植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
各生理指标实验步骤
1丙二醛〔MDA〕含量的测定丙二醛在酸性和高温的条件下，可以和硫代巴比妥酸〔TBA〕反响生成红棕色的三甲川，在532nm处有最大光吸收。
植物组织中可溶性糖与TBA的显色反响产物在450nm和532nm处也有吸收。
测定时要排除可溶性糖的干扰，因此分别测定532nm和450nm处的吸光值，直接求得植物样品提取液中MDA的浓度；MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定。
计算公式如下:C(µmol.L-1)=6.45OD532-0.56OD450进一步算出每克样品鲜重中丙二醛的含量〔µmolg-1FW〕。
试剂：10%三氯乙酸〔TCA〕：10g三氯乙酸定容于100ml0.6%硫代巴比妥酸：0.6g用10%三氯乙酸TCA定容于100ml试验步骤:〔1〕取植物材料用液氮迅速研磨成粉，取0.2g左右材料，放入5ml离心管内。
〔2〕参加5ml 10%的三氯乙酸，提取30min后，10000r/min离心15min。
〔3〕取上清液2ml，参加2ml 0.6%TBA，混匀，在100℃水浴中煮15min，冷却，冷却后再测量。
〔4〕分别测定532nm和450nm处的吸光值。
以2ml〔加TBA,水〕水代替提取液作为对照管。
2蛋白质含量测定----考马斯亮蓝G-250法实验原理：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。
在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质一色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
仪器和试剂：牛血清白蛋白500微克/毫升：10ｍｇ蒸馏水定溶至100ｍｌ考马斯亮蓝G-250：10ｍｇ溶于5ml 90％乙醇中，参加10ml85％的磷酸，用蒸馏水定溶于100ｍｌ操作步骤：1.标准曲线的制作：取4支试管，按下表配制不同浓度的牛血清白蛋白溶液各1毫升,参加5毫升考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置2分钟后用10毫米光径的比色杯在595nm 下比色。
植物生理学实验课件9植物组织中可溶性蛋白的测定
可溶性蛋白质含量的计算
可溶性蛋白含量 (μg/g.FW)=标准曲线上查得的 蛋白质量（ μg ） × 提取液体积5/0.1
示意如下：
0.35
Y=-0.00381+0.032029*X 0.30 r=0.9992
0.25
Absorbance
0.20
植物组织中可溶性蛋白的测定
植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶 色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）
课上笔记
三个指标
– 蛋白质含量
考马斯亮蓝
– 新叶2份 – 老叶2份，一次次加 – 转移到1.5毫升 – 显色反应做2次，合计4次（调零磷酸+考马斯亮蓝
– MDA含量
沉重，磨好， 反求诸己
实验原理
in darkness at 30
No 3: 10ppm ABA 20 ml 提取
称叶龄差异明显的叶片各1.00g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol， pH值为7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以10 000g 离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。
显色反应
可溶性蛋白测定：缓冲液提取后可溶性蛋白溶于 上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反 应呈蓝色。在595nm处有最大吸收峰。
实验步骤
制备匀浆
48小时前预处理:称取叶片三份,每份1g（最好打圆孔），30度恒 温箱放置。
No 1: water 20ml (control);
No 2: 10ppm BA 20 ml; ℃ 2d.
