常用化学诱变剂的种类及作用机制
第五章 工业微生物育种诱变剂讲解
三、非电离辐射——紫外线
紫外线是电磁波谱中波长从0.01~0.40微米辐射 的总称，不能引起人们的视觉。电磁谱中波长0.01~ 0.04微米辐射，既可见光紫端到X射线间的辐射。
绝对剂量单位：erg/mm2 相对剂量单位：用照射时间或杀菌率表示。一般认为杀 菌率在90%~99.9%时，诱变效果较好。
移动式紫外灯
15W紫外灯
不同微生物所需杀菌时间
15W功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下 照射微生物，要使杀菌率达到90％～99.9％的效果：
芽孢菌约需10 min； 照射短小芽孢杆菌的营养体来获得缺陷型需要1～3 min； 一般微生物营养体照射3～5min； 无芽孢菌和革兰氏阳性菌只需0.5～2 min。
在实际诱变工作中要采取某些措施避免暗修复，如 加入某些物质，提高突变频率。
（二）紫外线诱变
1. 紫外线的有效光谱
最有效波长为253.7 nm（2537Å），即260 nm的紫外 线。
30W紫外灯光谱分布范围广，诱变效率差，15W紫外 灯80%波长几种在2537Å，诱变效果比30W的好。
2. 紫外线的辐射剂量
第五章 工业微生物育种诱变剂
诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远 远超过自发突变率的物理因子或化学物质。
（1）物理诱变剂，例如，电离辐射、紫外线、电 磁波等
（2）化学诱变剂，如药品、农药、食品添加剂、 调味品、化妆品、洗涤剂、塑料、着色剂、 化肥、化纤等。
（3）生物诱变剂，如真菌的代谢产物、病毒、寄 生虫等。
微生物育种复习题答案
微生物育种学复习题题型包括填空、选择、名词解释、简答题、问答题名词解释转换:嘌呤与嘌呤之间,嘧啶与嘧啶之间发生互换称为转换置换：在DNA链上的碱基序列中一个碱基被另一个碱基代替的现象称为置换颠换：一个嘌呤替换另一个嘧啶或一个嘧啶替换另一个嘌呤的现象称为颠换移码突变：碱基序列中有一个或几个碱基增加或减少而产生的变异;转导：由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程;它是细菌之间传递遗传物质的方式之一;其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中;转染：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程;常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染永久转染两大类;端粒：是染色体末端的一个区域,该区域含有DNA重复序列,当体细胞衰老时,重复序列的数量将逐渐减少;异核体：两株基因型不同的菌株菌丝体在培养过程中紧密接触,接触部分细胞壁溶解、联结、融合、细胞质交流,在共同的细胞质里存在着两个细胞核;准性生殖：两个体细胞的核融合,及同源染色体的交换,直至基因重组,完成了和有性繁殖相似的繁殖过程;原生质体：指在人为条件下,用溶菌酶除尽原有细胞壁或用青霉素抑制新生细胞壁合成后,所得到的仅有一层细胞膜包裹的圆球状渗透敏感细胞;富集：某些物质通过水、大气和生物作用而在土壤或生物体内显著积累的作用;基本培养基：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基,含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基;选择培养基及各种类培养基概念：根据微生物的特殊营养需求或其对某些物理、化学因素的抗性而设计的培养基,用来将某种或某类微生物群体中分离出来,具有使混合菌样中劣势菌变为优势菌的功能,广泛用于菌种筛选等领域;完全培养基:凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基;补充培养基:凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基;富集培养：是在目的微生物含量较少时,根据微生物的生理特性设计一种选择性培养基,创造有利的生长条件,使目的微生物在最适环境下迅速生长繁殖,数量增加,由自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种以利分离到所需要的菌株;营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养氨基酸、维生素、核酸等的能力,只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长;光修复又称光复活作用：细菌经波长220~300nm的紫外线照射后,接着经波长310~460nm的可见光照射,与不经可见光照射的对照相比,其存活率大幅度提高,突变率相应下降,这种现象称光复活;同工酶:催化同一个反应,但其分子结构不同,即同工酶;酶合成的调节：通过调节酶的合成量进而调节代谢速度的调节机制,这是一种在基因水平上的代谢调节;代谢控制育种：通过定向选育某种特定的突变型,改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性,以达到大量积累有益产物的目的;末端产物阻遏：由某代谢途径末端产物过量累积而引起的阻遏;组成型突变株：操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵,菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型;原生质体再生育种：微生物制备原生质体后直接再生,从再生的菌落中分离筛选变异菌株,最终得到优良性状提高的正变菌株;基因工程中标记用抗生素: 