植物组织中可溶性蛋白质含量的测定

实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定

Ⅰ．斐林-酚试剂法 [原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，

其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法适于微量蛋白的测定(范围为5～l00μg蛋白质)。

[材料、仪器设备及试剂]

(一)材料各种植物材料。

(二)仪器设备 722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。

(三)试剂 (1)0．5mol／L Na0H。 (2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：

A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。

B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。

使用前将A与B按50:1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。

(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。H20)100g，钼酸钠

(Na2Mo04·2H20)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。之后加入85％的H3PO450mL，浓Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml，溴水2-3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min）。待冷却后稀释至1000ml，过滤入棕色瓶中保存。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。

因此在使用前应进行标定。标定方法：取5ml福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内，用1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，当溶液突然转红再转灰绿时，即为滴定终点。计算其相当的酸度，用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于1mol/L 的酸度。在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性稳定，但此实验的瓜只在pH≠10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。

⑷标准蛋白质溶液：称取25mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸馏水中，使终浓度为250μg/ml。

[实验步骤]

（一）标准曲线的绘制

（1）取18mm×200mm试管7支，1-7编号，分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1mL，使每管含蛋白量分别为0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L。

（2）用定量加样器给每支试管中加入5mL甲液，混匀，于30℃下放置10min。

（3）再向试管中喷射加入0.5mL乙液，立即振荡混匀，在30℃下准确保温30min

（4）以不加标准蛋白的1号管为空白，在650nm下用1cm光径的比色皿测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

(二)样品的测定样品的提取：称取鲜样0．5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，10000 r／min离心10min，取上清液1．0mL（视蛋白质含量适当稀释)于试管中，然后重复标准曲线绘制中的2～4步骤，以空白管调零，测定吸光度。根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。

[结果计算] 样品中蛋白的含量＝ (mg／g) 式中：C为查标准曲线值，μg；VT 为提取液总体积，mL；WF为样品鲜重，g；Vs为测定时加样量，mL。 '

注意事项还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。

Ⅱ．考马斯亮蓝G-250染色法

[原理] 考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在59511nm。在一定蛋白质浓度范围内(1～1000μg)，蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。

考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。其结合物在室温下1h内保持稳定。此法灵敏度高(比斐林-酚法还高4倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。

[材料、仪器设备及试剂]

(一)材料小麦叶片及其他植物材料。

(二)仪器设备 722分光光度计，研钵，烧杯，量瓶，移液管，具塞刻度试管等。

(三)试剂

(1)标准蛋白质溶液：100μg／mL牛血清白蛋白：称取牛血清蛋白25μg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。

(2)考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入100mL 85％(W／V)的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。

[实验步骤]

(一)标准曲线的绘制取6文具塞试管，按表2-29-1加入试剂(0～100μg／mL 的标准蛋白)。混合均匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，用1cm光径比色皿在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

(二)样品测定

(1)样品提取。方法与斐林-酚试剂法相同。

(2)吸取样品提取液1．0mI，放人具塞试管中(每个样品重复2次)，加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。

[结果计算] 样品中蛋白质的含量＝ (mg／g) 式中：C、VT、WF、Vs的表示意义与斐林-酚法相同。

Ⅲ．紫外吸收法

[原理] 蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在280nm波长下具有最大光吸收。由于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm的光吸收度是蛋白质的一种普遍性质。在一定程度下，蛋白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比，故可作定量测定。核酸在紫外区(260nm)也有吸收，可通过校正加以消除。

[材料、仪器设备及试剂]

(一)材料．小麦叶片及其他植物材料。

(二)仪器设备紫外分光光度计，离心机，刻度移液管。