第二代测序数据分析原理PPT课件
合集下载
第二代测序技术ppt课件
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
454 (GS-FLX)
▪ Roche：（2005，2007，2008）
▪ 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来， 通过检测化学发光信号的有无和强度，达到 实时检测DNA序列的目的。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
454 (GS-FLX)流程
▪ 包水的混合 物，每个独特的片断在自己的微反应器里、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
SOLiD流程
▪ 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
454 (GS-FLX)
▪ Roche：（2005，2007，2008）
▪ 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来， 通过检测化学发光信号的有无和强度，达到 实时检测DNA序列的目的。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
454 (GS-FLX)流程
▪ 包水的混合 物，每个独特的片断在自己的微反应器里、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
SOLiD流程
▪ 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
第二代测序原理及过程 共20页PPT资料
Next-Generation DNA Sequencing Methods
The Roche/454 FLX
454/enablingtechnology/the-system.asp
The method used by the Roche/454 sequencer to amplify single-stranded DNA copies from a fragment library on agarose beads. A mixture of DNA fragments with agarose beads containing complementary oligonucleotides to the adapters at the fragment ends are mixed in an approximately 1:1 ratio. The mixture is encapsulated by vigorous vortexing into aqueous micelles that contain PCR reactants surrounded by oil and pipetted into a 96-well microtiter plate for PCR amplification. The resulting beads are decorated with approximately 1 million copies of the original single-stranded fragment, which provides sufficient signal strength during the pyrosequencing reaction that follows to detect and record nucleotide incorporation events. sstDNA, singlestranded template DNA.
The Roche/454 FLX
454/enablingtechnology/the-system.asp
The method used by the Roche/454 sequencer to amplify single-stranded DNA copies from a fragment library on agarose beads. A mixture of DNA fragments with agarose beads containing complementary oligonucleotides to the adapters at the fragment ends are mixed in an approximately 1:1 ratio. The mixture is encapsulated by vigorous vortexing into aqueous micelles that contain PCR reactants surrounded by oil and pipetted into a 96-well microtiter plate for PCR amplification. The resulting beads are decorated with approximately 1 million copies of the original single-stranded fragment, which provides sufficient signal strength during the pyrosequencing reaction that follows to detect and record nucleotide incorporation events. sstDNA, singlestranded template DNA.
二代测序原理与技术(IonProton)
一条基因
一根探针 60bp
整个基因中，仅以与这60bp探针互补杂 交到的基因表达量来代表整个基因的表 达量。
20 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
