛋白质。

试剂盒组成：1．30%预制聚丙烯酰胺胶（4℃保存）200ml2．1.5M TrisCl（PH=8.8）200ml3．1.0M TrisCl（PH=6.8）50ml4．10%SDS 30ml5．10%过硫酸铵（4℃保存）30ml6．去离子水250ml7．TEMED（4℃闭光保存！）1ml8．5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液250 ml9．考马斯亮蓝染色剂50ml10. 考马斯亮蓝脱色剂250ml5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液用时以去离子水1：4稀释，配成1×-甘氨酸电泳缓冲液工作液。

凝胶的配制：（1）将玻璃板安装固定好切误把玻璃弄坏（2）进行分离胶的配制（3）加入TEMED后立即混匀内容物倒入到固定好的玻璃板中，同时留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.5cm）再在胶液面上小心注入一层水（约2—3mm高）以排除气泡和阻止氧气进入凝胶溶液。

SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理

SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，、分离胶缓冲液(Tris—HCl，，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝，pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。

分子量(还原型SDS-PAGE)测定标准操作规程

细胞因子分子量（还原型SDS-PAGE）测定标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。

范围：适用于细胞因子蛋白质分子量测定。

目的：测定待检品分子量是否符合《中华人民共和国药典》2005年版要求原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成大分子凝胶后再进行电泳。

因此它兼具了分子筛效应与电泳效应。

其催化系统为过硫酸铵-TEMED系统。

而SDS这种阴离子表面活性剂的加入，它能使蛋白质氢键、疏水键打开，并按一定比例与蛋白质分子结合成带负电的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，因而掩盖了不同种类的蛋白质间原有的电荷差别。

这样就使电泳的迁移率只取决于分子量大小这一因素，从而达到分离不同组分的蛋白质的目的，并在还原剂巯基乙醇的存在下，（定量的巯基乙醇可以使蛋白质分子内的二硫键彻底还原；以使SDS定量的结合到蛋白质分子上去，使蛋白质具有相同的构象），可以检测到是否有蛋白质聚合体的产生。

内容：1材料1．1样品：经二人复核批号无误后检测1．2试剂甲醇 CH3OH 分析纯无水乙醇 C2H5OH 分析纯浓盐酸 HCl 分析纯甘油 C3H8O3分析纯硝酸银 AgNO3分析纯重铬酸钾 K2Cr2O7分析纯正丁醇 C4H9OH 分析纯甲醛 HCHO 分析纯丙烯酰胺 CH2CHCONH2分析纯甲叉双丙烯酰胺 [（CH2CHCONH2）2]CH2分析纯过硫酸铵（NH4）2S2O8分析纯TEMED （四甲基乙二胺）(CH 3)2N(CH 2)2N(CH 3)2 分析纯甘氨酸 C 2H 5NO 2 分析纯 SDS （十二烷基硫酸钠）C 12H 25O 4SNa 分析纯乙酸 CH 3COOH 分析纯碳酸钠 Na 2CO 3 分析纯 β-巯基乙醇 HSCH 2CH 2OH 分析纯溴酚蓝 C 19H 10Br 4O 5S 分析纯 1．3分子量标准品：法玛西亚公司。

1．4注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求 1．5设备扭力天平上海第二天平仪器厂垂直板状电泳槽北京东方仪器厂恒温恒流电泳仪法玛西亚公司快速电泳槽 BIORAD USA 全自动扫描仪 CS-930日本岛津TS-1型摇床1．6器皿：500ml 瓶、100ul 移液器、1ml 吸管、10ml 吸管、3000ml 三角瓶、平皿、1000ml 烧杯、80ml 烧杯，以上器皿经本室洗刷组处理。

SDS-PAGE配方

.SDS-PAGE1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围胶6%50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD胶12%12-60kD15%胶10-40kD.'.成分分离胶所需各成分的体积（毫升）配制不同体积SDS-PAGE胶。

即可配制成非变性注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDSPAGE 冰箱放两周，但是最好新鲜配置效果好。