0.15
0.10
0.05
0.00 0
2 4 6 8 10
实验二 可溶性蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝G-250法)
表-1 配制0～100µg/ml血清白蛋白液
管 号 100µg/ml牛血清蛋白量(ml) 蒸馏水量(ml) 蛋白质含量(mg) 1 0 1.0 0 2 0.2 0.8 0.02 3 0.4 0.6 0.04 4 0.6 0.4 0.06 5 0.8 0.2 0.08 6 1.0 0 0.10
实验步骤
实验步骤
2.样品提取液中蛋白质浓度的测定
取植物叶片0.1-0.2剪碎，用磷酸缓冲液研磨，倒入 10ml 离心管中，定容到10 ml，10000 pm离心， 20min 得上清液作为待测样品。 取0.5 ml提取液于试管中，加入0.5ml蒸馏水后摇匀， 再加上3 ml考马斯亮兰试剂并充分摇匀，在30摄氏度 水浴 20min ，于595nm处测得OD值。
实验二 植物组织中可溶性蛋白的测定
实验目的
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类， 植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类， 测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。 测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。在研究每 一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／ 蛋白 蛋白） 一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表 示酶活力大小及酶制剂纯度。因此， 示酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物体内可溶性 蛋白质是研究酶活的一个重要项目。 蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
实验原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的 一种。考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与 蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内 （0～100µg/ml），蛋白质与色素结合物在595nm波 长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质 的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内 达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h 内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含 量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。
可溶性蛋白质质谱分析
百泰派克生物科技
可溶性蛋白质质谱分析
可溶性蛋白质质谱分析，指的是利用质谱技术对特定条件下的生物细胞或组织中的可溶性蛋白质进行分析。
百泰派克生物科技提供质谱分析可溶性蛋白质的服务。
可溶性蛋白质
蛋白溶解度是指样品中溶解到溶液中的蛋白质含量。
蛋白质的溶解度通常是蛋白质新成分开发和测试过程中首先要确定的功能性质。
在一定的溶液中，根据溶解性，可以把蛋白质分为可溶性的和非可溶性的。
对于可溶性蛋白质，没有一定的标准，因为蛋白质的生化特性非常不同，在一定条件下溶于特定溶剂中的蛋白质都可以叫可溶性蛋白质。
可溶性蛋白质质谱分析
可溶性蛋白质质谱分析，指的是利用质谱技术对特定条件下的生物细胞或组织中的可溶性蛋白质进行分析。
在提取时，注意将可溶性蛋白与非可溶性蛋白分开即可。
分析可溶性蛋白质主要是对其种类、含量和功能等进行分析。
质谱可以测定蛋白质的含量，并通过测定蛋白质的一级结构来实现蛋白质种类和功能的分析。
不同细胞中的可溶性蛋白有所不同，例如衰老细胞分泌的可溶性蛋白包括炎性细胞因子、趋化因子、生长因子和基质修饰酶，分析它们有助于了解衰老相关的分泌表型。
植物可溶性蛋白的测定
植物组织可溶性蛋白质的测定-考马斯亮蓝G-250法更新时间2015-5-191、目的：测定植物组织的可溶性蛋白含量，测定范围为100-1000ug/ml，高浓度需要稀释后测定。
小分子蛋白和肽的测定需要用福林酚试剂。
2、提取：用测定SOD （0.05M pH7.8磷酸缓冲液）或者POD （0.1 mol / L 磷酸缓冲液 （pH6.0）的提取液或者用水提取均可，但混匀后要放置0.5-1小时再离心，以充分提取。
单独测定时，取样品5g，加水50ml，破碎，冷藏存储，测前10000rpm离心10分钟备用，取样0.1-0.2ml测定（如果加水比较少，计算时应考虑材料水分）。
3、测定：以提取液为对照，以牛血清标准蛋白为标准，以考马斯亮蓝G-250为显色剂，显色2-30分钟内，在595nm 比色。
4、计算：可溶性蛋白含量（ug/g鲜重）=测定含量（ug）*总提取体积ml/取样体积ml/鲜重g。
5、试剂配制：5.1、牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取0.100g牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液，此液不用时应冷藏保存，可用15天。
将1000μg／mL牛血清白蛋白用提取液稀释10倍，作为工作液，浓度为100μg／mL。
5.2、考马斯亮蓝G-250蛋白显色剂：称取0.050g考马斯亮蓝G-250，溶于25mL95％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸50mL，最后用蒸馏水定容到500mL。
此溶液在常温下可放置1个月。