二代测序
二代测序与芯片技术的比较
一条基因
通过测序技术直接获 得这些基因的序列片
2.碱基配对结合
9 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
3.释放氢离子
10 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
6.读取模版的连续两个相同碱基
13 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
7.芯片上几十万、几百万甚至上千万个DNA片段同时读取序列信息
14 | Ion Torrent by Life Technologies™ Proprietary and Confidential
高通量芯片内进行测序反应
dNTP H+
Sensing Layer Sensor Plate
Bulk
Drain
Source
Silicon Substrate
∆ pH ∆Q
∆V
Rothberg J.M. et al Nature doi:10.1038/nature10242
4种dNTP依次流过Ion芯片 DNA 聚合反应产生的氢离子的直接检测 每个碱基的检测只需要几秒
第二代dna测序的原理
第二代dna测序的原理第二代DNA测序技术，也被称为高通量测序技术，是指一类能够快速、经济地获得DNA序列信息的方法。
相比于第一代测序技术，第二代测序技术具有高通量、高速度、低成本等优势，因此已经成为了现代基因组学和生物学研究的重要工具。
目前，第二代测序技术主要包括Illumina HiSeq、Ion Torrent、PacBio SMRT等几种。
Illumina HiSeq是目前最流行的第二代测序技术，其原理可以分为文库构建、模板扩增、测序和数据分析四个主要步骤。
首先是文库构建。
该步骤主要是将DNA样品通过多个步骤进行前期处理，包括DNA的纯化、切割、链接连接适配体等，最终得到文库。
适配体是一小段已知序列，它可以与模板DNA的末端链接，用于测序反应的起始点。
接下来是模板扩增。
首先将文库DNA通过PCR反应扩增成为桥式文库。
PCR 反应过程中，适配体的序列被引物扩增，使得文库DNA与测序芯片上的引物产生结合。
然后，通过测序芯片上的固定位置的红外激光对测序模板进行扩增。
然后是测序。
基于桥式文库的测序技术主要依赖于合成DNA链的方法。
利用测序引物和缺失碱基，通过反复的碱基加入和扩增，合成出与模板DNA互补的新链。
在每一轮的测序中，只能加入一种缺失的碱基，而不能加入其他碱基。
利用红外激光激发这些碱基，通过监测发出的荧光强度，可以确定每个位置的碱基。
最后是数据分析。
经过测序仪产生的大量序列数据需要进行相应的数据处理和分析。
首先，需要对序列数据进行质量控制，去除低质量的数据。
然后，利用计算算法将测序的碱基与模板DNA进行比对，以此确定模板DNA的序列。
最后，通过基因组学分析软件进行数据解读和注释，比如寻找SNP（单核苷酸多态性）、查找功能基因等。
总结起来，第二代DNA测序技术通过文库构建、模板扩增、测序和数据分析等步骤，实现了高通量地获取DNA序列。
其中，Illumina HiSeq是最常用的技术之一，利用DNA链的合成方法进行测序，并通过数据处理和分析得到最终的DNA序列信息。
DNA第2代测序技术ppt课件
么要发展第2代测序技术
• 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一 直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包 含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基 因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的 复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要 的角色。
微生物遗传学时期
• 大致是1940～1960年，在这一时期中，采用微生物作为 材料研究基因的原初作用、精细结构、化学本质、突变机 制以及细菌的基因重组、基因调控等，取得了已往在高等 动植物研究中难以取得的成果，从而丰富了遗传学的基础 理论。
分子遗传学时期 • 这一时期从1963年沃森和克里克提出DNA的双螺旋模型 开始，但是50年代只在DNA分子结构和复制方面取得了 一些成就，而遗传密码、mRNA、tRNA、核糖体的功能 等则几乎都是60年代才得以初步阐明。 • 20世纪70年代初，建立了遗传工程这一新的研究领域。 遗传工程是在细菌质粒和噬苗体以及限制性内切酶研究的 基础上发展起来的，它不但可以应用于工、农、医各个方 面，而且还进一步推进分子遗传学和其他遗传学分支学科 的研究。
• 在DNA—蛋白质相互作用的研究上，染色质免疫沉淀— 深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色 质免疫沉淀以后的DNA 直接进行测序，对比ref seq可以 直接获得蛋白与DNA结合的位点信息，相比ChIP-chip， ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、 结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。
• 孟德尔于1866年发表了论文《植物杂交试验》，首次提 出分离和独立分配两个遗传规律，并认为性状遗传是受细 胞里的遗传因子控制的。 • 但是，孟德尔的这一重要理论当时未能收到重视，直到 1900年，狄· 弗利斯﹑柴马克和柯伦斯三人才同时发现。 • 1900年孟德尔遗传规律的重新发现，被公认为遗传学建 立和发展的一年，并于1906年将遗传学作为一个学科的 名称。
