荧光PCR检测原理
荧光定量 pcr 的基本原理和步骤
荧光定量PCR的基本原理和步骤
荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测和定量DNA或RNA分子。
其基本原理是在PCR过程中加入荧光探针，通过监测荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
下面是荧光定量PCR的基本步骤：
1. 样品处理：首先需要从待检测样品中提取DNA或RNA，并进行适当的处理，例如反转录、扩增等。
2. 设计引物：根据待检测的目标序列设计特异性引物。
3. PCR反应体系的制备：将引物、荧光探针、dNTPs、PCR缓冲液等混合，制备PCR反应体系。
4. PCR反应：将样品DNA或RNA与PCR反应体系混合，进行PCR反应。
5. 荧光定量：在PCR反应过程中，荧光探针会结合到目标序列上，并通过荧光信号的产生来检测PCR产物的数量。
在荧光定量PCR中，通常采用SYBR Green或TaqMan探针来检测PCR产物的数量。
6. 数据分析：通过对荧光信号的强度进行分析，计算出样品中目标序列的数量，并进行比较和分析。
需要注意的是，在荧光定量PCR中，需要选择合适的荧光探针和荧光信号检测系统，以确保准确和可靠的结果。
此
外，为了避免PCR过程中的污染和误差，需要严格控制PCR 反应条件和操作流程。
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR（Fluorescent Quantitative PCR，qPCR）是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法，用于定量分析目标DNA或RNA的含量。
荧光定量PCR的基本原理如下：
1.引物设计：设计特异性引物，使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。
2.模板DNA或RNA的提取：从样品中提取目标DNA或RNA。
3.cDNA合成：对于RNA样品，需要首先将RNA反转录成cDNA，作为PCR 的模板。
4.Real-time PCR扩增反应：将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中，进行实时PCR扩增。
PCR反应体系中还包括核苷酸，聚合酶和缓冲液等。
5.荧光信号检测：随着PCR的进行，荧光探针被解旋成单链，释放出与之配对的荧光染料。
荧光染料产生荧光信号，信号强度与扩增产物的数量成正比。
6.荧光信号检测系统：荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号，并将其转换成数值。
7.标准曲线绘制：通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释，绘制出标准曲线。
标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。
8.样品定量：通过对样品的荧光信号强度进行测量，并使用标准曲线进行插值计算，确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点，广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。
概述荧光定量PCR技术的基本原理
概述荧光定量PCR技术的基本原理
荧光定量PCR技术是一种用于定量测量目标DNA序列数量的技术。
它基于普通PCR技术，但在PCR反应中引入了一种荧光探针，以实现对产物扩增过程的实时监测和定量测量。
实现荧光定量PCR的基本原理如下：
1. 选择适当的引物和荧光探针：引物用于特异性扩增目标DNA序列，而荧光探针用于标记并检测PCR产物的存在。
2. 引物和荧光探针的设计：引物的设计要确保特异性扩增目标DNA序列，而荧光探针通常由一个荧光染料和一个荧光淬灭器组成，荧光染料在引物与目标DNA序列结合时发荧光信号，而荧光淬灭器则抑制荧光信号。
3. PCR反应条件的设置：包括扩增温度、循环数等参数的设置，以确保高效的PCR扩增反应。
