常用病理学实验仪器介绍及常规操作方法训练mm3

电子显微镜主要分为两种类型：
透射电子显微镜 观察样品内部超微结构
扫描电子显微镜 揭示样品表面形貌
透射电子显微镜
透射式电子显微镜简称透射电镜。利用磁 透镜对穿过样品的电子束进行放大，这种电子 束带有样品中的超微结构信息，可以在荧光屏 上显示超微结构的电子放大图像。它是高性能 的大型精密电子光学仪器。
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电子显微镜 及超薄切片技术简介
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电子显微镜技术
电镜精密仪器
样品制备技术
电子显微镜技术
电镜精密仪器
样品制备技术
电子显微镜 ：是用电子束成像的显微镜， 电子显微镜是一种高精密度的电子光学仪器， 它具有较高分辨率本领和放大倍数，是观察和 研究物质微观结构的重要工具。
发明背景： 是在发现电子束具有波动性质及利用磁 场改变电子束行径，在上述理论的指导下 发明出的。
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扫描电镜特点 景深长，视野广、图像富有立体感
用于观察组织细胞的表面和断面的形貌 ●如细菌、血细胞、培养细胞的整体形态、大 小、表面突起和细胞间的相互关系 ●消化道、血管等空腔组织的表面结构
●骨等硬组织形貌以及生物材料的形状结构等
扫描电镜(SEM)
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扫描电镜下的红细胞
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疟疾破坏的两个红细胞
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日常维护及注意事项
4.勿用棉团、干布块或干镜头纸擦试镜头表面， 否则会刮伤镜头表面，严重损坏镜头，也不要用 水擦试镜头，残留的水迹可能滋生霉菌，严重损 坏显微镜。 5.仪器工作的间歇期间，用防尘罩将仪器罩住。 6.微镜尽可能不移动，若需移动应轻拿轻放，避 免碰撞。 7.不允许随意拆卸仪器，特别是中间光学 系统或重要的机械部件，以免降低仪器的 使用性能。
样品制备
透射电镜样品制备的常用方法：
超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备 负染色技术（Negative staining） 染色背景，衬托出样品的精细结构 冰冻蚀刻技术（Freeze etching） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗 粒和膜表面结构。 电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。
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二、光学显微镜的维护保养
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日常维护及注意事项
1.所有镜头表面必须保持清洁，落在镜头表面的 灰尘，可用吸耳球吹去，也可用软毛刷轻轻的掸 去掉。 2.当镜头表面沾有油污或指纹时，可用脱脂棉蘸 少许无水乙醇和乙醚的混合液（3:7）轻轻擦拭。 3.不能用有机溶液清擦其它部件表面，特别是塑 料零件，可用软布蘸少量中性洗涤剂清擦。

样品制备
扫描电镜样品制备：比透射电镜样品制备简单。 除保存样品表面形貌结构外，只要求样品干 燥并能导电，而不需包埋和切片。

表面镀金（喷镀）技术 组织导电技术 冷冻断裂技术 离子蚀刻技术 临界点干燥技术 冷冻干燥技术 铸型观察技术（复型）
S E M 常 规 样 品 制 备 程 序
公元前388年的《墨经》记载了能放大物体的凹 面镜 1590年荷兰人詹森发明显微镜 1695年 荷兰人列文虎克《安东·列文虎克所发 现的自然界的秘密》
1931年德国物理学家卢斯卡和诺尔发明了电子 显微镜
1982年，IBM公司苏黎世实验室的两位科学家 宾尼格和罗勒发明了扫描隧道显微镜 （SEM）
扫描隧道显微 镜拍下的DNA
“扫描隧道显微镜” 下拍摄的“血细胞”
扫描出的纳米级图像
宾尼格 罗勒 卢斯卡
光学显微镜的使用和保养 电子显微镜及超薄切片技术简介 倒置显微镜的使用和保养 荧光显微镜的使用 病理实验室其它仪器
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光学显微镜的使用和保养
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一、光学显微镜的结构和使用
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基本结构：
1. 照明灯 2. 聚光器 3. 载物台和切片夹 4. 推进器 5. 物镜 6. 粗细螺旋 7. 目镜 8. 照相机等接口
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透射电子显微镜的主要特点
分辨本领高
• 人眼：0.1mm
• 光镜：0.2μm
