杀虫剂离体(in vitro)筛选方法研究进展

GABA受体拮抗剂活性荧光检测程序
其它基于不同受体的离体筛选方法
基于cAMP水平变化的受体 药物筛选: cAMP是一种非常 重要的第二信使，Williams研 究发现通过检测cAMP 水平变 化，可以反应配体对受体的激 动或拮抗作用。
基于ATP水平变化的受体药物筛选 : 采用化学发光方法检测ATP，具有 更高的敏感性，而且简便、快速，是 目前最为流行的方法。该方法基于萤 火虫荧光素酶（Firefly Luciferase ）催化荧光素氧化，消耗ATP，发出 光子的高效发光反应，具有发光效率 极高、发光量与ATP含量呈很好的线 性关系的优点。
杀虫剂离体(in vitro)筛选方法 研究进展
武汉工程大学
巨修练
介绍内容
一、传统的农药筛选方法 二、杀虫剂离体筛选方法 三、基因水平的杀虫剂离体筛选方法
传统的农药筛选方法
杀虫剂
主要为活体筛选, 明显的不足是虫 源一致性差、生长周期长、受外界条 件影响大。 杀菌剂 主要为离体筛选，仍为目前的主要 筛选方法。但筛选效率有待于提高。
除草剂
主要为活体筛选，仍为目前 的主要筛选方法。但筛选重复 性差、周期长、效率低。
杀虫剂离体筛选方法
1. 传统的离体筛选方法
测定化合物对乙酰胆碱酯酶的抑 制；对酪氨酸酶的抑制；对线粒体呼 吸酶活性的影响等。
2. 基于细胞水平的杀虫剂离体筛选
一般选用昆虫的初孵幼虫细胞， 然后进行一定时间的培养后，用MTT 发测定细胞存活率。
武汉工程大学在农药研发方面的工作 新化合物
环氧虫啉
（吡虫啉类似物）
氟氯吡氧乙酸十二酯
（氟草烟类似物）
仿制品种
除草剂
氟酮磺隆(flucarbazone) ; 氟丁酰草胺（beflubufamid） 嘧啶肟草醚（Pyribenzoxim); 丙炔氟草胺（flumioxazin); 环酯草醚（pyriftalid）。
MTT（溴化-[3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二 苯基 ] 四氮唑）法是二十世纪八十年代发展 起来的一种快速、简便的体外抗癌药物敏感 性的测试方法。目前已被广泛用于杀虫剂离 体筛选实验。其作用的基本原理如下：活细 胞线粒体中的琥玻酸脱氢酶能够还原黄色的 溴化MTT为蓝紫色的不溶于水的甲臜 （ formazan ），甲臜的生成量在通常情况 下与活细胞数成正比。由于甲臜的生成量可 通过酶标仪测定其在570nm处的吸收度 （OD值）而测定，因此可根据OD值推测出 活细胞的比例，测定化合物的杀虫活性。
3
H O O O
3 [ H]EBOB
3
H
操作程序如下：
抑制率(%) = 100×(A-C)/ (A-B) A：表示总放射量值（dpm）；
B：表示非特异性结合放射量值（dpm）；
C：表示待测样品放射量值（dpm）。
亲 和 性 测 定 实 验 过 程
一组双环硫化磷酸酯类化合物的活性
O O P O S
O O P O S
化合物 （15） LC50rat/LC50housefly = 52 （in vitro）
化合物 （17） LD50house = 0.04 mg/fly （in vivo）且表现出较高 的杀线虫活性
体化 的合 活物 性活 相体 关与 性离
LC50housefly = 0.455 nM
LC50rat > 10000 nM
基因水平的杀虫剂离体筛选方法
1.电生理技术在杀虫剂离体筛选中的应用
2.荧光检测技术在杀虫剂离体筛选中的应用 3.其它基于不同受体的离体筛选方法
电生理技术在杀虫剂离体筛选中的应用
全细胞膜通道记录原理
青蛙卵母细胞GABA受体电生理测定过程
化合物4f 抑制GABA受体膜片嵌电生理
刹Leabharlann Baidu剂
呋虫胺(dinotefuran) ; 环虫酰肼（chromafenozide); 氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor) 新型杀线虫剂(imicyafos) ; 啶虫丙醚(Pyridaly)；丁氟螨酯（Cyflumetofen); 联苯肼酯(Bifenazate) 。
刹菌剂
噻酰菌胺(tiadinil) ; 噻氟菌胺（thifuzamide）；氰霜唑（cyazofamid）; 喹螨醚（fenazaquin）； 新型杀线虫剂（imicyafos） ; 啶虫丙醚(Pyridaly) 。
荧光检测技术原理
将细胞孵育于一定的荧光指 示剂和Mask dye 中，荧光指示 剂附着于细胞膜外侧，并为 Mask dye 所掩盖。当细胞膜上 的离子通道打开或由其它原因导 致细胞的去极化时，荧光指示剂 移至细胞膜内侧，但Masking dye 不能进入细胞，荧光指示剂 的荧光释放可以检测到荧光信号。
展望
随着生命科学的迅速发展，特别是功能 基因组、蛋白质组、代谢组、细胞组、组合 化学、组合生物合成等新的研究领域的迅猛 发展，使得潜在的药物作用靶点数目和有待 筛选的化合物数目显著增多。这些进展为药 物筛选提供了良好的条件，同时也对筛选的 效率提出了更高的要求，不仅需要更大的筛 选规模和筛选速度，同时也要求筛选模型的 检测技术能够更快速、全面反映被筛样品的 生物活性。
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GABA 对其受体的电生理作用
GABAA受体拮抗剂对GABA受体的电生理作用
荧光检测技术在杀虫剂离体筛选中的应用
钙离子敏感荧光染料 一些离子通道对钙离子通透，当被激活时，会 引起细胞内钙离子浓度增高。因此使用钙敏感 的荧光染料标记细胞内钙离子，实时监控细胞 内钙离子浓度变化，可间接检测离子通道的活 动。 电压敏感荧光染料 静息状态下，细胞膜两侧存在电位差，处于极 化状态。当离子通道活动时，带电离子通过离 子通道，改变膜两侧的电位差。根据这一原理， Molecular Devices 推出电压敏感染料免洗试剂 盒。借助检测细胞膜两侧荧光信号的变化间接 反应离子通道的活动。
3. 同位素示踪技术在杀虫剂离体中的应用
受体—配体结合分析法是一 种灵敏，快速，简便，经济的离 体生物活性测定方法，研究发现， 利用合适的放射性配体作探针， 检测受体—配体结合方式及强度， 可用于杀虫剂分子的快速筛选。
配体与受体作用在作用于GABAA受 体的杀虫剂筛选中常用的探针有 [3H]EBOB（1-(4’-乙炔基苯基)-4-正丙基 -2,6,7-三氧杂双环[2.2.2]辛烷）， [3H]Ivermectin B1a,，[35S]TBPB（4-叔 丁基-双环硫化磷酸酯），作用于烟碱乙 酰胆碱受体的[3H]IMI（1-（6-氯-3-吡啶 甲基）-N-硝基-咪唑烷-2-亚胺），作用 于鱼尼汀受体的[3H] Ryanodine等。