• 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一 直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包 含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基 因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的 复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要 的角色。
微生物遗传学时期
• 大致是1940～1960年，在这一时期中，采用微生物作为 材料研究基因的原初作用、精细结构、化学本质、突变机 制以及细菌的基因重组、基因调控等，取得了已往在高等 动植物研究中难以取得的成果，从而丰富了遗传学的基础 理论。
分子遗传学时期 • 这一时期从1963年沃森和克里克提出DNA的双螺旋模型 开始，但是50年代只在DNA分子结构和复制方面取得了 一些成就，而遗传密码、mRNA、tRNA、核糖体的功能 等则几乎都是60年代才得以初步阐明。 • 20世纪70年代初，建立了遗传工程这一新的研究领域。 遗传工程是在细菌质粒和噬苗体以及限制性内切酶研究的 基础上发展起来的，它不但可以应用于工、农、医各个方 面，而且还进一步推进分子遗传学和其他遗传学分支学科 的研究。
• 在DNA—蛋白质相互作用的研究上，染色质免疫沉淀— 深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色 质免疫沉淀以后的DNA 直接进行测序，对比ref seq可以 直接获得蛋白与DNA结合的位点信息，相比ChIP-chip， ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、 结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。
• 孟德尔于1866年发表了论文《植物杂交试验》，首次提 出分离和独立分配两个遗传规律，并认为性状遗传是受细 胞里的遗传因子控制的。 • 但是，孟德尔的这一重要理论当时未能收到重视，直到 1900年，狄· 弗利斯﹑柴马克和柯伦斯三人才同时发现。 • 1900年孟德尔遗传规律的重新发现，被公认为遗传学建 立和发展的一年，并于1906年将遗传学作为一个学科的 名称。
第二代测序的原理及其应用
第二代测序的原理及其应用1. 前言随着DNA测序技术的发展，第二代测序技术的出现为科研人员和生物医药领域带来了革命性的变化。
本文将介绍第二代测序的原理及其在科研和生物医药领域的应用。
2. 第二代测序的原理第二代测序是相对于第一代测序而言的，其主要特点是高通量和快速测序。
相比第一代测序，第二代测序技术可以在短时间内完成大规模的DNA测序。
第二代测序的原理基本上是通过将DNA样本分子化，并通过扩增、固定和测序的过程来获得测序结果。
具体步骤如下：•DNA片段的制备：首先，DNA样本需要进行切割，生成适当长度的DNA片段。
•适配体连接：将DNA片段连接到适配体上，适配体上含有特定序列，用于扩增和固定DNA片段。
•DNA扩增：通过PCR反应，对连接好的DNA片段进行扩增，以增加测序的灵敏度。
•DNA固定：将扩增的DNA片段固定在测序芯片或流式细胞中，以便进行后续的测序反应。
•测序反应：通过各种不同的测序技术（如Illumina、Ion Torrent 等），对DNA片段进行测序，得到碱基序列。
•数据分析：通过计算机算法，将得到的碱基序列进行比对和分析，得到最终的测序结果。
3. 第二代测序的应用第二代测序技术的高通量和快速特性使其在科研和生物医药领域有着广泛的应用。
以下是第二代测序技术的一些主要应用：3.1 基因组学研究•通过对整个基因组的测序，可以帮助科研人员了解基因组的结构、功能和变异情况。
•基因组测序还可以用于研究不同物种之间的遗传差异，揭示物种的进化历史。
3.2 转录组学研究•转录组测序可以帮助科研人员了解特定组织或细胞中的转录活动。
•通过比较不同条件下的转录组数据，可以探索基因表达的调控机制。
3.3 蛋白质组学研究•第二代测序技术结合质谱分析，可以用于高通量的蛋白质组学研究。
•可以通过测序和质谱分析，研究蛋白质的翻译后修饰和亚细胞定位。
3.4 癌症基因组学研究•通过对肿瘤患者的基因组测序，可以寻找与癌症相关的突变。
DNA第2代测序技术ppt课件
1.3 第2代测序技术的特点
• 速度快 • 准确度高
• 成本低
• 覆盖度深
• 产出巨大
1.4 第2代测序技术的原理
• 第2代测序技术包括Roche公司的454技术、Illumina公司 的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。 • 下面对三种第二代测序技术的原理和特点分别进行具体介 绍。
1.6 第2代测序技术的前景
• 大多分析家都无法相信新一代测序技术能完全取代目前的 芯片测序技术。 • 新一代测序仪推广困难可能由其价格昂贵导致。 • 但是，基因芯片也有其自身的缺点，就在于它是一个“封 闭系统”，它只能检测人们已知序列的特征(或有限的变 异)。而高通量测序的强项， 就在于它是一个“开放系 统”， 它的发现能力和寻找新的信息的能力，从本质上 高于芯片技术。
高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，microRNA表达 谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。
• 2008年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行 了RNA 深度测序。分析测得的序列，有大于90%的数据 显示落在已知的外显子中，而那些在已知序列之外的信息 通过数据分析展示的是从未被报道过的RNA剪切形式、3’ 端非翻译区、变动的启动子区域以及潜在的小RNA 前体。454测序技术流程