标准曲线及样品配制表 蛋白含量（μg） 100μg/ml标准蛋白（μl） 提取液 （μl） 考马斯亮蓝G-250显色剂 （ml）0 0 10002.5 20 200 80040 400 600 60 600 400 80 800 200100 1000 0样品* X（一般叶片为1000） 1000-x*注1：样品量依据显色调整，生长旺盛期小麦叶片可溶性蛋白含量一般为1mg/g数量级。
实验植物组织中可溶性糖含量的测定
实验方案一、实验目的通过实验，掌握测定萝卜品质的方法（一）萝卜外部形态的测定1、实验材料取鲜样3个∕小区直尺、蒸馏水、笔、记录本、吸水纸2、实验方法．用自来水将各组萝卜洗净后，再用蒸馏水洗涤，擦干表面水分．每个小区取3个重复，用电子天平称量每株的鲜重，用直尺测量植株的茎长、茎粗、叶长，取平均值作为指标值实验(二) 植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）一、实验目的了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度计的使用二、实验原理糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。
不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。
因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。
蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。
蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。
当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。
上述特定的糖类物质，反应较稳定。
该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。
三、材料、仪器及试剂1.材料：植物种子、白菜叶、柑桔2.仪器：分光光度计；恒温水箱； 20ml具塞刻度试管（3支）漏斗；100ml容量瓶；刻度试管；试管架；剪刀；研钵3.试剂（1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。
（2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏；（3）浓硫酸四、实验方法1.葡萄糖标准曲线的制作取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。
在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡2.称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。
可溶性糖、淀粉、蛋白质
植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定一、目的从一份植物样品中系统分离和测定可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质等多种成分，不仅对研究植物体内碳、氮代谢，了解植物的生长发育状况有重要意义，亦可以作为鉴定其品质的重要指标，而且也有助于训练基本操作技能。
二、原理（一）分离提取原理在80~85%的乙醇中，植物组织中的还原糖、蔗糖以及游离氨基酸和叶绿素等溶解，而淀粉及蛋白质沉淀，再用9.2mol/L高氯酸溶解淀粉（蛋白质沉淀），最后用0.1mol/L氢氧化钠溶解蛋白质，然后选用适当的方法测定各个提取液中相应物质的含量。
（二）测定原理1．蒽酮比色法——可溶性糖含量测定碳水化合物及其衍生物经浓硫酸处理，生成糠醛，再与蒽酮脱水缩合而生成蓝绿色化合物，在一定范围内其颜色深浅与碳水化合物含量成线性关系。
蒽酮反应的颜色深浅，随温度条件和加热时间而变化，葡萄糖显色高峰在100℃时，加热10min后出现，而核糖在相同温度下，加热3min后出现。
此法灵敏度高，糖含量达30μg即可测定。
2．茚三酮比色法——氨基酸含量测定氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，产生二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在570nm下有最大光吸收。
在一定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量呈正比。
3．考马斯亮蓝G-250结合法——蛋白质含量测定考马斯亮蓝在游离状态时呈红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，后者最大光吸收在595nm，在一定范围内（0~1000μg/mL），其颜色深浅与蛋白质的含量呈正比。
此法快速灵敏，反应在2min内即达到平衡，室温1h内颜色稳定，而且干扰物也少。
三、实验用品（一）实验材料：植物样品。
（二）器皿：1.25mL刻度试管×8，15mL试管×20；2.10mL离心管×2；3.容量瓶：50mL×1，25mL×1；4.移液管：5mL×2；2mL×4，1mL×2，0.1mL×2；5.恒温水浴锅；6.离心机；7.电子天平；8.分光光度计。
植物组织中可溶性蛋白(MDA)的测定
课程名称：植物生理学及实验实验类型：理论学习实验项目名称：植物组织中可溶性蛋白的测定1. 实验目的和要求掌握植物组织可溶性蛋白的测定的理论和技术。
2. 实验内容和原理2.1. 衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能衰退，最终自然死亡的过程。
2.2. 衰老时的生理生化变化——蛋白质显著下降,核酸含量的变化、光合速率下降、呼吸速率下降、生物膜结构变化、植物内源激素的变化等。
2.3. 植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。
2.4. 自由基代谢失调, 并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA3. 主要仪器设备分光光度计、离心管、移液枪等。