10%过硫酸铵配好后可以在4D ：(也称堆积胶、积层胶或上层胶)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶1)1L电泳缓冲溶液5XTris-Glycine0.5% W/V SDS ，1.25M Glycine 0.125M Tris，Tris 15.1 gGlycine 95 gSDS 5.0 g.'.5X SDS-PAGE 加样缓冲液：5ml250mM Tris-HCl (pH6.8), 10% SDS, 0.5% BPB, 50% glycerol, 5% 2-ME 1M Tris-HCl (pH6.8): 1.25 mLSDS：0.5 gBPB: 25mgGlycerol: 2.5ml2-ME: 使用时加入小份（25微升），新鲜使用。

TBST 缓冲液每2L体积中含：1M TrisHCL(pH7.5) 100mLNacl 16g0.4g KCL1ml吐温1)抗体去除液50mL抗体去除液中含：每6.25mL pH6.80.5M TrisHCL（）10mL 10%SDS0.175mL Beta-ME33.75mL 水.'.SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

SDS-PAGE 操作标准

SDS-PAGE 操作标准一、电泳相关溶液的配制：1、30%丙稀酰胺混合溶液（100ml ）：丙稀酰胺 29g （实际可以为29.2g ）双丙稀酰胺 1g （实际可以为0.8g ）用水溶解定容到100ml ，过滤，4摄氏度保存一个月。

2、5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：5× 1×Tris base 15.1g 25mmol/L 甘氨酸 94g 250mmol/L （pH8.3） 10%SDS （m/V ） 50mL 0.1%（m/V ） dH2O 定容至1000ml 。

3、2×SDS 凝胶加样缓冲液：1.0 mol/L pH6.8 Tris-Cl 10 mL 1.0 mol/L 二硫苏糖醇(DTT ) 20 mLSDS 4g 溴酚蓝 0.2g 甘油 20mL加水定容至100mL ，于4℃保存。

注：1.0 mol/L DTT 可替换为10% β-巯基乙醇 4、染色液的配制（1000ml ）: 甲醇或者乙醇 500ml2010.06.28药物部王红勋乙酸 100ml考马斯亮蓝R250 2.5g，去离子水补至1000ml。

充分混匀后进行过滤，收集滤液备用。

当过滤速度变慢时要更换滤纸，快速过滤完，不可隔夜以免影响染色效果。

5、脱色液（1000ml）:甲醇或者乙醇 250ml乙酸 80ml去离子水补至1000ml,混匀，备用。

二、SDS-PAGE分析：1、20uL收集液，加入5×样品缓冲液5ul，在80℃水浴锅中煮5min。

表一：SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围：丙烯酰胺浓度/% 线性分离范围/kDa15 10-4312 12-6010 20-807.5 36-945.0 57-212注：丙烯酰胺:双丙烯酰胺的分子比=1:29表二、5%浓缩胶配方（积层胶、压缩胶）配制不同体积凝胶所需要各成份的体积/mL成份1 2 3 4 5 6 8 10 5%浓缩胶水 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 30%丙烯酰胺混合溶液 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.71.0mol/Tris（pH6.8） 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 1.0 1.2510%SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 10%过硫酸铵 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1TEMED 0.0010.0020.0030.0040.0050.006 0.008 0.01表三：分离胶配方配制不同体积和浓度凝胶所需要各成份的体积/mL 成份5 10 15 20 25 30 40 50 6%胶水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺混合溶液 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.01.5mol/Tris（pH8.8） 1.32.53.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.510%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.0040.0080.0120.0160.02 0.024 0.032 0.04 8%胶水 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 16.5 23.2 30%丙烯酰胺混合溶液 1.3 2.7 4.0 5.3 6.7 8.0 10.7 13.31.5mol/Tris（pH8.8） 1.32.53.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.510%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.0030.0060.0090.0120.0150.018 0.024 0.03 10%胶水 1.9 4.0 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8 30%丙烯酰胺混合溶液 1.7 3.3 5.0 6.7 8.3 10.0 13.3 16.71.5mol/Tris（pH8.8） 1.32.53.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.510%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.0020.0040.0060.0080.01 0.012 0.016 0.02 12%胶水 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.5 30%丙烯酰胺混合溶液 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 16.0 20.01.5mol/Tris（pH8.8） 1.32.53.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.510%SDS 0.05 0.01 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.01 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.0020.0040.0060.0080.01 0.012 0.016 0.02 15%胶水 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.5 30%丙烯酰胺混合溶液 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 20.0 25.01.5mol/Tris（pH8.8） 1.32.53.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.510%SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5TEMED 0.0020.0040.0060.0080.01 0.012 0.016 0.022、按照上面配方制SDS-PAGE凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。