• 454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物 (homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现Poly(A) 的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数 目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。 也正是因为这个原因，454技术主要的错误不是来自核苷 酸的替换，而是来自插入或缺失。 • 454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序 列拼接工作更加高效、准确。
二代测序原理及报告解读
解决方案：
1.设计引物时，设计范围向外扩展一部分，能够覆盖住剪切位点，部分 内含子，以及调控区域。
2.对于panel里面覆盖的基因，对于报道的常见的非编码区的热点突变， 额外加用捕获引物或用其他方法补齐。
阴性结果原因分析3
❖ 另外一条染色体各种修饰作用异常（DNA甲 基化，核小体修饰等）
DNA双链 甲基化 组蛋白修饰
2.1 基因变异所致疾病及遗传方式
使用孟德尔遗传数据库查找基因所致疾病及遗传方式
显性与隐性遗传共存在
多种遗传方式
不完全显性
2.结果具体分析
1）该基因突变致病疾病类型及遗传方式 2）该样本的此处突变是否为致病性突变 明确致病和可疑致病 3）该样本的突变型最终是否患病
2.2 查找突变位点的致病性
➢ 可能与当前症状有关的但又无报道致病性不明的突变位点。除非未发现其他典 型致病点，可考虑出报告结果。
注明：仅有在报告结果中的位点是经过一代验证的，其他选点表中的突变点都是未验证的。
选点数据举例
一肝病panel 阴性结果报告，选点数据
阴性结果原因分析1
❖ 该基因上存在杂合性缺失。
外显子 内含子
仅从检测得到的碱基序列上看， 完全正常，并为纯和序列。
2.3 总结突变与患病的关系
• 从遗传方式看有没有患病的可能性 • 从突变类型看有没有患病的可能性
ACMG突变解析指南
未报道致病位点，致病可能性的评估指南，节选其中可能致病性很强列表如下：
3.基因与疾病背景介绍
• 基因介绍来自于Gene数据库 • 疾病介绍来自于OMIM、罕见病数据库或其他外文权威
数据库
4.附表
1. 检测基因包基因列表 2. 可疑阳性报告，附不明突变致病性预测指南附表 3. 检测到的其他突变位点（已去掉正常多态位点）
1.设计引物时，设计范围向外扩展一部分，能够覆盖住剪切位点，部分 内含子，以及调控区域。
2.对于panel里面覆盖的基因，对于报道的常见的非编码区的热点突变， 额外加用捕获引物或用其他方法补齐。
阴性结果原因分析3
❖ 另外一条染色体各种修饰作用异常（DNA甲 基化，核小体修饰等）
DNA双链 甲基化 组蛋白修饰
2.1 基因变异所致疾病及遗传方式
使用孟德尔遗传数据库查找基因所致疾病及遗传方式
显性与隐性遗传共存在
多种遗传方式
不完全显性
2.结果具体分析
1）该基因突变致病疾病类型及遗传方式 2）该样本的此处突变是否为致病性突变 明确致病和可疑致病 3）该样本的突变型最终是否患病
2.2 查找突变位点的致病性
➢ 可能与当前症状有关的但又无报道致病性不明的突变位点。除非未发现其他典 型致病点，可考虑出报告结果。
注明：仅有在报告结果中的位点是经过一代验证的，其他选点表中的突变点都是未验证的。
选点数据举例
一肝病panel 阴性结果报告，选点数据
阴性结果原因分析1
❖ 该基因上存在杂合性缺失。
外显子 内含子
仅从检测得到的碱基序列上看， 完全正常，并为纯和序列。
2.3 总结突变与患病的关系
• 从遗传方式看有没有患病的可能性 • 从突变类型看有没有患病的可能性
ACMG突变解析指南
未报道致病位点，致病可能性的评估指南，节选其中可能致病性很强列表如下：
3.基因与疾病背景介绍
• 基因介绍来自于Gene数据库 • 疾病介绍来自于OMIM、罕见病数据库或其他外文权威
数据库
4.附表
1. 检测基因包基因列表 2. 可疑阳性报告，附不明突变致病性预测指南附表 3. 检测到的其他突变位点（已去掉正常多态位点）
二代测序技术的原理与应用
abisolid?测序原理合成法测序连接法测序第二代测序的基本流程?1将目标dna剪切为小片段?2单个小片段dna分子结合到固相表面?3单分子独立扩增?4每次只复制一个碱基actg并检测信号?5高分辨率的成像系统二代测序技术可逆阻断技术二代测序技术ilumina测序原理二代测序技术ilumina测序流程二代测序技术ilumina测序流程焦磷酸测序pyrosequencing在测序时使用了一种叫做picotiterplateptp的平板它含有160多万个由光纤组成的孔孔中载有化学发光反应所需的各种酶和底物
SNP的应用
• 1.寻找致病基因
遗传疾病中已发现SNP的例子，如镰刀形细胞贫血症、晚期突 发 老年性痴呆等
• 2.诊断及预测致病风险 • 3.药物基因体学及新药的发现
临床治疗实践清楚地表明，药物的有效剂量有著极大的个体差 异，可以视为一种基因的表型
• 4.生物芯片快速检测
第二代测序技术的应用
• 基因组测序、重测序 • 突变体的定位 • 寻找SNP位点 • 全基因组甲基化测序 • 基因表达变化分析
在第二代中最高读长；比第 一代的测序通量大
样品制备较难；难于 处理重复和同种碱基 多聚区域；试剂冲洗 带来错误累积；仪器 昂贵
很高测序通量
仪器昂贵；用于数据 删节和分析的费用很 高
很高测序通量；在广为接受 的几种第二代平台中，所要 拼接出人类基因组的试剂成 本最低
测序运行时间长；读 长短，造成成本高， 数据分析困难和基因 组拼接困难；仪器昂 贵
• 高通量测序技术
大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了 高准确性
• 主流平台
Ilumina (Solexa, Hiseq); Roche 454; ABI(Solid)
SNP的应用
• 1.寻找致病基因
遗传疾病中已发现SNP的例子，如镰刀形细胞贫血症、晚期突 发 老年性痴呆等
• 2.诊断及预测致病风险 • 3.药物基因体学及新药的发现