4. 实时监测PCR反应：在PCR反应过程中，荧光探针与目标DNA序列结合并发荧光信号，荧光信号的增加与PCR产物的扩增过程成正相关。
通过荧光信号的强度可以定量测量目标DNA序列的数量。
5. 分析数据：根据荧光信号的强度和扩增循环数，可以绘制荧光增幅曲线，并通过内部标准物质或标准曲线来计算目标DNA序列的浓度。
荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点，可以用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等领域。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
荧光pcr检测原理
荧光pcr检测原理
荧光PCR（Polymerase Chain Reaction）是PCR技术的一种改进，其原理是利用荧光染料标记特定的DNA序列，通过PCR过程将其扩增到足够数量后，利用特殊的仪器检测荧光信号，从而确定样本中是否存在目标DNA序列。
荧光PCR的具体操作步骤如下：
1. 设计PCR引物，其中一对引物的末端分别标记有荧光染料，如SYBR Green、FAM、HEX、ROX等。
2. 将荧光PCR反应体系中的模板DNA、引物和其他反应成分混合，进行PCR 扩增。
3. 在PCR反应过程中，如果荧光引物与样本中的目标DNA序列结合，就会发生SYBR Green绿色荧光或FAM/HEX/ROX等其他染料的荧光信号。
4. 利用特殊的实时荧光PCR仪器对PCR反应过程中的荧光信号进行实时监测和数据分析，从而确定是否存在目标DNA序列。
荧光PCR技术广泛应用于医学、生物学、环境监测等领域，可以检测病原微生物、基因突变、遗传多态性等多种生物学事件。
由于其灵敏度高、特异性强、快
速易操作等优点，成为了目前分子诊断和生物技术研究中的重要技术手段。
pcr荧光探针法原理
pcr荧光探针法原理PCR荧光探针法是一种常用的核酸分析技术，可以快速、高效地检测特定DNA序列的存在。
其原理基于PCR技术和荧光探针的特性。
首先，PCR(聚合酶链反应)是一种体外的DNA扩增技术，可以在短时间内扩增特定的DNA片段。
PCR需要一段目标DNA序列的两个引物，引物能够特异性地与目标DNA序列的两个端部相互补充，作为DNA复制的起始点。
在PCR过程中，通过一系列的温度变化来实现DNA的分离、引物的结合和扩增。
反应体系含有模板DNA、引物、四种核苷酸和聚合酶。
在适当的温度下，DNA双链解离为两条单链，形成可供扩增的单链模板。
然后，反应体系升温使引物与单链模板互补结合，形成DNA双链。
随后，反应体系再升温至合适的温度，使聚合酶在引物的引导下开始DNA的合成，形成新的DNA分子。
每个PCR循环包含多个温度变化阶段，使DNA的扩增指数级增加。
PCR荧光探针是一种特殊的寡聚核苷酸序列，分为引物、探针和信号生成物三个部分。
引物与目标DNA序列互补结合，探针结合在引物扩增产物的中间，并且包含一个荧光信号生成物。
在PCR过程中，当探针与目标DNA序列互补结合时，引物酶的活性会切割探针，释放出荧光信号。
荧光信号的强度与目标DNA序列的存在量成正比。
PCR荧光探针法可以通过检测荧光信号的强度来间接定量目标DNA序列的含量。
总结起来，PCR荧光探针法通过PCR技术的扩增作用和荧光探针的特殊设计，实现了对特定DNA序列的快速检测。
该方法具有高灵敏度、高特异性和高可靠性的特点，被广泛应用于基因表达分析、病原体检测和基因突变鉴定等领域。
荧光定量PCR法原理汇总
荧光定量PCR法原理汇总荧光定量PCR（qPCR）是一种基于聚合酶链反应（PCR）的技术，它可以定量分析DNA或RNA样本中的特定序列的数量。
与传统PCR技术相比，qPCR在PCR反应过程中使用荧光探针，可以实时监测PCR的过程，从而准确地测量样本中特定序列的起始数量。
qPCR的原理基于PCR的基本原理。
PCR是一种体外的DNA复制技术，它包括三个基本步骤：变性、退火和延伸。
在PCR过程中，DNA模板通过变性步骤被解旋为两个单链，然后通过退火步骤与引物结合。