电泳配方

SDS-PAGE配方1. 30% Acry溶液(4摄氏度)丙烯酰胺 29.2gN,N-亚甲基双丙烯酰胺 0.8g定容至100ml2. 10% SDS（W/V）（室温）SDS 10g 定容至100ml3. 1.5M Tris-HCl pH 8.8(分离胶缓冲溶液)（4摄氏度）Tris 18.15g 用6N HCl 调制pH 8.8 定容至100ml4. 0.5M Tris-HCl, pH 6.8(浓缩胶缓冲溶液)（4摄氏度）Tris 6g 用6N HCl 调制pH 6.8 定容至100ml5.上样缓冲液（室温）A液：（A液总量9.5ml）超纯水 3.55 ml0.5M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 ml甘油（即丙三醇） 2.5ml10% SDS 2.0ml0.5%(W/V)溴酚蓝 0.2ml 用时取A液950ul,加入50ul β-巯基乙醇（即巯基乙醇）样品：上样缓冲液为1：2 95℃加热 4 min6. 10×电极缓冲液 pH8.3 (4摄氏度)Tris 30.3g甘氨酸 144.0gSDS 10.0g定容至1000ml（即1L）注意！！不调pH!! 用时，稀释10倍，在室温下使用7.10%（W/V） APS (过硫酸铵)100mg 过硫酸铵加入1ml的超纯水明胶酶谱配方1. 1%明胶溶液1g明胶60℃溶于水中定容至100ml，4℃下贮存2. 5×上样缓冲溶液50%甘油、5%SDS、0.05%溴酚蓝、250mM Tris-Hcl pH 6.83. 10×电极缓冲液Tris 30.3g、甘氨酸 144g、SDS 10g定容至1000ml pH 8.3）；4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳贮液：①30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺29.2g，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺0.8g避光定容到100ml②分离胶缓冲溶液 1.5M Tris-HCl pH 8.8③浓缩胶缓冲溶液 0.5M Tris-HCl, pH 6.8④10%SDS溶液；⑤10%过硫酸铵溶液；5. 2.5% Triton X-100溶液；6. 染色液90mL 等体积甲醇(45ml)与水(45ml)混合液加入10ml冰乙酸中溶解0.25g考马斯亮蓝R-2507. 脱色液300ml甲醇，100ml冰乙酸加水定容至1000ml8. 明胶酶谱孵育液50mM Tris-HCl，10mM CaClpH 7.029. 考马斯亮蓝G-250染液0.1g考马斯亮蓝G-250溶于95%乙醇中，加入100ml 85%浓磷酸加水定容至1000ml 10. 10Mm EDTA二钠溶液分离胶配方（10ml）注：分离胶缓冲溶液为1.5M Tris-HCl pH 8.8 分离胶： 50ul 10%APS 和 5ul TEMED浓缩胶配方（10ml）注：浓缩胶缓冲溶液为0.5M Tris-HCl, pH 6.8 浓缩胶： 50ul 10%APS 和 10ul TEMED2.2.1.1 SDS-PAGE电泳试剂的配制1）30% Acry（m/V）溶液(4℃)：称取丙烯酰胺29.2g ，N,N-亚甲基双丙烯酰胺 0.8g ，超纯水定容至100mL，溶解过程应注意避光，配制完成的溶液倒入试剂瓶中，外套黑色塑料袋避光，4℃冰箱保存备用。

SDS-PAGE电泳标准操作流程

SDS-PAGE电泳标准操作规程（网上）3.程序：3.1. 制胶3.1.1组装胶架将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。

放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。

3.1.2 分离胶的配置梳齿下缘约1cm)。

3.1．2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。

静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。

3.1.3浓缩胶的配置3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表：3.1.3.2插入制胶梳混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。

约30分钟，聚合完全。

3.2. 电泳3.2.1 安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。

两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。

将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。

倒入1X tris-gly电泳缓冲液。

3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80µl的样品，依次加上20µl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。

对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。

3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。

3.2.4 电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。

电压调至约150v保持恒压。

待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。

3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。

3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。

SDS-PAGE凝胶配方

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒产品简介：碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒提供了配制SDS-PAGE凝胶所需的各种试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水，即可配制PAGE胶(即聚丙烯酰胺凝胶)。