临床治疗实践清楚地表明，药物的有效剂量有著极大的个体差 异，可以视为一种基因的表型
• 4.生物芯片快速检测
第二代测序技术的应用
• 基因组测序、重测序 • 突变体的定位 • 寻找SNP位点 • 全基因组甲基化测序 • 基因表达变化分析
在第二代中最高读长；比第 一代的测序通量大
样品制备较难；难于 处理重复和同种碱基 多聚区域；试剂冲洗 带来错误累积；仪器 昂贵
很高测序通量
仪器昂贵；用于数据 删节和分析的费用很 高
很高测序通量；在广为接受 的几种第二代平台中，所要 拼接出人类基因组的试剂成 本最低
测序运行时间长；读 长短，造成成本高， 数据分析困难和基因 组拼接困难；仪器昂 贵
• 高通量测序技术
大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了 高准确性
• 主流平台
Ilumina (Solexa, Hiseq); Roche 454; ABI(Solid)
二代测序基本原理
二代测序基本原理
1 什么是二代测序
二代测序（Second-Generation Sequencing，简称SGS），也称“大规模定序”，是将DNA分裂成许多片段的一种先进的、快速的、
低成本的测序技术。
二代测序应用于人类基因组研究，植物基因组研
究和细菌基因组研究，也是近年来的热门技术之一。
2 二代测序的原理
二代测序技术原理很简单，它可以迅速而费用低廉地识别和分析
大量DNA片段，从而提供更多数据量更高的序列信息。
核心步骤：首先，对特定DNA区域进行处理，以分离特定的DNA
片段并克隆到多取样中；然后，将克隆DNA片段分别放入若干孔中，
生成单孔库；其次，利用PCR拮抗反应（Polymerase chain reaction）形成多个复制品；最后，使用二代测序仪进行序列测定，即可得到片
段的序列信息。
3 二代测序的优势
二代测序技术有以下优点：
（1）成本低廉。
二代测序技术可以极大地降低实验成本，使高质
量的科学研究成为可能。
（2）快速准确。
由于可以在一次实验中同时测序数千个片段，所
以实验结果非常准确，大大节省时间和精力成本。
（3）重复性。
可以重复不同的实验，以更准确地获取更多的结果数据。
（4）可伸缩性。
可以根据需要轻松扩展实验过程的大小，以便同时测序更多的片段。
4 结语
二代测序技术无疑是推动今天生物学研究的重要技术，它快速准确、重复性高、可伸缩性强，使研究人员可以节省时间和降低研究成本，从而更高效地进行基因组学研究。
全基因组测序ppt课件
测序数据的生成与分析
01
数据质量控制
去除低质量、污染
和重复序列数据。
02
序列比对
将测序数据与参考 基因组进行比对。
04
注释与解读
对变异进行功能注
03
释和临床意义解读
。
变异检测
识别基因组中的单 核苷酸变异、结构
变异等。
03
全基因组测序的实际应用
人类健康与疾病研究
遗传性疾病诊断
人类进化研究
全基因组测序可以检测出人类基因中 的突变位点，有助于遗传性疾病的诊 断和预防，如罕见病、癌症等。
02
全基因组测序技术原理
测序平台与技术分类
平台类型
基于Sanger的测序、基于焦磷酸测 序、基于纳米孔的测序和基于合成测 序等。
技术分类
长读长测序和短读长测序，单分子测 序和合成测序等。
测序的基本步骤
样本准备焦磷酸酶反应。 通过测序平台产生原始的测序数据。
测序技术的发展历程
1 2
3
第一代测序技术
基于Sanger的DNA测序方法，测序读长较短，通量较低。
第二代测序技术
基于高通量测序技术，如Illumina平台，实现了高通量、高 灵敏度和高精度。
第三代测序技术
基于单分子测序技术，如PacBio和Nanopore平台，具有超 长读长和实时测序能力。
全基因组测序的应用领域
癌症基因组研究
目的
01
通过对癌症患者的基因组进行测序和分析，了解癌症的发生、
发展和转移机制，为癌症的诊断、治疗和预防提供依据。
成果
02
发现了许多与癌症发生、发展相关的基因突变和变异，为个性
化治疗和精准医学提供了有力支持。
chap二代测序数据分析实用PPT课件
a cg rank 1 4 6
a from 1+1=2
to
1+31=3
第21页/共50页
BWT mapping
• aac所在参照序列中起始位置：2 （0起始）
SA
a a c BWT a c g
0 6 $ a c a a c g g 00 1
a cg
1 2 a a c g $ a c c 0 1 1 rank 1 4 6
第10页/共50页
BW Transform
• X→B
acaacg$
$acaacg aacg$ac acaacg$ acg$aca caacg$a cg$acaa g$acaac
BWT
gc$aaac
Burrows-Wheeler Matrix (BWM)
第11页/共50页
BW Transform
• 循环转换
• +HWI-EAS209_0006_FC706VJ:5:58:5894:21141#ATCACG /1 efcfffffcfeefffcffffffddf`feed]`]_Ba_^__[YBBBBBBBBBBRTT\]][]dddd`ddd^ dddadd^BBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBB
第8页/共50页
短片段Mapping
• 输入 • 一个参考基因组 • 大量(10-1000M)的25~100bp的reads
• 输出 • 成功map到参考基因组上的每一个位点信息 • 未成功map比例
第9页/共50页
短片段Mapping
• 问题 • 不唯一位置 • 不确切位置
• 方法 • 哈希表：迅速，需要完美匹配 • 阵列扫描：无法处理空隙 • 动态规划：Indels，最优，但速度慢 • Burrows-Whee ler Transform (BW Transform): 快速，但对于空隙和错配，缺乏敏感度
二代测序技术-illumina测序原理
二代测序技术-illumina测序原理
Illumina测序技术是一种常用的二代测序技术，也被称为高通量测序技术。
其原理主要包括以下几个步骤：