引物是专门设计用于与目标序列的两个特定区域匹配的DNA序列。
在延伸步骤中，一个热稳定的DNA聚合酶使用含有四种不同的核苷酸（dNTPs）的反应混合物将新的DNA链合成到DNA模板的两个引物上。
在qPCR中，引入了荧光探针作为PCR反应的组成部分，以实时监测PCR过程。
荧光探针是一种特殊的DNA或RNA分子，它包含与目标序列完全互补的DNA或RNA序列，并带有荧光基团和荧光基团的一个化学修饰物。
在PCR过程中，荧光探针与目标序列的两个引物结合，并且在DNA聚合酶合成新DNA链的过程中与PCR产物结合。
qPCR反应通常包括在PCR反应混合物中加入一个可与荧光探针结合并释放荧光信号的DNA聚合酶。
当PCR在退火温度下进行时，引物与荧光探针结合，并且DNA聚合酶开始合成新的DNA链。
当DNA聚合酶遇到荧光探针时，它通过切割探针的一部分来释放荧光信号。
这个切割过程导致荧光分子由于解除荧光基团的约束而发光，从而产生一个荧光信号。
荧光信号的强度与PCR过程中目标序列数量的增加成正比。
在qPCR中，荧光信号通过一个实时检测系统进行监测和记录。
实时检测系统使用一个光学探测器读取PCR反应混合物中的荧光信号，并将其转换为可以量化的数字信号。
这个数字信号表示PCR过程中荧光信号的时间和强度变化，从而可以精确测量之前PCR反应混合物中目标序列的起始数量。
qPCR可以被广泛应用于许多领域，例如基因表达分析、病原体检测和遗传变异分析。
荧光PCR核酸检测原理
荧光PCR核酸检测原理荧光PCR核酸检测是一种基于聚合酶链式反应（PCR）技术的检测方法，它通过引入荧光探针，在PCR扩增的过程中实时检测靶标DNA 或RNA的存在与数量。
荧光PCR核酸检测原理基于PCR技术和荧光探针的特性，具有高效、准确、快速的优点，被广泛应用于基因分型、致病菌检测以及疾病诊断等领域。
一、PCR技术简介聚合酶链式反应（PCR）是一种体外扩增靶标DNA或RNA的技术，通过反复循环的DNA复制过程，将少量的模板DNA扩增到可以被检测的数量级。
PCR反应包括三个主要步骤：变性、退火和延伸，其中需要用到两个引物：前向引物和反向引物。
前向引物和反向引物会通过互补配对与靶标DNA或RNA序列结合，在适当的条件下，聚合酶将合成新的DNA链。
二、荧光探针的原理及种类荧光探针可以实时监测PCR反应过程中靶标DNA或RNA的扩增情况。
荧光探针一般包括一个引物序列和一个荧光染料。
在PCR扩增的过程中，荧光探针与靶标序列结合后，荧光染料将被释放出来并发出荧光信号。
根据荧光信号的强弱可以确定靶标序列的存在与数量。
常用的荧光探针有以下几种：1. TaqMan探针：包括一个与靶标序列互补的引物和一个含有荧光染料和荧光淬灭剂的探针。
在PCR扩增过程中，当探针与靶标序列结合时，荧光信号被释放出来，从而检测扩增情况。
2. 分子探针：包括两个与靶标序列互补的引物和一个含有荧光染料的探针。
引物结合在靶标序列的两个相邻位置上，当探针被切割释放出荧光信号时，可以确定靶标序列的存在与数量。
3. PNA探针：PNA是一种具有非天然的胺基酸结构的寡核苷酸结合物，与DNA或RNA具有高度的亲和力。
PNA探针在PCR扩增过程中结合在靶标序列上，发出荧光信号。
三、荧光PCR核酸检测的应用荧光PCR核酸检测在许多领域中得到了广泛的应用。
以下是几个典型的应用案例：1. 基因分型：荧光PCR核酸检测可以用于基因分型，识别个体间的基因差异，例如在疾病易感基因的检测中起到关键作用。
荧光定量pcr的原理和过程
荧光定量pcr的原理和过程荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的改进方法，通过引入荧光探针来实现对PCR反应的实时监测和定量分析。
荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变检测等领域，具有高灵敏度、高特异性、高准确性等优势。
荧光定量PCR的原理基本与传统PCR相同，都是通过不断复制DNA片段来扩增目标序列。
但是，荧光定量PCR在PCR反应体系中加入了特异性的荧光探针，这种探针能够与目标序列特异性结合，并在PCR反应过程中发出荧光信号。