四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素各种反馈抑制的概念：1、P162直线式代谢途径中的反馈抑制：终产物合成过多时可抑制途径中第一个酶的活性,最终导致终产物合成停止;2、优先合成：分支途径中一个终产物优先被合成,浓度过量后,抑制自身合成途径,使代谢转向合成另一个终产物;3、协同反馈抑制多价反馈抑制、协作反馈抑制：分支途径中两个或两个以上的终产物单独存在时不能抑制共同途径中第一个酶,只有几个终产物同时过量存在时,才能抑制此酶;4、合作反馈抑制增效反馈抑制：分支途径中末端产物单独存在时仍有微弱的抑制作用,当几个末端产物单独存在时抑制作用增强;5、累积反馈抑制：分支途径中每一末端产物单独存在时,只是部分地抑制共同途径中的第一个酶;各个终产物的抑制作用互不影响,只有同时过量存在时,才使酶活力完全受到抑制,并且抑制的总百分数等于各单独抑制的百分数的和;6、同工酶：一个共同途径的起始反应受两个或两个以上的酶所催化;7、顺序反馈抑制：分支途径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶,使分支点产物积累;结果分支点产酶又反馈抑制了共同途径中的第一个酶,最后使整个代谢途径停止;分支代谢途径中的反馈抑制各种诱变剂种类及基本原理：1、物理诱变剂：例如：电离辐射、电磁波、紫外线等; 原理：通常使用物理辐射中的各种射线,主要是由高能辐射导致生物系统损伤,继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应过程;电离辐射主要导致基因突变和染色体的畸变;非电离辐射主要导致形成嘧啶二聚体;2、化学诱变剂：如药品、农药、食品添加剂、调味品、化妆品、洗涤剂、塑料、着色剂、化肥、化纤等原理：对DNA其作用,改变其结构并引起遗传变异;对基因的某部位发生作用;3、生物诱变剂：如真菌的代谢产物、病毒、寄生虫等;原理:生物体内还有一些内源诱变剂,内源诱变剂是在人体健康异常的情况下产生的,如遗传因素、内分泌紊乱;放线菌杂交方法：一混合培养法二玻璃纸法三平板杂交法突变表型的种类：一形态突变型：菌落形态,细胞形态,孢子数量、颜色;二生化突变型：营养缺陷型、糖类分解发酵突变株、色素形成突变株、有益代谢产物生产能力突变株;三条件致死突变型：温敏突变型热敏感和冷敏感;四致死突变型：显性致死和隐性致死;五抗性突变型：抗药突变、抗噬菌体突变、抗高温突变、抗辐射突变;杂交育种的遗传标记：1、营养缺陷型标记：可选单缺、双缺或多缺型,通常用双缺陷型标记；2、抗性标记：抗逆性耐高温、高盐和高PH等和抗药性；3、温度敏感性标记：许可温度下生长,非许可温度下不生长；4、其他性状标记：孢子颜色、菌落形态结构、色素等;制备原主质体的各种酶：简答题1.工业微生物菌株应具备的基本要求有哪些写出6点以上即可a.在遗传上必须是稳定的;b.易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体;c.必须是纯种,不应带有其他杂菌及噬菌体;d.种子的生长必须旺盛、迅速;e.产生所需要的产物时间短;f.比较容易分离提纯;g.有自身保护机制,抵抗杂菌污染能力强;h.能保持较长的良好经济性能;2.原核微生物染色体结构特点有哪些a.遗传信息的连续性,共价、闭合、环状b.功能相关的结构基因组成操纵子c.结构基因单拷贝及rRNA多拷贝d.基因的重复序列少而短3.什么是表型延迟导致表型延迟的原因是什么表型延迟：是指微生物通过自发突变或人工诱变而产生新的基因型个体所表现出来的遗传特性不能在当代出现,其表型的出现必须经过2代以上的复制;导致表型延迟的原因：a.与诱变剂性质和细胞壁结构组成有关,有些诱变剂渗入细胞的速度相当慢;b.若突变发生在多核细胞中的某一个核,该细胞就成为杂核细胞了;如果该核突变的基因是唯一控制突变表型的基因,那么突变是隐性的,只有几代繁殖分裂得到纯的核突变细胞,才能出现由该基因控制的突变表型;C.原有基因产物在子细胞中的浓度随着繁殖逐步稀释到最低限度后,突变表型才显现;4.举例简述显色圈法筛选微生物菌种的原理和方法;直接用显色剂或指示剂原理：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌,可在底物平板中加入指示剂或显色剂,使所需微生物能被快速鉴别出来;举例：P675.简述透明圈法筛选微生物菌种的原理,并举例;原理：在平板培养基中加入溶解性较差的底物,使培养基浑浊;能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈,圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力;该法在分离水解酶产生菌时采用较多,如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶6.试述筛选营养缺陷型菌株的步骤以及它们的微生物育种中的应用;筛选步骤：a.营养缺陷型的诱发b．淘汰野生型菌株c.营养缺陷型的检出d．营养缺陷型的鉴定应用：a.工业育种：协助解除代谢反馈调控机制,从而达到大量积累产物的目的,如氨基酸的发酵;b.遗传标记：菌种杂交、重组育种时作为遗传标记;7.简述选育营养缺陷型突变株可改变细胞膜透性的类型以及能够提高发酵产物产量的机理;类型：1、生物素缺陷型的突变株:w生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰COA 羧化酶的辅酶,参与脂肪酸的合成,进而影响磷脂的合成,最终改变细胞膜的结构;2、油酸缺陷型的突变株:由于油酸缺陷型突变株切断了油酸的后期合成,丧失了自身合成油酸的能力,必须由外界供给油酸才能生长,故油酸含量的多少,直接影响到磷脂合成量的多少盒细胞膜的通透性;3、甘油缺陷型的突变株：甘油缺陷型的遗传障碍是丧失a-磷酸甘油脱氢酶,所以不能合成a-磷酸甘油和磷酸,必须由外界供给甘油才能生长;机理：8.反馈阻遏和反馈抑制的区别有哪些反馈阻遏是对酶合成的阻遏,是基因转录水平上的代谢调节,效果不及反馈抑制那样迅速;反馈抑制是通过调节变构酶的活力得以实现,因为不涉及蛋白质的而合成过程,调节的效果比较直接而快速;9.微生物原生质体育种主要包括哪4种方法,并对各方法做简要解释;a.微生物原生质体再生育种是微生物制备原生质体后直接再生,从再生的菌落中分离筛选变异菌株,最终得到优良性状提高的正变菌株;b.微生物原生质体诱变育种是以微生物原生质体为育种材料,采用物理或化学诱变剂处理,然后分离到再生培养基中再生,并从再生菌落中筛选高产突变菌株;c.