4. 操作方法与实验步骤4.1. 制备蛋白提取液：称叶龄差异明显的叶片各0.50g ，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以8000g 离心力作用下（4℃）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。
4.2. 样品的测定：取40ul蛋白提取液+160ul磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值。
对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。
4.3. MDA的测定：1）取上清液1.0ml于7ml离心管中,加TBA与TCA混合液4.0ml，然后在离心管盖上戳一小孔，92ºC水浴保温30min2）空白管：1mL Pi-buffer +TBA与TCA混合液4.0ml （92ºC水浴30min）冷却后，平衡，离心5min; 10000rpm3）测定A532, A450和A6004.4. 计算：1）可溶性蛋白含量(μg/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量（μg ）×提取液体积/（测定加样量×鲜重）2）MDA含量进一步求出单位鲜重植物组织中的MDA含量5. 实验数据记录和处理5.1 可溶性蛋白：老叶：3972.06(μg/g.FW)；新叶：18328.48(μg/g.FW)分析：说明在叶片衰老的过程中，可溶性蛋白的含量减少。
植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定
实验四植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定一、目的从一份植物样品中系统分离和测定可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质等多种成分，不仅对研究植物体内碳、氮代谢，了解植物的生长发育状况有重要意义，亦可以作为鉴定其品质的重要指标，而且也有助于训练基本操作技能。
二、原理（一）分离提取原理在80-85%的乙醇中，植物组织中的还原糖、蔗糖以及游离氨基酸和叶绿素等溶解，而淀粉及蛋白质沉淀，再用9.2 mol/L高氯酸溶解淀粉（蛋白质沉淀），最后用0.1 mol/L氢氧化钠溶解蛋白质，然后选用适当的方法测定各个提取液中相应物质的含量。
（二）测定原理1.蒽酮比色法——可溶性糖含量测定碳水化合物及其衍生物经浓硫酸处理，生成糠醛，再与蒽酮脱水缩合而生成蓝绿色化合物，在一定范围内其颜色深浅与碳水化合物含量成线性关系。
蒽酮反应的颜色深浅，随温度条件和加热时间而变化，葡萄糖显色高峰在100℃时，加热10 min后出现，而核糖在相同温度下，加热3 min后出现。
此法灵敏度高，糖含量达30 μg即可测定。
2.茚三酮比色法——氨基酸含量测定氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，产生二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在570 nm下有最大光吸收。
在一定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量呈正比。
3.考马斯亮蓝G-250结合法——蛋白质含量测定考马斯亮蓝在游离状态时呈红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，后者最大光吸收在595 nm，在一定范围内（0-1000 μg /mL），其颜色深浅与蛋白质的含量呈正比。
此法快速灵敏，反应在2 min内即达到平衡，室温1h内颜色稳定，而且干扰物也少。
三、实验用品（一）实验材料：植物样品。
（二）器皿：1. 25 mL刻度试管⨯8 ，15 mL试管⨯20；2. 10 mL离心管⨯2；3. 容量瓶：50 mL⨯1 ，25 mL⨯1；4. 移液管：5 mL⨯2，2 mL⨯4，1 mL⨯2，0.1 mL⨯2；5. 恒温水浴锅；6. 离心机；7. 电子天平；8. 分光光度计。
11级植物生理实验讲解内容
植物生理实验讲解内容实验一植物组织水势的测定（小液流法）1、原理（1）水分移动的总原则：从高水势到低水势。
当把植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中，水势越大，越易失水；水势越小，越易得水；因此，会出现三种情况：植物组织的水势＜外液的水势，组织吸水，外液（a）浓度变大植物组织的水势＞外液的水势，组织失水，外液（b）浓度变小植物组织的水势＝外液的水势，组织既吸水又失水，外液（c）水分保持动态平衡（2）据比重大小判断小液流的移动方向：为判断以上三种情况，把侵有组织的溶液进行着色，当把着色的a、b、c三种外液用针管以小液流法放回对应的原溶液中，也出现三种情况：当浓度变大的外液（a）放入原溶液中↓，说明植物组织的水势＜外液的水势当浓度变小的外液（b）放入原溶液中↑，说明植物组织的水势＞外液的水势当水分保持动态平衡的外液（c）放入原溶液中≈（不动），说明植物组织的水势＝外液的水势2、材料：毛果含笑叶；梧桐树叶；丁香花或牵牛花4、方法（选用CaCl2溶液为外液）思考题1、试述小液流法测定植物组织水势的原理。
测定中应注意什么？（1）遵照两个原理：①水分移动的总原则—从高水势到低水势。
②根据比重大小判断小液流的移动方向。
（2）测定中应注意：①取材时尽量避开叶脉和伤口、部位要一致、要迅速（以免失水），材料要混匀；②母液要均匀，不能颠倒顺序；③放小液流时不能用力过大；④观察液流方向要细心等]。
2、某组实验出现了小液流法↓↑↑↓↑的情况，请分析出现错误的可能原因。
最有可能出错的应是第四支试管。
出错的原因有以下可能：(1)在配制甲组试管溶液时，试管没有充分的摇匀；(2)在配制甲组浓度梯度溶液时，第四支试管溶液不准确，浓度过低；(3)用注射器在甲组试管中挤出小液滴时，用力过猛。
3、测定水势的方法有：小液流法；电导仪法；折射仪法。