通过实时监测荧光信号的强度，可以准确地定量PCR反应中的目标序列数量。
荧光定量PCR的过程主要包括：样品制备、引物设计、反应体系配置、PCR扩增、荧光信号检测和数据分析等步骤。
首先，样品制备是荧光定量PCR的第一步。
样品可以是DNA、RNA或cDNA等，需要根据实验的目的选择合适的样品类型，并进行样品提取和纯化。
接下来，引物设计是荧光定量PCR的关键步骤之一。
引物是用于扩增目标序列的短DNA片段，通常由两个引物组成：前向引物和反向引物。
引物的设计需要根据目标序列的特点，如长度、GC含量、特异性等进行合理选择，并使用生物信息学工具进行引物序列的合成。
然后，反应体系配置是荧光定量PCR的另一个重要步骤。
反应体系通常包括模板DNA、引物、荧光探针、核苷酸三磷酸（dNTPs）、聚合酶和缓冲液等组分。
其中，荧光探针是荧光定量PCR的关键组分，它通常由荧光染料和荧光信号抑制剂构成。
荧光染料可以与目标序列特异性结合，并在PCR反应过程中发出荧光信号；而荧光信号抑制剂可以抑制未结合的荧光染料发出的背景信号。
接着，进行PCR扩增。
PCR扩增是通过不断循环进行三个温度阶段的反应来扩增目标序列。
首先是变性阶段，将反应体系中的DNA变性为单链DNA；然后是退火阶段，使前向引物和反向引物与目标序列特异性结合；最后是延伸阶段，聚合酶在适当温度下将dNTPs加入到引物结合的DNA链上，从而合成新的DNA链。
实时定量荧光pcr原理
实时定量荧光pcr原理
实时定量荧光PCR（quantitative Real-Time PCR）是一种基于PCR技术的高效、准确且可靠的DNA分析方法。
其主要原理
是通过在PCR反应过程中实时监测DNA扩增产物的累积量，从而定量测定起始DNA模板的数量。
实时定量荧光PCR的核心是使用荧光探针的方法来定量检测PCR反应过程中的DNA扩增产物。
在PCR反应中，荧光探
针包含一个荧光染料和一个荧光素（quencher）分子。
当探针
与PCR反应中的模板DNA序列互补结合时，荧光染料与荧光素分子之间距离较远，荧光信号强度较高。
而当PCR反应进
行到延伸阶段，DNA聚合酶酶活将荧光探针的酶切位点切除，导致荧光染料与荧光素分子之间距离缩小，荧光信号强度降低。
根据荧光信号的变化情况，可以推算出PCR反应过程中DNA
扩增产物的实时累积量。
为了实现定量测定，实时定量荧光PCR还需要设置一个标准
曲线。
首先，制备一系列包含已知浓度的DNA标准品，然后
通过实时定量荧光PCR测定这些标准品的荧光信号。
根据标
准品荧光信号与其对应浓度之间的关系，构建标准曲线。
最后，通过比较待测样品的荧光信号与标准曲线，可以确定样品中的DNA起始数量。
实时定量荧光PCR在科学研究和临床诊断中具有广泛应用。
它可以用于分析基因表达水平、研究遗传变异、检测病原体等。
相比传统的定量PCR方法，实时定量荧光PCR具有灵敏度高、
精确性好、操作简便等优点，成为分子生物学领域中不可或缺的实验技术之一。
荧光定量pcr原理和步骤
荧光定量pcr原理和步骤荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，能够快速、准确地定量检测DNA或RNA的含量。
下面将介绍荧光定量PCR的原理和步骤。
荧光定量PCR的原理主要基于传统PCR技术和荧光探针技术的结合。
传统PCR通过不断复制DNA模板，使其数量呈指数增加，但并不能定量测定模板初始含量。
为了解决这一问题，qPCR引入了特定的荧光标记探针，该探针可与扩增产物特异性结合，通过荧光信号的增加来反映模板的初始数量。
荧光定量PCR的步骤如下：1. DNA模板制备：从待检测样本中提取DNA，并进行纯化处理，确保所得到的DNA质量较高。
2. 反应体系配置：根据实验需要，准备PCR反应液，包括DNA模板、引物（forward primer和reverse primer）、DNA聚合酶、核苷酸和缓冲液等。
3. 反应条件设定：根据引物序列的特性和所需扩增产物的长度，确定PCR反应的温度周期条件，包括退火温度、延伸时间和循环次数等。
4. 荧光探针设计：根据待检测序列的特点，设计合适的荧光探针，通常这些探针包括一个荧光染料和一个猪尾巴。