微生物原生质体转化育种整条染色体DNA或片段DNA转化原生质体以及质粒DNA转化原生质体的技术d.微生物原生质体融合育种遗传性状不同的两个亲株原生质体融合10.请解释微生物原生质体再生育种高正变率的原因;a.原生质体本身较为敏感,制备和再生过程中的各种化合物及环境中的物理因子对染色体或质粒DNA都有一定诱变效应;b.原生质体再生本质上是细胞壁重建和分裂能力恢复的过程,再生是细胞壁可能在组成与结构上都发生变化,甚至于产生可遗传的利于细胞代谢和产物外泌的变异;c.常规诱变育种选用材料多为孢子,这些休眠体对诱变剂较为迟钝,获得的大部分是负变菌株;而制备原生质体的出发材料一般为对数生长期细胞,活力较强,对环境和诱变剂较为敏感,破壁与再生过程中又淘汰了大量弱势菌株,能再生的菌株不论初级代谢与次级代谢过程均较活跃,故高产优质正变菌株比例大；d.原生质体再生材料无需经过遗传标记,减少了对菌株的损失和优良性状的影响;11.请写出原生质体融合育种的步骤;a.出发亲本菌株的筛选及单倍体分离b.原生质体融合常用培养基与溶液c.原生质体制备d.原生质体再生e.原生质体融合f.融合重组体鉴定与遗传分析12.简述基因工程的原理和基本步骤;原理：是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来,在离体条件下进行“切割”,获得代表某一性状的目的基因,把该目的基因与作为载体的DNA分子连接起来,然后导入某一受体细胞中,让外来的目的基因在受体细胞中进行正常的复制和表达,从而获得目的产物;步骤：1、目的基因的获得DNA片段的获得 2、载体的选择与准备 3、重组体DNADNA片段和载体的连接 4、外源DNA片段引入受体细胞——基因克隆和基因文库 5、目的基因的表达和重组体的筛选13.简述菌种退化的原因及防止措施;原因：1、基因突变基因突变导致菌种退化、质粒脱落导致菌种退化2、连续移代3、培养和保藏条件的影响防止措施：1、尽量减少传代2、菌种经常纯化3、创造良好的培养条件4、用单核细胞移植传代5、采用有效的菌种保藏法问答题1.请叙述一下微生物的修复系统包括哪些,它们的存在对微生物有何意义生物修复系统包括光修复和暗修复复制前修复和复制后修复1、光修复2、切补修复3、重组修复4、SOS修复系统5、DNA聚合酶的校正作用意义：繁衍微生物的后代,保证遗传的稳定性,修补DNA分子因突变造成的缺陷和损伤;2.紫外线对枯草芽孢杆菌诱变育种的基本原理、步骤和注意事项基本原理：紫外线是一种罪常用的物理诱变因素,它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体,阻碍双链的分开,复制和碱基的正常配对,从而引起突变;步骤：1、菌悬液的制备 2、平板制作 3、紫外线处理 4、稀释 5、涂平板 6、培养 7、计数 8、观察诱变效应注意事项：1、紫外线诱变时,一定要在红光下进行,在暗环境下培养,避免光修复;2、紫外线诱变时,要打开皿盖,紫外线穿透力差;3.阐述紫外线照射引起微生物突变的原理以及诱变的操作步骤和技术要点紫外线的诱变原理：紫外线会引起DNA与蛋白质的交联,胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用,DNA链的断裂,嘧啶二聚体的形成单链上相邻两个胸腺嘧啶之间或双链相对应的两个胸腺嘧啶之间操作步骤：P38技术要点：4.营养缺陷型检出有哪几种常用方法并阐述各自的原理如何P124结合书本点植对照法：影印法：将稀释后的待测样品涂布到完全培养基上,适宜条件培养,等长出菌落之后用影印法将菌落转印到基本培养基上,适宜条件培养,等菌落长出来之后,对比原来的培养基,原来有菌落而在基本培养基上没有长出来的菌落是营养缺陷型;夹层法：先在培养皿底部倒入一层基本培养基,凝固后,倒入含有菌体细胞的基本培养基,待凝固后,继续加第三层基本培养基;培养后平板上首先出现的菌落,为野生型菌落;此时在平皿底部做好颜色标记;接着加上一层完全培养基,经培养,如果在基本培养基上不长而在完全培养基上生长的小型菌落,可能是营养缺陷型;限量补充培养法：5.在工业微生物菌种使用中,菌种发生退化的原因是什么如何防止菌种的退化以及对菌种进行复壮;退化的原因：一基因突变 1、基因突变导致菌种退化 1表型迟缓现象 2双核或多核脱离现象3非正倍体或部分双倍体分离2、质粒脱落导致菌种退化二连续移代菌种移解代数越多,发生突变的概率就越高三培养和保藏条件的影响不良的培养条件,如培养基组成、PH值、通气等和保藏条件如营养、培养基含水量、温度、氧气等,不仅会诱导低产基因型菌株的出现,而且会造成低产基因和高产基因细胞的数量比发生变化菌种退化的防治：1、尽量减少传代2、菌种经常纯化 1注重菌落的纯化 2单细胞或单孢子的纯化3、创造良好的培养条件4、用单细胞移植传代对于霉菌和放线菌,由于菌丝可能是多核的,所以尽可能用单核的孢子移接,如采用棉花团沾取孢子接种5、采用有效的菌种保藏方法 1良好的保藏培养基 2良好的保藏的温度条件复壮方法：1、纯种分离 1菌落纯是只要求达到菌落纯化的水平,通过稀释平板法、划线法、表面涂血法等常规操作法,该方法较为粗放,适用于菌退化不太严重的情况2细胞纯采用单细胞或单孢子分离法,也可以二者结合,先用前一种方法获得较纯的菌种再采用单细胞或单孢子分离法进一步纯化2、淘汰法通过物理、化学的方法处理菌种或孢子,使大部分死亡80%以上,存活的菌多为生长健壮者,可从中选出优良菌种来3、宿主体内复壮法对于寄生型微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒等,由于长期使用,其毒力会下降,导致杀毒效率降低的衰退现象;这时可以用菌种却感染青菜虫幼虫等,然后从致死的虫体上重新分离,经过几次重复感染与分离,就可以逐步恢复和提高毒力6.列举5种以上常用的工业微生物菌种保藏方法,并简要说明各自的优缺点保藏方法：斜面保藏、石蜡保藏、干燥保藏沙土管保藏、滤纸条保藏、无水硅胶保藏法、麸皮保藏法、冷冻干燥保藏法、真空干燥法、液氮超低温保藏法、液相保藏法优缺点：优点缺点斜面保藏操作简单,使用方便,特别适合于非长期保藏的菌种以及不能采用低温干燥方法保藏的菌种容易变异,因为的物理、化学特性不是严格恒定的,屡次传代会使微生物的改变,而影响微生物的；污染杂菌的机会亦较石蜡保藏制作简单,不需特殊设备,且不需经常移种,效果好保存时必须直立放置,所占位置较,同时也不便携带;从液体石蜡下面取培养物移种后,接种环在火焰上烧灼时,培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅,应特别注意滤纸条保藏较液氮、冷冻干燥法简便,不需要特殊设备沙土管保藏工业生产中应用最广,效果亦好;营养细胞效果不佳液氮超低温保藏法除适宜于一般微生物的保藏外,对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、及动物细胞均可长期保藏,而且性状不变异需要特殊设备真空干燥法设备相对简单,操作方便。