1. DNA片段制备：首先，将待测的DNA样本进行特定处理，如剪切、连接接头等，生成适合测序的DNA片段。
2.聚合酶链反应（PCR）扩增：将DNA片段进行PCR扩增，以产生大量的DNA模板，供后续测序反应使用。
3.测序芯片制备：将PCR扩增得到的DNA模板固定在测序芯片的表面上，使得每个DNA模板都与芯片上的一个特定位置对应。
4.引物结合与扩增：在测序芯片上，加入带有特定序列的引物，并进行碱基扩增反应。
这种扩增反应是逐个碱基进行的，每次只加入一种碱基。
5.碱基荧光标记：每种碱基都与特定的荧光染料结合，不同的碱基配对会产生不同的荧光信号。
6.成像和信号检测：使用激光或其他光源对测序芯片上的DNA模板进行扫描，并检测每个位置的荧光信号。
7.数据处理和碱基识别：通过分析得到的荧光信号，识别每个位置的碱基。
8.重复扩增和成像：重复以上步骤，直到获得足够的测序数据。
通过以上步骤，Illumina测序技术可以高效地获得大量的测序数据，具有高通量、高准确性和较低的成本等优点，被广泛应用于基因组学、转录组学和表观遗传学等领域的研究。
二代测序实验与测序原理
主要技术平台
Illumina平台
基于边合成边测序技术，具有高准确性、高 灵敏度和高测序深度等优点，是应用最广泛 的二代测序平台之一。
SOLiD平台
基于连接酶合成和测序技术，能够提供较长的读长 和较好的序列质量，但测序通量相对较低。
Ion Torrent平台
基于焦磷酸测序技术，具有快速、低成本和 便携式等优点，适用于小型化和个性化测序 应用。
质量指标
使用质量指标，如Q值、测序深度、序列长 度等，对数据进行量化评估。
数据可视化与解读
可视化工具
使用可视化工具，如基因表达图谱、 序列比对图等，将复杂数据以直观的
方式呈现。
数据分析
通过数据分析，挖掘测序数据中的生 物学意义，揭示基因表达、变异等重
要信息。
解读结果
将可视化与数据分析结果进行整合， 为后续研究提供科学依据和指导。
样本处理
02
03
样本储存与运输
对收集的样本进行适当的处理不 受污染出同物种的基因组序列， 可以揭示生物进化的历程和机制， 有助于深入了解生命的起源和演 化。
测序技术的历史与发展
Sanger测序法
Sanger测序法是最早的测序方法，基于双脱氧终止法，可 以对较小的DNA片段进行测序。
下一代测序（NGS）
下一代测序技术包括基于芯片的测序和基于流动池的测序，能 够同时对大量DNA片段进行测序，提高了测序的通量和速度。
03
测序原理
测序过程
样本准备
将待测的DNA或RNA样本进行
测序反应
在测序平台上进行测序反应，包括DNA或RNA聚合酶的延伸、荧光标记等步骤。
数据收集
通过测序平台上的光学系统收集荧光信号，转化为测序碱基信息。
第二组--第二代测序技术的原理及应用
第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（ Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定 DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche（罗氏公司）/454 FLX、 Illuminate公司/Solexa Genome Analyzer和（ABI公司） Applied Biosystems SOLID system。 这三个技术平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长 （read）能达到400bp；Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其 他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有454 测序的1/10；SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确度大于 99.94%，而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%，是目前第二代 测序技术中准确度最转录组学的研 究中得到了广泛应用，得到高度好评。但是像其他新生技 术一样，RNA测序技术也面临一些挑战，比如RNA产生的海 量数据的生物信息学处理，获得高质量转录图谱最佳测序 量的确定等。
（3）、smallRNA测序 小RNA测序技术采用胶分离技术，收集样品中18-30nt的RNA 片段，利用高通量测序技术，一次性获得单碱基分辨率的 数百万条小RNA序列信息，依托强大的生物信息分析平台， 鉴定已知小RNA，并预测新的小RNA及其靶标基因。 基于Illumina HiSeqTM 2000高通量测序技术的小RNA数字 化分析，采用边合成边测序的方法，可减少二级结构造成 的区域缺失。该技术可以对高质量序列进行序列长度分布 的统计及样品间公共序列统计，将筛选后的高质量序列分 类注释，从而获得样品中包含的各组分及表达量信息，并 对所有小RNA片段进行注释，对新的miRNA则进行靶基因预 测。
??4单碱基延伸测序singlebaseextensionandsequencing?在测序的flowcell中加入四种荧光标记的dntpdna聚合酶以及接头引物进行扩增在每一个测序簇延伸互补链时每加入一个被荧光标记的dntp就能释放出相对应的荧光测序仪通过捕获荧光信号并通过计算机软件将光荧光测序仪通过捕获荧光信号并通过计算机软件将光信号转化为测序峰从而获得待测片段的序列信息
《二代测序简介》PPT课件
Resequencing Amplicon
variant analysis
18
Roche/454 Life Sciences’ Genome Sequencer
• 速度快，一个测序反应耗时10个小 时，获得100余万个读长和4-6亿个 碱基对。
• 测序读长最长，单个序列的读长更 长，平均可达到400-500个碱基左右
Image Acquisition and Processing
Fluorescence Chemiluminescence
.