实验二植物组织中游离氨基酸总量的测定——茚三酮显色法（1.原理氨基酸(蛋白质)的游离-NH3可与水合茚三酮反应，生成蓝紫色的化合物；在一定范围内，颜色的深浅与游离氨基的含量成正比，因此，可用分光光度法测定其含量。
实验七植物组织中可溶性蛋白质
实验七植物组织中可溶性蛋白质、可溶性糖含量的测定I、植物组织中可溶性蛋白质的测定一、原理由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm 波长处。
在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm 与其浓度呈正比关系，可作定量测定。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料植物叶片（二）仪器设备紫外分光光度计、分析天平、离心机、恒温水浴锅、研钵、移液管等（三）试剂 0.1 mol/L pH7.0 磷酸液三、实验步骤1．样品中蛋白质的提取称取植物叶片0.5~1.0 g放入研钵中，加入2mL 0.1 mol/L的磷酸缓冲液，研磨成匀浆，转移至15mL 离心管中，再用6mL磷酸缓冲液分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在室温（20~25℃）下放置05~1.0h,以充分提取，然后在4000 r/min离心10 min，将上清液转入25 mL容量瓶中，并以磷酸缓冲液定容至刻度，即得待测样品提取液。
2．样品中蛋白质含量的测定取适量稀释后的蛋白质提取液，在紫外分光光度计上，分别于280 nm和260 nm波长条件下（以磷酸缓冲液为空白对照），测定提取液的吸收值，代入公式即可计算出样品中蛋白质的含量。
四、结果计算样品中蛋白质的浓度（mg/mL）=（1.45A280—0.74A260）×稀释倍数式中： 1.45 和 0.74 ——校正值。
A 280 ——蛋白质溶液在 280 nm 处的吸光度。
A 260 ——蛋白质溶液在 260 nm 处的吸光度Ⅱ、植物组织中可溶性糖的测定--蒽酮法一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。
实验三、植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
植物组织中可溶性蛋白质含量的测定--考马斯亮蓝G – 250染色法一、原理考马斯亮蓝G –250 （Coomassie brilliant blue ，G-250 ）法是利用蛋白质–染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。
此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465 nm 变成595 nm ，通过测定595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1 h ，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。
此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料植物材料。
（二）试剂1. 标准蛋白质溶液（100 μg ／mL 牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白25 mg ，加水溶解并定容至100 mL ，吸取上述溶液40 mL ，用蒸馏水稀释至100 mL 即可。
2. 考马斯亮蓝试剂：称取100 mg 考马斯亮蓝G-250 ，溶于50 mL 90 ％乙醇中，加入100 mL 85 ％（W ／V ）的磷酸，再用蒸馏水定容到1000 mL ，贮于棕色瓶中。
常温下可保存一个月。
（三）仪器设备分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。
三、实验步骤1. 标准曲线的绘制取6 支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5 min 左右，以0 号试管为空白对照，在595 nm 下比色测定吸光度。
以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
2. 样品测定（1 ）样品提取称取鲜样0.25 ～0.5 g ，用 5 mL 蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000 r/min 离心10 min ，上清液备用。
植物生理生化实验【范本模板】
实验一植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法P199原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚—二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称Rubemans紫.其吸收峰在570nm，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量.①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮。
②脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水,生成二酮茚-二酮茚胺.材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。
实验步骤：分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中,加入5ml醋酸(使蛋白质变性,沉淀），研磨成匀浆后,用无氨蒸馏置于沸水中加热15min，取出用冷水迅速冷却并不时摇动，使之呈蓝紫色，用60％乙醇定容20ml，在570nm 波长下测定吸光度。