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒不仅可用于配制SDS-PAGE凝胶，也可用于配制非变性(native)PAGE凝胶。

本试剂盒约可配制30-50块常规大小的PAGE胶。

保存条件：1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。

30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。

过硫酸铵配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，通常半年内有效。

注意事项：过硫酸铵配制成10%溶液后，应当-20℃保存。

同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。

TEMED易挥发，使用后请盖紧瓶盖。

另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：1. 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：使用本产品的文献：1. Deng XQ, Chen LL, Li NX.The expression of SIRT1 in nonalcoholic fatty liver disease induced by high-fat diet in rats.Liver Int. 2007 Jun;27(5):708-15.2. Wang PH, Gu ZH, Huang XD, Liu BD, Deng XX, Ai HS, Wang J, Yin ZX, Weng SP, Yu XQ, He JG.An immune deficiency homolog from the white shrimp, Litopenaeus vannamei, activates antimicrobial peptide genes. Mol Immunol. 2009 May;46(8-9):1897-904.3. Liang QL, Wang BR, Li GH.DcR3 and survivin are highly expressed in colorectal carcinoma and closely correlated to its clinicopathologic parameters. J Zhejiang Univ Sci B. 2009;10(9):675-82.4. Deng XQ, Cheng JL, Zhang YP, Li NX, Chen LL.Effects of caloric restriction on SIRT1 expression and apoptosis of islet beta cells in type 2 diabetic rats.Springer Verlag. 2009.5. Cao X, Zhang Y, Zou L, Xiao H, Chu Y, Chu X.Persistent oxygen-glucose deprivation induces astrocytic death through two different pathways and calpain-mediated proteolysis of cytoskeletal proteins during astrocytic oncosis.Neurosci Lett. 2010;479(2):118-22. Epub 2010 May 21.6. Cao X, Xiao H, Zhang Y, Zou L, Chu Y, Chu X.1, 5-Dicaffeoylquinic acid-mediated glutathione synthesis through activation of Nrf2 protects against OGD/reperfusion-induced oxidative stress in astrocytes. Brain Res. 2010;1347:142-8. Epub 2010 Jun 1.7. Huang L, Bi HC, Liu YH, Wang YT, Xue XP, Huang MCAR-mediated up-regulation of CYP3A4 expression in LS174T cells by Chinese herbal compounds.Drug Metab Pharmacokinet. 2011;26(4):331-40.8. Li Q, Lei RX, Zhou XD, Kolosov VP, Perelman JM.Regulation of PMA-induced MUC5AC expression by heparin in human bronchial epithelial cells.Mol Cell Biochem. 2012 Jan;360(1-2):383-91.9. Luan HF, Zhao ZB, Zhao QH, Zhu P, Xiu MY.Hydrogen sulfide postconditioning protects isolated rat hearts against ischemia and reperfusioninjury mediated by the JAK2/STAT3 survival pathway.Braz J Med Biol Res. 2012 May 31.10.Chen Z, Qing J, Qin G, Hu LConstruction and characterization of bifunctional TIM-3-EGFP fusion proteins.Protein Expr Purif. 2012 Nov;86(1):1-6. doi: 10.1016/j.pep.2012.08.004. Epub 2012 Aug 23.11.Huang L, Huang M, Li YH, Li RM, Zeng Y, Kuang SY, Zhang L, Wang YT, Bi HC.Up-regulatation of CYP3A expression through pregnent X receptor by praeruptorin D isolated from Peucedanumpraeruptorum Dunn.J Ethnopharmacol. 2013 Jul 9;148(2):596-602. doi: 10.1016/j.jep.2013.05.008. Epub 2013 May 20.12.Zhang H, Wang ZW, Wu HB, Li Z, Li LC, Hu XP, Ren ZL, Li BJ, Hu ZP.Transforming growth factor-β1 induces matrix metalloproteinase-9 expression in rat vascular smooth muscle cellsvia ROS-dependent ERK-NF-κB pathways. Mol Cell Biochem. 2013 Mar;375(1-2):11-21. doi: 10.1007/s11010-012-1512-7. Epub 2012 Dec 29.13.Liu R, Liu X, Zheng Y, Gu J, Xiong S, Jiang P, Jiang X, Huang E, Yang Y, Ge D, Chu Y.MicroRNA-7 sensitizes non-small cell lung cancer cells to paclitaxel.Oncol Lett. 2014 Nov;8(5):2193-2200. Epub 2014 Sep 4.14.Zhao W, Zhao J, Hou M, Wang Y, Zhang Y, Zhao X, Zhang C, Guo D.HuR and TIA1/TIAL1 are involved in regulation of alternative splicing of SIRT1 pre-mRNA.Int J Mol Sci. 2014 Feb 20;15(2):2946-58. doi: 10.3390/ijms15022946.。

