化学诱变(检测方法HYN)

第七章

本章主要内容

概述

化学毒物致突变的类型

化学诱变作用机制及后果

机体对致突变作用的影响

观察化学物致突变作用的基本方法

第五节观察化学物致突变作用的

基本方法

主要内容

⏹观察项目的选择

- 效应终点类型

- 成套的观察项目

⏹常用的致突变试验

- 细菌回复突变试验(Ames试验)

- 微核试验(MNT)

- 染色体畸变分析(CA)

- SCE …….

⏹致突变试验中的一些问题

- 对照, 体外活化系统, 与致癌的关系, 评价

化学诱变剂的检测

⏹遗传毒理学试验的目的：致突变性的鉴定；预测潜在的致癌物以及各种遗传毒物的监测及评价。

⏹遗传学终点（genetic endpoint) :致突变试验的观察终点(致突

变过程中发生的事件)

观察项目的选择

⏹目前实用的genetic endpoint分类方法：

⏹基因突变

染色体畸变

染色体组畸变

ＤＮＡ原始损伤

诱变试验的选择与配套原则

遗传毒理学评价程序通常为一组包括体内、外遗传毒理学试验。原因有四：

●遗传学终点不一样，没有一个试验可以涵盖所有的遗传学

终点。

●靶细胞：靶细胞有的是体细胞，或生殖细胞，或两者兼而

有之，故在成套观察项目中既要用体细胞检测又要用生殖细胞。

3、直接致突变作用与间接致突变作用

⏹间接致突变作用需要在体内代谢活化后、才具有致突变作用。

⏹体内试验具有完整的活化系统，而体外试验则通过加人模拟代谢系统，如S9来弥补缺乏活化系统的不足。

4. 化学毒物的致突变性强弱不一

⏹有的化学物在某一检测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱的致突变物。

⏹弱致突变物在某些系统中比较容易漏检，即出现假阴性。

每一化学毒物都需要一组试验或成套试验，来评价其遗传毒性。诱变试验的选择与配套原则

◆按遗传学终点配套

◆指示生物选择，多种进化程度

◆体内与体外试验结合

各遗传学终点首选试验

标准：

⏹体内优于体外试验

⏹体内试验哺乳动物优于其他动物

⏹体外试验中哺乳动物，尤以原代细胞（如周围淋巴细胞）优先于细菌；

⏹能作为常规试验加以推广

⏹能反映多个终点

主要内容

⏹观察项目的选择

- 效应终点类型

- 成套的观察项目

⏹常用的致突变试验

- 细菌回复突变试验(Ames试验)

- 微核试验(MNT)

- 染色体畸变分析(CA)

- SCE …….

⏹致突变试验中的一些问题

- 对照, 体外活化系统, 与致癌的关系, 评价

常用的遗传毒理学试验

（经典试验）

⏹鼠伤寒沙门氏菌回变试验(Ames试验)

⏹微核试验MNT

⏹染色体畸变试验CA

⏹姊妹染色单体交换试验（SCE）

⏹果蝇伴性隐性致死试验

⏹显性致死性试验（DLT）

⏹程序外DNA合成试验（UDS）

⏹单细胞凝胶电游试验

常用的致突变毒理学试验

（一）细菌回复突变试验

☐概念: 细菌回复突变试验是利用突变体的测试菌株，观察受试物能否纠正或补偿突变体所携带的突变改变，判断其致突变性

☐常用的菌株

- 鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）

- 大肠杆菌（E. Coli）。

Ames试验

⏹Ames试验利用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型的突变体菌株为指示生物的检测基因突变的体外试验。

原理:人工诱变鼠伤寒沙门氏菌组氨酸操纵子突变，突变的菌株必须依赖外源性组氨酸才能生长，而在无组氨酸的选择性培养基上不能存活，致突变物可使其基因发生回复突变，使它在缺乏组氨酸的培养基上也能生长。

正向突变

野生型TA his+ 营养缺陷型TA his-

回复突变

由于细菌缺乏哺乳动物的药物代谢酶，故Ames试验还需加入哺乳动物微粒体酶（S9），使间接诱变剂被活化。原则上对同一受试物应

同时作+S9和-S9的诱变性检测。

三.测试菌株

Ames等人从鼠伤寒沙门氏菌组氨酸操纵子的一组数百种不同的点突变中，首选出三种点突变，这些突变的自发回复突变率很低，且很易被各种化学致突变物诱导，回变为野生型。

①TA1535：是带碱基置换型突变菌株，决定磷酸核糖ATP合成酶的基因发生突变；

②TA1538：缺失2个bp的移码突变菌株，即组氨酸醇脱氢酶的结构基因发生突变；

③TA1537：是加入一个碱基对的移码突变菌株，决定组氨酸氨基转移酶的基因发生突变。

附加突变

uvrB基因突变，即紫外线抗性基因突变

rfa突变，即深粗糙型基因突变

给菌株带上R因子，即PKM101质粒，具有抗氨苄青霉素的特性，在使细菌耐药的同时，助长了易错DNA 修复系统。

pAQI质粒是抗四环素的质粒，作用与pKM101质粒类似。

附加了这些因子，TA1535 TA100，TA1538 TA98。后来又加上TA97和TA102，TA102具有原先菌所没有的赭石突变，可以检出氧化性诱变物及交联剂。

1983年提出使用TA98、TA97、TA100和TA102作为新的标准测试菌株。

Ames试验常用测试菌株

菌株突变检出突变切除修复R因子脂多糖突变

TA1535 G46 置换∆uvrB 无rfa

TA100 G46 置换十移码∆uvrB pkM101 rfa

TA1537 C3076 移码∆uvrB 无rfa

TA97 De610 移码∆uvrB pKM101 rfa

TA1538 D3052 移码∆uvrB 无rfa

TA98 D3052 移码∆uvrB pKM101 rfa

TA102 G428 置换十移码无pKM101/pAQI rfa Ames试验

☐方法要点（平板掺入法）：

剂量组5个剂量，最高5mg/皿，组距5倍

每种菌株的自发回变菌落数在正常范围内

需要设立阳性对照和阴性对照

需要做不加S9与加S9的试验

需要重复一次，每个剂量三个平行皿

常用菌株的自发回变与诱发回变菌落数

AMES试验优缺点

基因突变试验（哺乳动物细胞突变分析）

基因正向突变

☐基因正向突变指野生型基因失活的突变。

☐正向突变试验是利用培养的哺乳动物细胞系如小鼠淋巴瘤L5178Y细胞系和中国仓鼠肺（V79）细胞株，观察特定基因座位（locus）上是否诱变产生突变体