样品氨基态含氮量(ug/100g鲜重）=CV T/V S W ＊100 ;C=A/k (k=0.103) ; V T=100/2 ；V S=1 ；W=1注意事项：1.测定前所用的玻璃仪器要干燥，所用的蒸馏水必须为无氨水；2.样品要磨匀,用无氨蒸馏水定容，并用干燥滤纸过滤；3.抗坏血酸易被还原;加入的量要严格控制，因为还原剂抗坏血酸会与茚三酮反应；4.水浴锅的液面要高于试管内的液面,使其加热均匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于90℃，15min后取出迅速冷却，再加入60%乙醇;5.稀释后要迅速比色;6. 谷物等蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后,用本法测定氨基酸含量，可计算出样品蛋白质含量；7. 反应要在无水、有机、微酸的环境下进行。
最适PH为4。
5,是乙醇-乙酸钠缓冲液和醋酸缓和后的PH。
思考题：1.茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？不相同，因为有些氨基酸的结构不同，不含游离的氨基，如脯氨酸。
2.测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义?可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理和逆境状态和植物的营养、施肥指标等。
实验五：植物组织蛋白质提取与含量测定
1.4
1.0 5 Y
1.9
1.0 5 Z
四、实验步骤
三、样品蛋白质含量测定
2. 蛋白质含量测定：
两个原则来选择合适稀释倍数： 样品A595不能超过标准蛋白的最大A595值；
去除最小吸光度，选择中间吸光度。
将待测液最佳A595值(Y)代入标准曲线所得方程式中求出待测液中蛋白含量（X）
3. 蛋白质含量计算：
添加
• 按下页表所示依次加入各种试剂；
• 震荡，混匀； • 室温下静置5 min;
混匀
静置
测定 绘制
• λ =595 nm处测各管吸光度； • 绘制标准曲线，X=标准BSA含量，Y=吸光度，
四、实验步骤
一、标准曲线制作 管号 BSA(mL) 0.9%NaCl(mL) 0 0 1.0 1 0.2 0.8 2 0.4 0.6 3 0.6 0.4 4 0.8 0.2 5 1.0 1.0
定容
• 上清定容，用0.9% NaCl定容至10 mL(样品液)，
四、实验步骤
三、样品蛋白质含量测定
1. 样品液的稀释：
管号
稀释倍数（n） 样品液
1
5 0.2
2
10 0.1
3
15 0.1
4
20 0.1
0.9% NaCl
待测液 G-250(mL) A595
0.8
1.0 5 W
0.9
1.0 5 X
G-250(mL)
蛋白含量（ug）
5
0
5
20
5
40
5
60
5
80
5
100
5
X
振荡混匀，静置5 min，以0号管为空白对照 A595
实验七 植物组织中可溶性蛋白质
实验七植物组织中可溶性蛋白质、可溶性糖含量的测定I、植物组织中可溶性蛋白质的测定一、原理由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm 波长处。
在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm 与其浓度呈正比关系，可作定量测定。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料植物叶片（二）仪器设备紫外分光光度计、分析天平、离心机、恒温水浴锅、研钵、移液管等（三）试剂0.1 mol/L pH7.0 磷酸液三、实验步骤1．样品中蛋白质的提取称取植物叶片0.5~1.0 g放入研钵中，加入2mL 0.1 mol/L的磷酸缓冲液，研磨成匀浆，转移至15mL 离心管中，再用6mL磷酸缓冲液分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在室温（20~25℃）下放置05~1.0h,以充分提取，然后在4000 r/min离心10 min，将上清液转入25 mL容量瓶中，并以磷酸缓冲液定容至刻度，即得待测样品提取液。
2．样品中蛋白质含量的测定取适量稀释后的蛋白质提取液，在紫外分光光度计上，分别于280 nm和260 nm波长条件下（以磷酸缓冲液为空白对照），测定提取液的吸收值，代入公式即可计算出样品中蛋白质的含量。
四、结果计算样品中蛋白质的浓度（mg/mL）=（1.45A280—0.74A260）×稀释倍数式中：1.45 和0.74 ——校正值。
A 280 ——蛋白质溶液在280 nm 处的吸光度。
A 260 ——蛋白质溶液在260 nm 处的吸光度Ⅱ、植物组织中可溶性糖的测定--蒽酮法一、原理糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。
该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。
《植物生理学实验》教学大纲
《植物生理学实验》教学大纲课程名称：植物生理学实验实验学时：32学分：1学分适应专业：本科生物科学专业一、实验的地位、目的植物生理学实验是生物科学本科专业重要的专业基础课和必修课，独立设置课程，单独考核。
通过做实验加深学生对植物生理学基础理论的理解，掌握植物生理学研究中一些基本的实验方法和实验技术，更重要的是训练同学们操作技能，锻炼学生的动手能力，培养学生的观察能力、综合能力和创新能力，增强学生分析问题和解决问题的能力，促进创造性思维的形成。
二、实验教材与指导书实验教材：《植物生理学实验》，赵世杰等编著，中国农业出版社，2015年版；教学参考书：《现代植物生理学实验指南》，中国科学院上海植物生理研究所，科学出版社，1999；《植物生理学实验指导》，张志良,瞿伟菁主编，高等教育出版社，2003三、考核方式及成绩评定1、考核方式：综合考核实验成绩，包括实验报告成绩、笔试成绩和平时成绩2、期末考试形式、时间及分值考试形式：技能测试；考试时间：100分钟。
3、成绩组成：平时成绩占50%，其中出勤考核占10%，上课表现占10%，实验报告成绩占30%；期末课程考核成绩占50%四、实验项目开设表共有10个实验，其中选8个实验必做材料2 植物组织水势的测定必做液体交换法测定植物水势，掌握测定方法的原理和操作方法。
3 植物根系活力的测定必做采用TTC法测定。