第四章诱变剂
1Gy=100rad 吸收剂量率：是指单位时间内的吸收剂量。 单位：Gy/h Gy/min Gy/s rad/h rad/min rad/s
3、电离辐射的照射方法
⑴ 直接对平皿上生长的菌落 进行照射。 ⑵ 用打孔器（6-10mm）将 菌落连同基质一同取出放于无 菌平皿内照射。 ⑶ 制成菌悬液，取1-2ml 置于试管内并浸入冰水中 进行短时间照射。
6. 航天育种： 利用太空微重力、高能粒子、高真空、 缺氧和交变磁场等综合物理诱变因子进 行诱变和选择育种研究。
第二节 化学诱变剂
化学诱变剂：凡是能改变DNA结构，并引起生物遗传变异 的化学物质。 种类：很多，在育种中常用的诱变剂包括四大类：碱基类似 物、烷化剂、移码诱变剂、其它。
特点： 1.作用机制：都是与DNA起化学反应，诱变效应与其理化性 质有关。 2.作用具专一性。 3.诱变剂量取决于浓度和处理时间。 4.绝大多数化学诱变剂都具有毒性，其中90％以上是致癌物 质或极毒物质。
波长
效果
0.06-136nm 产生正离子
0.006-1.4nm 产生正离子
撞出质子
136-390nm 使内层电子级能提高
一、物理诱变剂的生物学效应
物理诱变剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射引起生 物系统损伤，继而发生遗传变异的一系列复杂的连锁反应 过程。 作用过程可分为物理、物理-化学、化学、生物学等几个阶 段。
饥饿培养8-10h
挑单菌落 筛选
平板涂布培养 使之诱变
加入5-BrU，混匀 (终浓度：25-40ug/ml)
2.2 与辐射线复合处理
二、烷化剂
化学诱变
化学诱变•能使突变率提高到自发突变水平以上的物理、化学和生物因子称为诱变剂•所谓诱发突变并非是用诱变剂产生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率剂量：温度恒定，由浓度和处理时间决定。
化学诱变剂具有毒性。
化学诱变剂的种类：1 碱基类似物(Base analog)例如：5-溴尿嘧啶(5-BU) (胸腺嘧啶结构类似物)和2-氨基嘌呤(腺嘌呤结构类似物)，在DNA复制过程中能够整合进DNA分子，但由于它们比正常碱基产生异构体的频率高，因此出现的碱基错配的机率也高，从而提高突变频率。
称取5-BU，加入无菌生理盐水微热溶解，使浓度为2mg/ml。
将细胞培养至对数期并重悬浮于缓冲液或生理盐水中过夜，使其尽量消耗自身营养物质。
将5-BU加入培养基内，使其终浓度一般为10～20μg/mL，混匀后倒平板，涂布菌液，使其在生长过程中诱变，然后挑单菌落进行测定。
处理孢子悬浮液时，可采用较高浓度的5-BU(100～1000μg/ml)与孢子悬浮液混合后振荡培养，经一定时间后适当稀涂平板。
2 烷化剂甲磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)和亚硝基胍(nitrosoguanidine, NTG)都属于烷基化试剂，其烷基化位点主要在鸟嘌呤的N-7位和腺嘌呤N-3位上。
但这两个碱基的其它位置以及其它碱基的许多位置也能被烷化，烷化后的碱基也像碱基结构类似物一样能引起碱基配对的错误。
亚硝基胍是一种诱变作用特别强的诱变剂，因而有超诱变剂之称，它可以使一个群体中任何一个基因的突变率高达1%，而且能引起多位点突点，主要集中在复制叉附近，随复制叉的移动其作用位置也移动。
此外，硫酸二乙酯(diethyl sulfate,DES)、乙基磺酸乙酯(ethyl ethane sulfonate,EES)以及二乙基亚硝酸胺(diethyl nitrosamine,DEN)等也都是常用的诱变烷化剂。
3 脱氨剂亚硝酸能引起含NH2基的碱基(A.G.C)产生氧化脱氨反应，使氨基变为酮基，从而改变配对性质造成碱基置换突变。
四、基因突变的作用机理
基因突变的作用机理基因突变是由于DNA分子中核苷酸序列的改变，随之基因作用改变，最后导致个体表型的改变。
引起基因突变的理化因素很多，但每种诱变因素的诱变机理各有其特异性。
（一）紫外线诱变机理紫外线的波长范围是136～390nm，其中对诱变有效的范围是200～300nm，而260nm效果最好，它能使原子中的内层电子提高能量，而成为活化分子，由于紫外线带有大约3～5ER的能量（能量很少，穿透力弱不足以引起物质的电离，属非电离射线），它足以引起一个分子中某些化学键发生断裂、交联而产生化学变化，其主要效应是形成胸腺嘧啶二聚体。
DNA中嘧啶对紫外线诱变的敏感性要比嘌呤大10倍左右，常见T—T二聚体以共价键在相邻的二个碱基间联结而成的嘧啶二聚体，是发生在DNA的同一条链上的两个相邻的胸腺嘧啶残基间形成TT聚体，也可形成TC或CC二聚体。
大剂量的紫外线照射，能引起DNA双螺旋的局部变性，可使两条互补链上的两个嘧啶残基互相靠近而形成二聚体，从而引起交联。
当DNA复制时，两链间的交联会阻碍双链的分开与复制，同一条链上相邻胸腺嘧啶之间二聚体的形成，则会阻碍碱基的正常配对，这样，不是导致复制的突然停止，就是导致在新形成的链上诱发一个改变了基因序列。
（二）X射线的诱变机理人体接受的辐射中，X射线能将原子中的电子激发而形成正离子，它属于电离辐射，经X射线处理后的DNA分子，发现有核酸碱基的化学变化，氢键的断裂，单链或双链的断裂，双链之间的交联，不同DNA分子之间的交联，以及DNA和蛋白质之间的交联而诱发突变，同时电离辐射的能量被水分子所吸收，水分子失去电子变成正离子，电子若被另一个水分子捕获，这个水分子就变成水的负分子：H2O+e-→H2O-刚形成而不稳定的离子立刻分解，形成H°和OH°自由基，当这些自由基和细胞中溶解的氧发生反应后，生成过氧基HO°2，这种氧化物质转移到核苷酸双链中去，能引起DNA分子结构形式的改变，形成碱基类似物，导致碱基置换发生突变。