• 电镜可达2A0 （1μm=1000A0）
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透射电子显微镜的主要特点
分辨本领高
放大倍率高
变换范围大，一般从几百倍到数十万倍
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透射电子显微镜的主要特点
分辨本领高
放大倍率高 使用范围广
可用超薄切片和冷冻复型技术制样，直 接观察生物组织细胞的形貌结构。
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透射电镜操作
二、样品安装 1、将装有铜网的样品杆插入样品室，打 开预抽开关进行样品隔离室预抽，约2～ 3分钟后绿灯亮，然后顺时针转→推→转 样品杆，最后缓慢送入观察位置。 2、取出样品前，先关闭灯丝电流，然后 向外抽→转→抽→转样品杆，关闭预抽 开关，待放气后向外抽离镜筒。

表面镀金（喷镀）技术 组织导电技术 冷冻断裂技术 离子蚀刻技术 临界点干燥技术 冷冻干燥技术 铸型观察技术（复型）
样品制备
取材注意：
1、充分暴露并保护好观察面
2、仔细清洗观察面
样品制备
取材
取材的基本要求和TEM样品制备相同 样品可大一些（8～10mm2，高度可达5mm） 扫描观察的部位常常是标本的表面 如气管表面、胃、肠粘膜表面等 要把观察的结构暴露出来
对易卷曲的样品可固定在滤纸上 以充分暴露待观察的组织表面
思考题：
简述透射电镜超薄切片与扫描电 镜样品制备的一般程序，并说出两种 取材的基本要求。
电镜切片机
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电镜标本
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电镜标本
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透射电镜操作
一、开机 1、接通两个空气开关。 2、闭合电镜总电压柜开关，此时冷却 循环水系统工作，设置水温为20℃。 3、打开电镜主机电源和控制电脑，真 空系统自动运行，约30分钟后真空度达 到工作需要，仪器处于待用状态。
样品制备
取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修 块→切片→染色
样品制备
取材操作原则： 快,小, 冷,准,稳,轻(防损伤) 快：动作迅速,快取,投入固定液
小：样品体积小,动物1mm3,植物宽1mm， 长3～4mm
冷：0～4℃ 准：取的部位准，有代表性、目的性
轻：操作轻巧，避免拉、锯、压
样品制备
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在荧光屏上成像
观察面积小，局限
透射电镜(TEM)
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扫描式电子显微镜
扫描式电子显微镜的特点为电子束在样品表 面上动态地扫描，以一定速度一点一点地、成行 成帧地扫完待检标本的表面面积，在此范围内样 品也一点一点地发出带有形态结构和化学组分信 息的二次电子。这些电子被送到检测器，最后在 屏幕上形成该范围内的形态画面，在生物学、医 学领域内扫描电镜主要用来观察组织、细胞的表 面超微结构。
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光镜与电镜的区别
光镜（LM） 照明 透镜 分辨率 放大倍率 景深 成像原理 成像方式 图像颜色
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透射电镜 (TEM) 电子束 电磁透镜 0.2nm 80-100万倍
扫描电镜 (SEM) 电子束 电磁透镜 1-10nm 20-40万倍
可见光 玻璃透镜 0.5μm 40-1000倍
浅 中等 深 光线吸收为主 电子散射作用 二次电子信息 直接成像 彩色 空气 较简便 荧光屏成像 黑白 高真空 复杂 显像管间接成 像 黑白 高真空 较复杂
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使用及注意事项
1.显微镜应放置身体左前方。 2.调光（低倍镜）。 3.注意切勿将切片放反，以免压碎玻片。 低倍镜下观察切片，找到要观察的结构。如需进 一步在高倍镜下观察，将需要放大的结构放到视 野中央，转换高倍镜，转动微调即可。 4.目镜或物镜上有灰尘，需要用擦镜纸擦。 5.观察完毕，需放平镜台，将物镜转成八字形。
公元前388年的《墨经》记载了能放大物体的凹 面镜 1590年荷兰人詹森发明显微镜
公元前388年的《墨经》记载了能放大物体的凹 面镜 1590年荷兰人詹森发明显微镜 1695年 荷兰人列文虎克《安东·列文虎克所发 现的自然界的秘密》
公元前388年的《墨经》记载了能放大物体的凹 面镜 1590年荷兰人詹森发明显微镜 1695年 荷兰人列文虎克《安东·列文虎克所发 现的自然界的秘密》 1931年德国物理学家卢斯卡和诺尔发明了电子 显微镜
擦拭方法
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警
示 !