4 叶绿素的提取分离及理化性质选做练习叶绿体色素的提取方法，验证理化性质。
5 叶绿素的定量测定必做用分光光度计定量测定叶绿素a、b和类胡萝卜素含量，掌握叶绿素计的测定原理和使用方法。
6 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定必做考马斯亮蓝染色法测定植物组织中蛋白质的含量。
7 生长素对植物的影响必做利用幼苗芽鞘的生长可被生长素特异地诱导这一特性可用以测定生长素类物质，掌握生长素物质的生物特性及其与植物生长的关系8 植物组织逆境伤害程度的测定（MDA含量）必做利用电导仪测定处理液电导度的变化，确定各种逆境对植物的伤害程度，并了解细胞膜透性与受伤害程度的关系9 植物组织中过氧化物酶活性的测定必做通过测定植物过氧化物酶活性，了解某一组织其再植物体内的带些变化，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。
植物组织中SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定
植物组织中SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定1. CAT反应液的配制：O.1M H2O2溶液: 0.568ml 30%H2O2定容至100ml。
0.1M PH7.0磷酸缓冲液：97.5毫升A液+152.5毫升B液。
定容至500毫升。
0.1M的H2O2 5毫升+0.1M的pH7.0的磷酸缓冲液20毫升(即按1:4的比例)混勺，即为CAT反应液。
2. CAT的测定:0.1毫升（或50微升）酶液+2.5毫升反应液，240nm下比色，每隔1分钟读数1次，共读数3次。
3. 结果计算:CAT( 240*/0.05/0.5=1. MDA反应液的配置:0.6克TBA(硫代巴比妥酸)，先用少量1M NaOH溶解，用10%TCA (三氯乙酸) 定容至100毫升。
2. MDA的测定:1毫升酶液+2毫升0.6%的TBA，封口沸水浴15分钟，迅速冷却后再离心，取上清液，在600、532、450nm 三个波长下比色。
3.结果计算:MDA(umol/gfw )=(6.45*(D532*D600)-0.56D450)*0.015/W或(6.45*(D532*D600)-0.56D450)*0.03/W七、可洛性蛋白的制定1. 反应液配制:0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，过滤。
2. 测定:20微升酶液+3毫升G-250放置2分钟，595纳米比色，同时做空白(20微升缓冲液+3毫升G-250)3. 结果计算:可溶性蛋白（mg/Gfw)=(C*V/Va）/W八、脯氨酸含量的测定1. 试剂配制:0.6克黄基水杨酸，定容至200毫升。
酸性茚三酮(现配)：3.75克茚三酮+90毫开冰醋酸+36毫升蒸馆水2. 测定:0.3克叶片，加入5毫升磺基水杨酸，加盖，沸水浴10分钟，过滤，吸取滤液2豪升（同时作空白，吸取2毫升蒸馏水），2毫升冰醋酸和3毫升酸性茚三酮，沸水浴40分钟，冷却，加入5毫升甲苯，充分振荡，静置分层，取上层甲苯溶液于比色皿中，520纳米下比色。
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实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
Ⅰ．斐林-酚试剂法 [原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，
其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。
在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。
由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。
该法适于微量蛋白的测定(范围为5～l00μg蛋白质)。
[材料、仪器设备及试剂]
(一)材料各种植物材料。
(二)仪器设备 722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。
(三)试剂 (1)0．5mol／L Na0H。
(2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：
A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。
B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。
使用前将A与B按50:1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。
(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。
H20)100g，钼酸钠
(Na2Mo04·2H20)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。
之后加入85％的H3PO450mL，浓Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。
冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml，溴水2-3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min）。
待冷却后稀释至1000ml，过滤入棕色瓶中保存。
使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。
因此在使用前应进行标定。
标定方法：取5ml福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内，用1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，当溶液突然转红再转灰绿时，即为滴定终点。