遗传育种学第十四章 化学诱变育种
化学诱变育 种
科学扩展了人类的想象空间， 技术使理想成为现实。
利用化学诱变剂诱发园林植物产生遗 传变异，以选育新品种的技术。
1. 化学诱变育种的特点
操作简便、价格低廉； 专一性强； 提高突变频率、扩大突变谱； 多数为迟发性突变； 诱变后代的稳定过程较短，可缩短育种年限
2. 化学诱变剂的种类
3. 化学诱变剂处理的主要方法
3.1 药剂配制 水溶性； 酒精溶解； PH值的调整:
3.2 试材的预处理 浸种 生长恢复
3.3 处理方法 • 浸种法、涂抹法、滴液法、注入法、 熏蒸法、施入法。 • 处理步骤： 预处理 药液处理 后处理
化学诱变剂量 化学药剂的浓度 × 处理的时间
化学诱变中应注意药品的保存和人畜安全 化学诱变当代也会产生ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ理损伤，注意苗
期保护； 对种子繁殖材料应加强后代选育； 对无性繁殖材料应注意区分损伤和变异。
烷化剂：（EMS、EES、MMS、PPS、PMS、 DES、NEH、NEU、NTG） 核酸碱基类似物：（5-BU、5-BUdR) 丫啶类(嵌入剂）：溴化乙啶( Br ) 无机类化合物:（H2O2、LiCl 、MnCl2 、 CuSO4 、亚硝酸） 简单有机类化合物 异种DNA 生物碱 (秋水仙碱)
工业微生物育种学5
介绍几种烷化剂 及其诱变处理方法
Ⅰ亚硝基胍
亚硝基胍的结构式
亚硝基胍的性质
亚硝基胍是1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍的简称， 简写成NTG、NG或MNNG。
亚硝基胍为黄色结晶状物质，性质稳定，遇光易 分解，放出NO，颜色由黄变绿，诱变效应降低。 NTG不溶于水，须加助溶剂（甲酰胺或丙酮）
碱基类似物诱变的具体机制
正常的碱基存在着同分异构体，碱基类似物也 一样有同分异构现象，它是由电子结构改变引 起的。在嘧啶分子中异构现象以酮式和烯醇式 两种形式存在，在嘌呤分子中异构现象以氨基 和亚氨基两种形式存在。 一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA 四种碱基中出现的频率高。而不同的异构体对 应的互补碱基是不同，由此造成基因的突变。
①取新鲜、年轻的斜面，用pH值一定的磷酸 缓冲液或tris缓冲液洗下细菌做成菌悬液。如 果细菌细胞或丝状菌孢子需进行前培养的，可 用有关培养基代替缓冲液，培养结束后离心洗 净，用同一种缓冲液做成菌悬液，浓度约控制 在106~107个/mL。 这一步的主要目的是使材料处于生长代谢的旺 盛期，有利于诱变。
脱氨基作用
脱氨基作用主要有三种变化： 腺嘌呤（A）变为次黄嘌呤（H）； 胞嘧啶（C）变为尿嘧啶（U）； 鸟嘌呤（G）变为黄嘌呤（X）。
腺嘌呤→次黄嘌呤
A→H时，第一次DNA 复制后次黄嘌呤不与 胸腺嘧啶（T）配对， 而与胞嘧啶配对，第 二次复制后，A：T就 变成了G：C。 脱氨基后碱基转换。
本节主要内容
介绍几种主要的化学诱变剂
二、化学诱变剂的种类
化学诱变剂种类
碱基类似物 烷化剂 脱氨剂 移码诱变剂 羟化剂 金属盐类 其他诱变剂
（一）碱基类似物
化学诱变在育种中的应用
化学诱变在育种上的应用微研二班訾小利602071005024菌株优劣对于微生物药物的工业化生产具有决定性意义，野生菌株往往因为产率低不能直接用于工业生产，而是通过菌种改良，选育出高产的优良菌株。
在育种研究中，近来还发现有些突变株可代谢产生新产物，具有可供作药源新菌株资源的潜在应用前景，使育种技术进一步拓展了新的应用研究发展空间。
化学诱变具有成本低、使用方便、诱变作用专一性强等特点，是一种迅速发展的育种途径。
在实际应用中，化学诱变既有利用某一种化学诱变剂的单一诱变，也有组合利用化学或其他多种诱变剂的的复合诱变，还有化学诱变联合抗生素抗性筛选等。
化学诱变育种与物理诱变相比，很多化学诱变剂产生了高比例的点突变、低比例的染色体畸变，而物理诱变如以射线和x射线为代表的电离辐射，其穿透力较强，易被染色体组吸收，对染色体结构具有很大的破坏性。
化学诱变育种具有以下特点：诱变突变率较高，具有位点特异性；染色体畸变的比例相对较少，很少有致死型发生，对处理材料损伤轻；有迟效作用，即诱变引起的损伤和染色体断裂，有的并不立即断开；存在残留药物的后效作用，在M．代引起的生物损伤大；引起的突变范围广，后代选择需要足够大的群；价格便宜，操作简单，不需要特殊设备。
本文简要综述常用化学诱变剂及其作用机制，以及化学诱变技术在微生物育种领域中的新近应用研究进展。
1.常用的化学诱变剂1.1碱基类似物作为化学诱变剂的碱基类似物主要有嘧啶类似物和嘌呤类似物两大类。
其中，常用的嘧啶类似物有5-溴尿嘧啶（5-BU)、5-氟尿嘧啶（5-FU)、6-氮杂尿嘧啶（6-NU）等；嘌呤类似物有2-氨基嘌呤（AP）、6-巯基嘌呤（6-MP）、8-氮鸟嘌呤（8-NG)等[1]。
1.2 烷化剂烷化剂类化学诱变剂种类较多，如硫芥（氮芥）类、环氧衍生物类、硫酸（磺酸）酯类、重氮烷类等。
其中，亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等较为常用。
1.3移码诱变剂移码诱变剂是指能够引起DNA分子中组成遗传密码的碱基发生移位复制，致使遗传密码发生相应碱基位移重组的一类化学诱变物质。
植物育种化学诱变
二、化学诱变剂的种类
1、烷化剂： 烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、亚硝基烷基化合物、次
乙亚胺和环氧乙烷类、芥子气类 2、碱基类似物：渗入DNA中，引起错配和变异。 胸腺嘧啶T类似物（5-溴尿嘧啶、5-溴去氧尿核
苷）； 腺嘌呤A类似物（2-氨基嘌呤）； 尿嘧啶类似物（马来酰肼）
3、叠氮化物 例如叠氮化钠（NaN3），是一种具有诱变作用的
生长点或芽眼上。
3、注入法
用注射器将药液注入材料内，或先将材料人工刻伤成切口，