SDS-PAGE所有详细试剂配方

SDSPAGE30%聚丙烯酰胺溶液30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】【配制办法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃阁下）的去离子水中,充分搅拌消融,补加水至终体积为100ml.0.45µm微孔滤膜过滤除菌和杂质,储于棕色瓶,4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保管.严厉核实PH不得超出7.0,因可以产生脱氨基反响是光催化或碱催化的.应用期不得超出两个月,隔几个月须从新配制.若有沉淀,可以过滤.【保管前提】4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保管【留意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可经由过程皮肤接收,其作器具有累积性.称量丙烯酰胺和N,N’亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具.可以为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨严操纵,因为它还可能含有少量未聚合伙料.1MTrisHCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)【组分浓度】1MTrisHCL【配制办法】称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水,充分搅拌消融,加>0.7mL的浓HCL调节所须要的pH值（7.4大约0.7mL,7.6大约0.6mL,8.0大约0.42mL）,将溶液定容至1L,高温高压灭菌后,室温保管.应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH 值随温度的变更差别很大,温度每升高1℃,溶液的pH值大约下降0.03个单位.【保管前提】室温保管.【留意事项】对人体有刺激性,请留意恰当防护.1.5MTrisHCL（pH8.8）(分别胶buffer)【配制办法】1L称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水,充分搅拌消融,加浓HCL调节所须要的pH值=8.8,将溶液定容至1L,高温高压灭菌后,室温保管.（1.5mmol/LTrisHCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混杂,加水稀释到100ml终体积.过滤后40C保管.）【保管前提】室温保管【留意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变更差别很大,温度每升高1℃,溶液的pH值大约下降0.03个单位.10%十二烷基硫酸钠SDS溶液10%(w/v)SDS【组分浓度】10%(w/v)SDS【配制办法】称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中,参加约16ml的去离子水,68℃加热消融,滴加浓盐酸调节PH至7.2,定容至20ml 后,室温保管【保管前提】室温保管【留意事项】保管前提：4℃保管. 留意事项：易燃,有腐化性,请留意防护.易挥发,应用后请盖紧瓶盖.为了您的安然和健康,请穿试验服并戴一次性手套操纵.保管前提：4℃保管.留意事项：易燃,有腐化性,请留意防护.易挥发,应用后请盖紧瓶盖.为了您的安然和健康,请穿试验服并戴一次性手套对人体有害,请留意防护.10%过硫酸铵溶液10%(w/v)AP【组分浓度】10%(w/v) 过硫酸铵【配制办法】称取0.1g过硫酸铵置于 1.5ml离心管,加1mL去离子水吹打消融,4℃保管【保管前提】4℃保管【留意事项】10%过硫酸铵溶液在4℃保管时,可应用2周阁下,超出刻日会掉去催化感化5×Tris甘氨酸电泳缓冲液5×TrisGlyci ne buffer （SDSPAGE 电泳缓冲液）【组分浓度】【配制办法】称取15.1gTris,94.0g甘氨酸（glycine）,5.0gSDS,用800ml蒸馏水或去离子水消融,充分搅拌消融,定容至1000ml,室温保管.得0.125mol/L Tris1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液.临用前稀释5倍.【保管前提】室温保管,两年有用.【留意事项】配制好的电泳液应用时光不宜超出两周.电泳缓冲液可以收受接管,收受接管后可再应用12次,但为了取得最佳的电泳后果,应应用新电泳液.5×SDSPAGE加样缓冲液5×SDSPAGE Loading Buffer【组分浓度】0.25MTrisHCL(pH6.8);10%(W/V)SDS;0.5%(W/V) BPB(溴酚蓝);50%(V/V) 甘油;5%(W/V)β巯基乙醇(2ME)【配制办法】量取 1.25mL 1MTrisHCL（pH6.8）,0.5g SDS,25mgBPB,2.5mL甘油,置于10mL塑料离心管中,加去离子水消融后,定容至5mL,小份（0.5mL/份）分装,于室温保管.应用前将25μL的2ME参加到每小份中.参加2ME的Loading Buffer可在室温下保管一个月阁下.【保管前提】20℃保管,至少一年有用.【留意事项】SDSPAGE蛋白上样缓冲液(5X)中含少量DTT和巯基乙醇,有稍微刺激性气息,必须完整消融后再应用.摘自Takara 商品目次试验室通例试剂配制办法TEMED原液直接应用考马斯亮蓝R250染色液【组分浓度】0.1%(w/v)考马斯亮蓝R250,25%(v/v)异丙醇,10%(v/v)冰醋酸考马斯亮蓝染色脱色液【组分浓度】10%(v/v)醋酸,5%(v/v)乙醇。