Sequential Sequenc e Extensio n Reaction
Polymerase
Ligase 12
2nd Generation Performance
陈竺，日本血吸虫基因组
.
10
Next-Gen Platforms
GA – Illumina/Solexa
SBS with reversible fluorescent terminators
GS FLX – Roche/454 Life Sciences
SBS through pyrosequencing
基因转录水平研究全新转录区域研究千种植物转录组研究计划nextgenresearchapplicationsdenovo测序全基因组重测序基因组结构变转录组测序外显子测序小分子rna测序分析宏基因组学metagenomics泛基因组学pangenomedna甲基化分析chip测序小分子rna测序分析新mirna分子的挖掘其作用靶基因的预测和鉴定mirnas聚类和表达谱分析smallrnamicrornassirnaspirnas是生命活动重要的调控因子在基因表达调控生物个体发育代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用
variant analysis
18
Roche/454 Life Sciences’ Genome Sequencer
• 速度快，一个测序反应耗时10个小 时，获得100余万个读长和4-6亿个 碱基对。
• 测序读长最长，单个序列的读长更 长，平均可达到400-500个碱基左右
Image Acquisition and Processing
Fluorescence Chemiluminescence
.
Sequential Sequenc e Extensio n Reaction
Polymerase
Ligase 12
2nd Generation Performance
陈竺，日本血吸虫基因组
.
10
Next-Gen Platforms
GA – Illumina/Solexa
SBS with reversible fluorescent terminators
GS FLX – Roche/454 Life Sciences
SBS through pyrosequencing
基因转录水平研究全新转录区域研究千种植物转录组研究计划nextgenresearchapplicationsdenovo测序全基因组重测序基因组结构变转录组测序外显子测序小分子rna测序分析宏基因组学metagenomics泛基因组学pangenomedna甲基化分析chip测序小分子rna测序分析新mirna分子的挖掘其作用靶基因的预测和鉴定mirnas聚类和表达谱分析smallrnamicrornassirnaspirnas是生命活动重要的调控因子在基因表达调控生物个体发育代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
释放出的光学信号而间接确定的。 除了需要昂贵的光学监测系统，还要记录、存储并分析大量的光学图像 ，这都使仪器的复杂性和成本增加。依赖生物化学反应读取碱基序列更
增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大。 直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常 可取的。为了实现这样的目标，目前就有很多人在研究纳米物理技术。 在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNA Electronics，IBM, NabSys， Oxford Nanopore Technologies，Sequenom 等都在进行纳米孔测序的开发
外显子组分析工具
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • 分析策略的选择
3
第一代测序技术 ： Sanger测序法 ——简便、快速
4
逐渐被遗忘的测序 技术： Maxam-Gilbert的 DNA化学降解法
5
Sanger测序的局限
通过几十年的改进，第1 代测序仪的读长可以超过1000bp， 原始数据的准确率可以高达99.999%，测定每千碱基序列的
成本是0.5 美元, 每天的数据通量可以达到60万碱基。 但是，不管怎么改进，第1 代测序技术在速度和成本方面都 已达到了极限（因为对电泳分离技术的依赖, 使其难以进一 步提升分析的速度和提高并行化程度，并且难以通过微型化
降低测序成本）。 在此种情况下，第二代测序技术（Next-generation
sequencing)应运而生。
6
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • Illumina SOLID Polonator Complete Genomics
ChIP-seq
RNA-seq
Experiments
• DNA-seq: de novo, resequencing • RNA-seq:mRNA, ncRNA, smRNA... • ChIP-seq: Chromatin ImmunoPrecipitation • Methyl-seq: methylated DNA (epigenome)
，不同的只是采用的方法或策略。
18
19
20
Second generation sequence
• Roche 454 illumia Solexa
ABI SOLiD
Metagenomics De novo sequencing RNA-seq De novo sequencing Re-sequencing RNA-seq (ChromatinImmunoprecipitation，ChIP) Meth-seq Re-sequencing
问题出发
• 正常样本与异常样本，如肿瘤等； • 药物处理前后样本状态变化，如尼古丁刺激前后； • 发育不同阶段的样本改变
.............