再用浸有诱变剂溶液的棉团包裹切口，使药液通过切口进入材料
内部。
4、熏蒸法
在密封的容器内使诱变剂产生蒸汽，对花粉等材料进行熏蒸
处理。
5、施入法
在培养基中加入低浓度诱变剂溶液，通过根部吸收进入植物
体。
四、影响化学诱变效果的因素
M1是一个混杂的群ຫໍສະໝຸດ ，其中有非遗传的生理损伤类 型、非变异类型、显性的变异类型、隐性的变异类型。 即使是显性变异，往往也是嵌合体。
M1是一个不便比较，不便选择的世代，除少数优 良的显性突变进行选择外，一般不淘汰植株。主要任务 是通过自花授粉使突变基因纯化，然后单株采收种子。
2、诱变二代（M2）的选育
化学诱变剂可处理完整植株、幼苗、种子、花粉、 枝条、球茎、鳞茎、块根、块茎、幼胚等，也可应用于 离体培养中的各种组织、器官或细胞。
诱变育种
（二）植物辐射的敏感性差异
诱变处理的材料包括：种子、绿色植物、花 粉、子房、合子和胚细胞、营养器官、离体 培养中的细胞和组织等。 1. 不同的植物辐射敏感性不同 2. 不同品种对辐射敏感性差异很大 3. 同种植物的器官、组织以及发育时间和 生理状况不同，其敏感性也不同 4. 处理前后的环境条件也影响诱变效果
➢ 体细胞变变常会形成嵌合体，不易分离 纯的组织变异。 突变又多是隐性突变， 有利突变性状与不良性状常呈连锁关系， 需要结合有性杂交予以分离。
第二节 物理诱变
物理诱变：用不同种类的射线处理，引起基因突 变或染色体变异。
一、物理诱变剂的种类（表11-1，P186） 紫外线:辐射源是紫外光灯，能量和穿透力低， 能成功地用于处理花粉粒，波长200-390nm。
2. 生理代谢损伤大，容易引起生活力和可 育性下降；
3. 使用所需的设备比较简单，成本较低， 诱变效果较好；
4. 对人体更具有危险性
三、化学诱变处理方法
（一）药剂配制： 1. 化学诱变剂的性质：包括溶解度和毒性； 2.处理浓度：诱变剂的浓度高于种子细胞中的
浓度，浓度也不能过大。 3.处理时间：以使受处理组织完成水解作用以
第四节 诱变育种的方法和程序
一、处理材料的选择
（一）材料的选择 正确地选择诱变处理的亲本材料非常重要， 原则有四点：
1. 首先必须根据育种目标来选择亲本材料； 2. 亲本材料必须是综合性状优良而只具有一、
两个需要改进的缺点；
3. 选用的处理材料应避免单一化； 4. 适当选择单倍体、原生质体和多倍体等 做诱变材料。
能与植物体的遗传物质发生作用，并能改 变其结构，使其后代产生变异的化学物质 称为化学诱变剂。
常用化学诱变剂的种类及作用机制
常用化学诱变剂的种类及作用机制(1)碱基类似物原理：通过异构体互变代替碱基进行复制，造成复制的错误。
(2)烷化剂原理：主要通过烷化基团使DNA分子上的碱基或磷酸部分被烷化，引起碱基结构的改变，导致碱基配对错误而引起突变。
(3)脱氨剂原理：亚硝酸的诱变机制主要是使碱基氧化脱去氨基。
(4)移码诱变剂原理：叩嚏类化合物是一种平面型的三环分子，与喋吟』密嚏碱基对的结构十分相似，因而能够插入DNA双链上两个相邻的碱基对之间，使DNA链拉长，两碱基间距离拉宽，使碱基插入或缺失，在DNA复制时造成点突变，以后的所有碱基都往后或往前移动，导致全体三联体密码转录、翻译错误而引起突变。
(5)羟化剂原理：羟胺只与C发生反应，可将C的氨基变为羟基，并与A 配对，能专一地诱发G：C碱基对到A：T碱基的转换第五章工业微生物代谢调控育种。
1.什么是代谢调控育种？它建立在什么基础上？答：微生物代谢控制育种是指以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使用有用产物选择性地大量合成积累。
建立在诱变育种的基础之上。
2.次级代谢受哪些遗传物质的控制？次级代谢产物有哪些？答：次级代谢除受核内DNA控制，还受核外DNA(质粒)的控制。
产物有抗生素、毒素、激素、色素、生物碱等。
3.反馈阻遏与反馈抑制的含义。
答：反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。
是一种负反馈机制，其中酶促反应的末端产物可抑制在此产物合成过程中起作用的酶。
这种抑制具有协同性、积累性和序贯性。
反馈阻遏：即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的一系列酶的量调节,所引起的阻遏作用。
反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢。
4.乳糖操纵子的组成成分有哪些？答：组成成分：启动基因、操纵基因、结构基因5.乳糖操纵子与色氨酸操纵子的区别？（有乳糖时，乳糖操纵子如何？有色氨酸时，色氨酸操纵子如何？）答：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列o 处，______处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，______被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。
第四章 诱变剂
物理辐射可分为电离辐射（ionizing radiation）、非 电离辐射（nonionizing radiation）。
单位：量子。
种类 x射线 γ射线
快中子 紫外线
性质 产生体
高能电磁波 x光机
高能电磁波 钴、镭
中子
钚-239
光
紫外灯
饥饿培养8-10h
挑单菌落 筛选
平板涂布培养 使之诱变
加入5-BrU，混匀 (终浓度：25-40ug/ml)
2.2 与辐射线复合处理
二、烷化剂
1.定义：生物学上的烷化剂是指在正常的生理条件下， 能将其烷基转移给重要的生物大分子的一类化合物。
最早发现的烷化剂是氮芥子气。
2.烷化剂的种类：根据分子中烷基的数目多寡，可将烷 化剂分为单功能和双功能的烷化剂两大类。
三、脱氨剂（亚硝酸）
1.诱变机制： 亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的 DNA 分子， 氧化碱基中的氨基成酮基，引起转换。还可引起 DNA 双链间的交联。
2.诱变处理方法： ① 试剂配制： ② 处理过程： ③ 终止反应： ④ 后处理：
四、移码诱变剂