(完整版)SDS-PAGE分离胶-浓缩胶配方

SDS-PAGE1、SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳2、Acr：丙烯酰胺；配胶时用30%Acr（质量比Acr：Bis=29:1）3、Bis：甲叉双丙烯酰胺4、DDW：超轻水5、SDS：十二烷基硫酸/磺酸钠，阴离子去污剂（配胶时用10%）6、APS：过硫酸铵NH4S2O4配胶时用10%7、TEMED：四甲基乙二胺，促凝剂8、Tris-Hcl：3羟基氨基甲烷盐酸缓冲液，配胶时（分离胶ph=8.8，浓缩胶ph=6.8）9、DTT：二硫苏糖醇，DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。

10、IMA：碘乙酰胺，碘代乙酰胺用于有机合成，在蛋白组学中组氨酸和半胱氨酸的烷基化试剂，用于多肽测序以及酶抑制剂等，蛋白组学级试剂。

CH>2ICONH>2，是和碘乙酸一样，可通过下列反应不可逆地抑制SH酶类的物质。

1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。

1)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：TBST 缓冲液每2L体积中含：1)抗体去除液每50mL抗体去除液中含：SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS缓冲液制备

SDS-PAGE的试剂配置：（a）浓缩胶缓冲液——1.0M pH 6.8的Tris-Hcl溶液：称取12.11g Tris 置于100ml 的容量瓶中，加入约80ml 去离子水，充分搅拌溶解；用盐酸调节pH值至6.8后，将溶液定容，室温下保存备用。

（b）分离胶缓冲溶液——1.5M pH 8.8的Tris-Hcl溶液：称取18.17g Tris于100ml的容量瓶中，加入约80ml去离子水，充分搅拌溶解；用盐酸调节至8.8后，将溶液定容保存。

（c）SDS上样缓冲液：取0.063ml pH 6.8的Tris-Hcl缓冲液与5ml 的容量瓶中，依次加入0.1g十二烷基环酸钠SDS、5.0mg溴酚蓝BPB 和0.5ml甘油；加入适量去离子水搅拌溶解后，定容至5 ml；小份（1 ml/份）分装后，在-20℃下保存备用。

（d）SDS-PAGE 电泳缓冲液：称取3.02g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）于1 L 的容量瓶中，加入18.8 g 甘氨酸（Glycine）和1.0 g SDS；加去离子水溶解并混合均匀后，定容至1 L，室温下保存备用。

（e）30%丙烯酰胺溶液：称取29.0 g 丙烯酰胺（Acr）和1.0 N, N′-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）于100 ml 棕色的容量瓶中，加去离子水溶解并混匀后定容，放置于4℃下保存备用。

（f）10%（W/V）SDS 溶液：称取10.0 g SDS 于100 ml 的容量瓶中，加入约80 ml 去离子水；在68 ℃的水浴中加热溶解，自然冷却至室温；加去离子水定容并，室温下保存备用。

（g）10% （W/V）APS 溶液：称取0.1g 过硫酸铵（APS），置于1.5 ml 离心管中，加去离子水1 ml 溶解即可；4℃保存备用。

（h）考马斯亮蓝染色液：称取0.5 g 考马斯亮蓝R 250 于500ml 的容量瓶中，加入约225 ml 甲醇和50 ml 乙酸；充分搅拌溶解后，加入去离子水定容，室温下保存备用。