塑料表面勿用酒精乙醚混合液 镜片表面禁用干镜头纸擦拭 物镜不可随意拆卸且防震防摔
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显微镜的安放环境 干净、干燥、防震 避免阳光直射 室内最好无水池 二楼以上房间 空调和去湿机（潮湿地区）
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理想的工作室
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建
议
显微镜要经常使用
长期不用应将主要光学部件放进防潮缸 潮湿地区的显微镜应安放防霉片
电镜三维重构技术与 X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析
技术相结合，是当前结构生物学 ( 主要研究生物大分子空间结 构及其相互关系）的主要实验手段。
样品制备
另外还有：
冷冻超薄切片技术 冷冻置换和低温包埋技术 金属投影技术 表面复型技术 免疫电镜技术 电镜细胞化学技术 TEM，SEM共有 电镜放射自显影技术
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清洁用工具
清洁液
放大镜
吹气球
镜头纸
软木棍
棉花棒
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清洁液 酒精乙醚混合液: 无水酒精 ( 3 ) : 无水乙醚 ( 7 )
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擦拭方向和部位
擦拭方向 擦拭部位
目镜表面 物镜表面 聚光镜表面 底座光源出口 目镜筒内侧
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物镜顶镜污染判断方法
将目镜倒置作为放 大镜， 按图示方法检查物镜顶镜 11
取 材 ↓ 清 洗 ↓ 固 定 ↓ 脱 水 ↓ 干 燥 ↓ 镀 膜 ↓
SEM观察
充分暴露并保护好观察面 （10mm2×5mm） 用生理盐水仔细漂洗观察面
2%戊二醛和1%锇酸固定 丙酮脱水，醋酸异戊酯置换
临界点干燥
离子溅射镀膜或真空镀膜
样品制备
扫描电镜样品制备：比透射电镜样品制备简单。 除保存样品表面形貌结构外，只要求样品干 燥并能导电，而不需包埋和切片。
样品环境 样品制作
思考题：
1.试述光镜与透射电镜、扫描电镜的区别。
2.如何根据自己的实验目的选择不同的显微 镜进行观察？
电子显微镜技术
电镜精密仪器
样品制备技术
样品制备
透射电镜样品制备的常用方法：
超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备
样品厚度在10～100nm，以增加电子投射 能力，上下结构不重叠，减少色差，减少样品对 电子的吸收。切片厚度在500～700Å。 超薄切片制备的一般程序： 取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→ 修块→切片→染色
源自文库
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用电磁场作透镜
• 电磁影响电子的运动轨迹 • 通过改变电流强度来调查电镜 的高宽，焦距
透射电子显微镜的主要特点
分辨本领高 放大倍率高
使用范围广
用电子束为光源 用电磁场作透镜
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在荧光屏上成像
透射电子显微镜的主要特点
分辨本领高 放大倍率高
使用范围广
用电子束为光源 用电磁场作透镜
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透射电子显微镜的主要特点
分辨本领高
放大倍率高
使用范围广 用电子束为光源
样品要求很薄，一般500A（0.05μm）即石蜡切片5μm百分 之一 灯丝在无氧条件下加热，电镜镜筒必须处于高真空，只能观 察固定脱水的细胞
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透射电子显微镜的主要特点
分辨本领高 放大倍率高 使用范围广 用电子束为光源
取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修 块→切片→染色
常用的固定方法：
化学方法：锇酸（OsO4), 戊二醛 （C5H8O2),甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、 重铬酸钾、丙烯醛
物理方法：冷冻，干燥，高温
样品制备
取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修 块→切片→染色
脱水的原则：
逐级梯度脱水(80%及以前4℃) 30％→50％ →70％→80％→90％→95％(每次 5~15min)→100％(2~3次，每次15min)→100 ％环氧丙烷(乙醇脱水时必须的一步骤,15min)
病理学研究进展与实验技术
主讲：苗宇船
病理技术在医学科研中的应用
常用病理学实验仪器介绍 及常规操作方法
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显微镜的发明简史
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公元前388年的《墨经》记载了能放大物体的凹 面镜
公元前388年的《墨经》记载了能放大物体的凹 面镜
《墨经》原文：鉴，中之内，鉴者近中，则所鉴大，景亦 大；远中，则所鉴小，景亦小。而必正，起于中，缘正而长 其直也。中之外，鉴者近中，则所鉴大，景亦大；远中，则 所鉴小，景亦小。而必易，合于中，而长其直也。 译文：鉴，在焦点内，光体远焦点，那么所照光线多， 物像也大；近焦点，那么所照光线少，物像也小，而必定为 正方体。光体起于焦点，则平行正轴的光线反射向镜后引长， 当成极长的共扼点，而像远离镜后。在弧心外，光体近弧心， 那么所照光线多，物像也大。远弧心，那么所照光线少，物 像也小。然像为物的倒形。光体聚于弧心，则平行正轴的光 线反射，当成极长的共轭点，而像与光体相等而倒置。