第二代测序数据分析原理
徐汪节
三代DNA测序技术之比较
第一代测序技术：Sanger测序法 第二代测序技术：454测序……
第三代测序技术：？ 直接测序法：？
using pir-end reads. • N50 size. As applied to contigs or scaffolds, that size above which
50% od the assembled
全基因组de nove分析工具
分析所需工具
• Bowtie software SAM tools TopHat softare Cufflinks software CummeRbund software -
14
第二代测序技术的局限
与第一代测序仪相比，以合成测序为基础的下一代测序平台 速度显著提高，成本明显降低。每台设备每天产出千兆碱基
的序列不足为奇。 但是, 除了罗氏的454平台之外，读长短成了下一代测序平台 的致命伤，这主要是由于DNA簇中存在的光学信号移相造成
的。 而应运而生的单分子测序技术是解决这一问题的一种方法。
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • 分析策略的选择
Sequencing Glossary
• Reads. A collection of clones that over-sample the target genome. • Pair-end reads.Sequence reads derived from both ends of a
is taken. • Contig. The result of joining an overlapping collection of sequence
reads. • Scaffold. The result of connectiing non-overlapping contiges by
15
第三代测序技术：单分子测序
Helicos Biosciences VisiGen
Pacific Biosciences Mobious Nexus I
……
16
17
直接测序法
在所有上述三 代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助 下，通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中
……
8
454
9
SOLID
10
Illumina
11
其他
Polonator Complete Genomics
……
12
13
第二代测序技术的共同点
1 将目标DNA剪切为小片段 2 单个小片段DNA分子结合到固相表面
3 单分子独立扩增 4 每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号
5 高分辨率的成像系统 。
sequencing-library clone. • Mate-pair reads.Sequence reads derived from both ends of a mat
pair library clone which insert size is usually>1kb. • Insert size. The size of the clone-insert from which a clone-end pa
增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大。 直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常 可取的。为了实现这样的目标，目前就有很多人在研究纳米物理技术。 在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNA Electronics，IBM, NabSys， Oxford Nanopore Technologies，Sequenom 等都在进行纳米孔测序的开发
外显子组分析工具
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • 分析策略的选择
3
第一代测序技术 ： Sanger测序法 ——简便、快速
4
逐渐被遗忘的测序 技术： Maxam-Gilbert的 DNA化学降解法
5
Sanger测序的局限
通过几十年的改进，第1 代测序仪的读长可以超过1000bp， 原始数据的准确率可以高达99.999%，测定每千碱基序列的
成本是0.5 美元, 每天的数据通量可以达到60万碱基。 但是，不管怎么改进，第1 代测序技术在速度和成本方面都 已达到了极限（因为对电泳分离技术的依赖, 使其难以进一 步提升分析的速度和提高并行化程度，并且难以通过微型化
降低测序成本）。 在此种情况下，第二代测序技术（Next-generation
sequencing)应运而生。
6
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • Illumina SOLID Polonator Complete Genomics
ChIP-seq
RNA-seq
Experiments
• DNA-seq: de novo, resequencing • RNA-seq:mRNA, ncRNA, smRNA... • ChIP-seq: Chromatin ImmunoPrecipitation • Methyl-seq: methylated DNA (epigenome)
，不同的只是采用的方法或策略。
18
19
20
Second generation sequence
• Roche 454 illumia Solexa
ABI SOLiD
Metagenomics De novo sequencing RNA-seq De novo sequencing Re-sequencing RNA-seq (ChromatinImmunoprecipitation，ChIP) Meth-seq Re-sequencing
问题出发
• 正常样本与异常样本，如肿瘤等； • 药物处理前后样本状态变化，如尼古丁刺激前后； • 发育不同阶段的样本改变
.............
第二代测序数据分析原理
徐汪节
三代DNA测序技术之比较
第一代测序技术：Sanger测序法 第二代测序技术：454测序……
第三代测序技术：？ 直接测序法：？
using pir-end reads. • N50 size. As applied to contigs or scaffolds, that size above which
50% od the assembled
全基因组de nove分析工具
分析所需工具
• Bowtie software SAM tools TopHat softare Cufflinks software CummeRbund software -
14
第二代测序技术的局限
与第一代测序仪相比，以合成测序为基础的下一代测序平台 速度显著提高，成本明显降低。每台设备每天产出千兆碱基
的序列不足为奇。 但是, 除了罗氏的454平台之外，读长短成了下一代测序平台 的致命伤，这主要是由于DNA簇中存在的光学信号移相造成
的。 而应运而生的单分子测序技术是解决这一问题的一种方法。
• 主要的测序平台 • 基因组分析原理 • 转录组分析原理 • 分析策略的选择
Sequencing Glossary
• Reads. A collection of clones that over-sample the target genome. • Pair-end reads.Sequence reads derived from both ends of a
is taken. • Contig. The result of joining an overlapping collection of sequence
reads. • Scaffold. The result of connectiing non-overlapping contiges by
15
第三代测序技术：单分子测序
Helicos Biosciences VisiGen
Pacific Biosciences Mobious Nexus I
……
16
17
直接测序法
在所有上述三 代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助 下，通过读取DNA 聚合酶或DNA 连接酶将碱基连接到DNA 链上过程中
……
8
454
9
SOLID
10
Illumina
11
其他
Polonator Complete Genomics
……
12
13
第二代测序技术的共同点
1 将目标DNA剪切为小片段 2 单个小片段DNA分子结合到固相表面
3 单分子独立扩增 4 每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号
5 高分辨率的成像系统 。
sequencing-library clone. • Mate-pair reads.Sequence reads derived from both ends of a mat
pair library clone which insert size is usually>1kb. • Insert size. The size of the clone-insert from which a clone-end pa