计算其相当的酸度，用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于1mol/L 的酸度。
在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性稳定，但此实验的瓜只在pH≠10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。
⑷标准蛋白质溶液：称取25mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸馏水中，使终浓度为250μg/ml。
[实验步骤]
（一）标准曲线的绘制
（1）取18mm×200mm试管7支，1-7编号，分别加入0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1mL，使每管含蛋白量分别为0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L。
（2）用定量加样器给每支试管中加入5mL甲液，混匀，于30℃下放置10min。
（3）再向试管中喷射加入0.5mL乙液，立即振荡混匀，在30℃下准确保温30min
（4）以不加标准蛋白的1号管为空白，在650nm下用1cm光径的比色皿测定吸光度。
以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
(二)样品的测定样品的提取：称取鲜样0．5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，10000 r／min离心10min，取上清液1．0mL（视蛋白质含量适当稀释)于试管中，然后重复标准曲线绘制中的2～4步骤，以空白管调零，测定吸光度。
根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。
[结果计算] 样品中蛋白的含量＝ (mg／g) 式中：C为查标准曲线值，μg；VT 为提取液总体积，mL；WF为样品鲜重，g；Vs为测定时加样量，mL。
'
注意事项还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。
Ⅱ．考马斯亮蓝G-250染色法
[原理] 考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
该染料在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在59511nm。
在一定蛋白质浓度范围内(1～1000μg)，蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速，2min左右即达到平衡。
其结合物在室温下1h内保持稳定。
此法灵敏度高(比斐林-酚法还高4倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
[材料、仪器设备及试剂]
(一)材料小麦叶片及其他植物材料。
(二)仪器设备 722分光光度计，研钵，烧杯，量瓶，移液管，具塞刻度试管等。
(三)试剂
(1)标准蛋白质溶液：100μg／mL牛血清白蛋白：称取牛血清蛋白25μg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。
(2)考马斯亮蓝G-250溶液：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入100mL 85％(W／V)的磷酸，再用蒸馏水定容到1L，贮于棕色瓶中。
常温下可保存一个月。
[实验步骤]
(一)标准曲线的绘制取6文具塞试管，按表2-29-1加入试剂(0～100μg／mL 的标准蛋白)。
混合均匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min左右，用1cm光径比色皿在595nm下比色测定吸光度。
以蛋白质浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
(二)样品测定
(1)样品提取。
方法与斐林-酚试剂法相同。
(2)吸取样品提取液1．0mI，放人具塞试管中(每个样品重复2次)，加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
[结果计算] 样品中蛋白质的含量＝ (mg／g) 式中：C、VT、WF、Vs的表示意义与斐林-酚法相同。
Ⅲ．紫外吸收法
[原理] 蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在280nm波长下具有最大光吸收。
由于各种蛋白质中都含有酪氨酸，因此280nm的光吸收度是蛋白质的一种普遍性质。
在一定程度下，蛋白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比，故可作定量测定。
核酸在紫外区(260nm)也有吸收，可通过校正加以消除。
[材料、仪器设备及试剂]
(一)材料．小麦叶片及其他植物材料。
(二)仪器设备紫外分光光度计，离心机，刻度移液管。
(三)试剂 0． 1mol/L PH 7．0磷酸缓冲液。
[实验步骤]
（一）样品提取与菲林-酚法相同。
（二）测定取适量的样品提取液，根据蛋白质浓度，用0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲液适当稀释后，用紫外分光光度计分别在280nm和260nm波长下读取吸光度，以pH7.0磷酸缓冲液为空白调零。
[结果计算] 蛋白质浓度=1.45A280-0.744A260（mg/mL）蛋白质含量= 式中：1.45和0.74为校正值：A280为蛋白质溶液在280nm处的吸光度；A260为蛋白质溶液在260nm处的吸光度；n为稀释倍数。
思考题 1．测定植物体内可溶性蛋白质含量有什么意义和用途?试举二例说明。
2．三种测定方法各有何优缺点?在实验中如何选择合适的方法并克服其缺点?
3．福林-酚试剂法测定蛋白质含量的原理是什么?测定中应注意什么问题?
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