1. 诱变机制：与DNA结合引起碱基增加或缺失而造成突 变。主要包括吖啶黄、吖啶橙、原黄素（2 , 8 –二氨基 吖啶）等。
快中子：致死率为50％～85％比较合适，采用剂 量约为15～30k rad。有利于正突变的产生。
X射线、γ射线：杀菌率90％～99.9％为宜。照 射剂量为1万～20万R。
四、近年来发展的新型诱变剂
1.微波：电磁波，分热效应和非热效应。辐射中采用分散 低温干燥法消除微波热效应的影响。
2.红外射线：光谱的波长范围大于可见光小于无线电波的电 磁辐射区域的光波。
常用化学诱变剂的种类及作用机制
常用化学诱变剂的种类及作用机制化学诱变剂是一类可以改变生物体遗传物质DNA序列的化学物质。
它们可以引起单个碱基改变，或者引起整个染色体片段的改变。
因此，化学诱变剂是一种有用的工具，用于研究基因表达、基因功能和癌症发生机制。
本文将介绍常用的化学诱变剂的种类及其作用机制。
1. 碱基类化学诱变剂碱基类化学诱变剂是最常用的化学诱变剂之一。
它们可以与DNA的碱基化学结合并产生突变，例如氮基烷和硝基乙烷。
这些化学物质在体内转化为亲电性化合物，再与DNA碱基上的负电荷结合，从而导致身体细胞的DNA发生突变。
这些突变会影响基因表达和蛋白质结构，导致细胞功能的改变。
2. 烷基化剂烷基化剂可以与DNA中的氨基基团结合，并添加烷基。
烷基可以与氨基结合并形成甲基化DNA，这种甲基化形式可能引起基因表达失调、染色体结构异常等突变事件。
其中，较常用的烷基化剂是甲基磺酰氯、甲基亚硝基脲等。
3. 交联剂交联剂可以使DNA链上的双链结构产生交联或或与蛋白质发生结合，从而导致突变发生。
交联剂在农业和工业上已广泛应用。
常见的交联剂有广泛应用的亚硝基尿素、异氰酸酯等。
4. DNA搒伤剂DNA损伤剂是一类可以直接作用于DNA分子的化学物质，如亚硝基化合物、多环芳香烃等。
它们可以引起DNA的单一或双链断裂，并导致基因突变和细胞死亡。
由于DNA损伤剂可以对DNA产生多种不同的化学反应，因此在生物体中有非常广泛的应用，例如检测DNA修复机制或者DNA分解机制等。
5. 熔剂至氯甲烷、三氧化硫等熔剂是一类可以直接引起DNA序列改变的化学物质。
这些化学物质会引发化学反应，干扰DNA的复制和修复，最终导致DNA的突变和基因变异。
总之，常用的化学诱变剂种类多样，如碱基类化学诱变剂、烷基化剂、交联剂、DNA搒伤剂以及熔剂等。
这些化学诱变剂各有其独特的作用机制，可被广泛应用于基因修复、癌症治疗以及其他生物医学应用领域。
然而，化学诱变剂在使用中需特别注意，其可能会对生物细胞造成不可逆的损伤和影响，因此需要仔细考虑使用使用方法和条件。
8-2化学诱变育种
三、化学诱变的使用方法 1 ．前处理 2 ．药剂处理 1 ）浸渍法： 3 ）注入法： 5 ）施入法： 3 ．后处理 四、 剂量的选择及其影响化学诱变效应的因素 1、化学诱变剂性质对剂量的影响 2、处理浓度 4、处理温度温度 3、处理持续时间 5、其他因素 2 ）涂抹法和滴液法： 4 ）熏蒸法：
本章思考题： 本章思考题： 主要化学诱变剂的种类和诱变原理是什么？
二、化学诱变剂的种类及其机制
1 ．烷化剂类 （目前在化学诱变育种中主要 使用的一类诱变剂。） 烷化剂的诱变机理：这些烷化剂带有一个或 多个活性烷基，它们能置换 DNA 分子的 H 原子（烷化作用），改变基因的分子结构， 导致突变。
1）芥子气类 硫芥： -S-CH2 -CH2Cl ；氮芥： >NCH2 -CH2Cl 2）乙烯亚胺（ -N<CH2 CH2 ）和环氧乙烷类（ CH <O CH2 ） 乙烯亚胺（ EI ）： CH2 － CH2 ； 环氧乙烷（EO）： CH2 － CH2 >O 环氧丙烷：种具有诱变作用 的无机盐，在酸性条件下，特别是在PH=3 时有显著作用。 主要对复制中的DNA发生碱基替换作 用，而染色体畸变的几率甚低。
3）羟胺（ HA ）：作用于 C ，使其氨基变成羟基， 与 A 配对，G-C A-T
4）抗生素（丝裂霉素 C 、链霉素）、重氮丝氨酸等引起染色体 的断裂 抗生素的诱变作用：破坏基因分子结构 造成染色体的断 裂而引起突变。 Perov等用链霉素首先诱导出玉米细胞质雄性不育(CMS)。 Burton和Hanna（1982）以及Jan和Rutger（1988）分 别在珍珠粟和向日葵上使用链霉素和丝裂霉素诱导出CMS。 说明链霉素和丝裂霉素在诱导产生CMS方面具有较好效 果，不同作物间重演性好。
诱变剂
亚硝酸能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成DNA复制紊乱。HNO2还能造成DNA双链间的交联而引 起遗传效应。叠氮化钠(NaN3)是一种呼吸抑制剂，能引起基因突变，可获得较高的突变频率，而且无残毒。
物理诱变
0 1
1等离子体
0 2
2紫外线
0 3
3γ-射线
0 4
4激光
0 5
5微波
0 6
6离子束
谢谢观看
潜在危害
环境诱变剂对人体健康的潜在危害。从接触诱变剂到产生有害后果。有时需要很长时间；如果是作用于生殖 细胞的话，那么要在下一代，甚至几代以后才表现出来。例如，长期遭受日光照射的海员、渔民、牧民，在身体 暴露处发生皮肤癌的几率较大，发病期可以在10～40年以后，平均发病年龄在70岁以上，开始是色素沉着和角质 增生，继之发生癌变。
微波辐射属于一种低能电磁辐射，具有较强生物效应的频率范围在300MHz~300GHz，对生物体具有热效应和 非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升，从而引起生理生化反应；非热效应指在微波作用下，生 物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下，生物体会产生一系列突变效应。因而, 微波也被用于多个领域的诱变育种，如农作物育种、禽兽育种和工业微生物育种，并取得了一定成果。
常压室温等离子体（Atmospheric and Room Temperature Plasma）的简称，能够在大气压下产生温度在 25-40 °C之间的、具有高活性粒子（包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）浓度的等离子 体射流。按照热力学平衡状态，等离子体可分为三种：完全热力学平衡等离子体（也称高温等离子体，其电子温 度（Te）、离子温度（Ti）和中性粒子温度（Tn）完全一致），局部热力学平衡等离子体（也称热等离子体， Te≈Ti≈Tn=3×10~3×10），以及非热力学平衡等离子体（也称冷等离子体，其Te≥Ti，Ti≈Tn）。
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常用化学诱变剂的种类及作用机制
（一）烷化剂
是栽培作物诱发突变的最重要的一类诱变剂。
药剂带有一个或多个活泼的烷基。
通过烷基置换，取代其它分子的氢原子称为烷化作用所以这类物质称烷化剂。
烷化剂分为以下几类：
1.烷基磺酸盐和烷基硫酸盐
代表药剂：甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）
2.亚硝基烷基化合物
代表药剂：亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷（NEU）3.次乙胺和环氧乙烷类
代表药剂：乙烯亚胺（EI）
4.芥子气类
氮芥类、硫芥类
烷化剂的作用机制--烷化作用作用重点是核酸，导致DNA断裂、缺失或修补。
（二）核酸碱基类似物
这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。
代表药剂：
5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR）为胸腺嘧啶（T）的类似物
2-氨基嘌呤（AP）为腺嘌呤（A）的类似物
马来酰肼（MH）为尿嘧啶（U）的异构体
作用机制：作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去，使DNA复制时发生配对错误，从而引起有机体变异。
（三）其它诱变剂
亚硝酸能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成DNA复制紊乱。
HNO2还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应。
叠氮化钠(NaN3)是一种呼吸抑制剂，能引起基因突变，可获得较高的突变频率，而且无残毒。
用秋水仙素诱导多倍体。
秋水仙素是从百合科植物秋水仙的器官和种子中提取出来的一种剧
毒的植物碱。
纯品为无色或淡黄色针状结晶，熔点155℃，有苦味，易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛。
通常用水或酒精作溶媒。
（1）秋水仙素诱导多倍体的原理
秋水仙素与正在分裂的细胞接触后，可抑制微管的聚合过程，不能形成纺锤丝，使染色体无法分向两极，从而产生染色体加倍的核。
适宜浓度的秋水仙素溶液，能阻碍纺锤丝的形成，但对染色体结构无明显影响。
处理的细胞在一定时间内可恢复正常，重新进行分裂。
（2）秋水仙诱导多倍体应注意的问题
①注意诱变材料的选择
选主要经济性状优良的品种；
选染色体组数少的品种因为倍性高的种在进化过程中已经利用了它的多倍性。
选能单性结实的品种因为染色体多倍化后，常会使育性降低。
尽量选多个品种处理因为不同的种、品种、类型遗传基础不同，多倍化后的表现也不同。
②注意处理部位的选择
处理的组织应该是旺盛分裂的组织。
如萌动的种子、正在膨大的芽、根尖、幼苗、嫩枝生长点、花蕾等。
③注意药剂浓度和处理时间的选择
溶液的浓度不宜过高或过低。
过高，会引起伤害，以至致死；过低，又不起作用。
一般采用临界范围内的高浓度、短时间处理。
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通常，草本浓度较低，木本浓度较高。
果树、树木：1-1.5%蔬菜、草本花卉：0.01-0.2%
王鸣等（）在甘蓝、白菜、南瓜、萝卜上试验表明，在0.01-0.2%的范围内，随浓度增高，引变的百分率也显著提高。
处理时间以细胞分裂周期为转换。
④注意被处理植物的生长条件
处理后，用清水冲洗,除去残留药物，并为植株生长提供良好的条件，便于植株恢复生长。
外部条件中最重要的是温度，一般25-30℃。
（3）诱导方法
①浸渍法
可用溶液浸渍幼苗、新梢、插条、接穗、种子及球根类蔬菜、花卉等
材料。
为避免蒸发，宜加盖，避光。
一般发芽种子处理数小时至3d或多至10d左右。
秋水仙碱能阻碍根系的发育，处理后要用清水洗净后再播种。
发芽种子的胚根，处理后往往受到抑制，发根较慢，为利于根的生长，可在药液中添加适当生长素。
处理插条、接穗一般1-2d。
处理后也要用清水洗干净。
处理幼苗时，为避免根系受害，可将盆钵架起来倒置，使茎端生长点浸入秋水仙碱溶液中。
②涂抹法
把秋水仙碱按一定浓度配成乳剂，涂抹在幼苗或枝条的顶端，处理部位要适当遮盖，以减少蒸发和避免雨水冲洗。
③滴液法
对较大植株的顶芽、腋芽处理时可采用此法。
常用的水溶液浓度为0.1%~0.4%，每日滴一至数次，反复处理数日，使溶液透过表皮渗入组织内部。
如溶液在上面停不住时，可将小片脱脂棉包裹幼芽，再滴加溶液，浸湿棉花。
④套罩法
保留新梢的顶芽，除去顶芽下面的几片叶，套上一个防水的胶囊，内盛有含1%秋水仙碱的0.65%的琼脂，经24h即可去掉胶囊。
这种方法的优点是不需加甘油，可避免甘油引起药害。
⑤毛细管法
将植株的顶芽、腋芽用脱脂棉或纱布包裹后，将脱脂棉与纱布的另一端浸在盛有秋水仙碱溶液的小瓶中，小瓶置于植株旁，利用毛细管吸水作用逐渐把芽浸透，此法一般多用于大植株上芽的处理。
此外，还有注射法、喷雾法等。
秋水仙素诱导也与物理辐射等方法结合使用。
如山川邦夫()报道，将好望角苣苔属中的一些种用秋水仙碱处理11d，再用0.05Gy的X射线照射可提高加倍株的出现率。
在单独用秋水仙碱处理时为30%，而兼用X射线照射时可提高到60%，并且在取得的多倍体植株中发现有两株变成八倍体。
他们认为，这是由于秋水仙碱的处理，使多倍体混杂于二倍体性细胞群中，二倍体细胞由于先开始分裂，所以就被X射线淘汰了。
秋水仙素诱导只能产生偶数多倍体，且为同源多倍体。
有性杂交可产生奇数多倍体、异源多倍体。
异源多倍体具有更高的杂合性、育性；二倍体基因渗入，创造遗传多样性，得到杂合多倍性群体。