5. 温度循环程序：将配置好的PCR反应液放入热循环仪中，根据反应条件进行温度循环，使DNA发生退火、延伸和复性，并产生大量的扩增产物。
6. 荧光检测：热循环仪会不断读取PCR反应体系中荧光信号的变化，通过荧光强度来定量检测DNA的含量。
荧光信号的强度与模板DNA的初始含量成正比。
7. 数据分析：通过计算荧光信号和模板DNA的标准曲线，可以得到待检测样本中目标序列的初始含量。
8. 结果解读：根据数据分析的结果，可确定待检测样本中目标DNA的绝对或相对含量。
荧光定量PCR凭借其高度敏感和快速准确的特点，已广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传病筛查等领域。
随着技术的不断发展，荧光定量PCR将在医学诊断和疾病预测中发挥更加重要的作用。
实时荧光定量pcr检测原理
实时荧光定量pcr检测原理实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。
这种方法通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。
Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
实时荧光定量PCR的基本原理是利用DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性，在DNA合成过程中检测荧光信号的变化。
当DNA聚合酶与特定荧光染料标记的DNA引物结合时，荧光染料会被标记在引物的3’端。
在PCR反应过程中，每当DNA聚合酶添加一个核苷酸到引物3’端时，聚合酶的外切酶活性将荧光染料从引物上切割下来，释放出荧光。
通过实时检测荧光信号的变化，可以实时监测DNA的合成过程。
实时荧光定量PCR的定量原理是利用PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。
在PCR扩增的指数时期，随着循环次数的增加，DNA产物的量呈指数增长。
在这个阶段，每个循环的DNA产物量与上一个循环的DNA产物量成比例。
因此，通过实时检测荧光信号的变化，可以确定PCR进程中的DNA产物量。
由于每个模板的起始拷贝数不同，因此不同模板的Ct值也不同。
通过比较不同模板的Ct值，可以确定模板的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR具有许多优点，如高灵敏度、高特异性和高自动化程度。
它可以用于多种类型的样本检测，包括血液、组织、细胞培养液等。
此外，实时荧光定量PCR还可以用于基因表达分析、突变检测和病原体鉴定等应用。
实时荧光定量PCR是一种非常有用的技术，可以用于多种类型的样本检测和分析。
它的基本原理是利用DNA聚合酶的外切酶活性和荧光染料标记的引物来实时监测DNA的合成过程。
通过比较不同模板的Ct值，可以确定模板的起始拷贝数，从而实现定量分析。
实时荧光定量PCR原理及应用
实时荧光定量PCR原理及应用一、原理：1.荧光探针原理：a. TaqMan探针：TaqMan探针是由小分子荧光染料和一个捕获目标序列的DNA探针构成。
在PCR过程中，TaqMan探针会结合到特定的目标序列上，当DNA聚合酶在PCR反应中扩增特定序列时，探针被加性外切酶活性所降解，导致荧光信号逐渐降低，通过荧光信号的减弱来量化目标DNA的数量。
b. SYBR Green探针：SYBR Green探针是一种可以与双链DNA特异性结合的染料，当SYBR Green与PCR产物结合时，荧光信号增加。
通过测量荧光信号的增加来量化目标DNA的数量。
c. Molecular Beacons：Molecular Beacons是由在末端带有荧光分子和淬灭荧光的猝灭体构成的。
在PCR过程中，当Molecular Beacons与目标序列匹配时，荧光信号释放，通过测量荧光信号的释放来量化目标DNA的数量。
2.PCR反应原理：a.变性：将含有目标DNA序列的模板DNA样品与引物和荧光探针混合，加热至高温，使DNA双链解除成两股单链DNA。
b.引物结合：将反应体温度降低，引物结合到目标DNA序列的特定区域，并与模板DNA进行互补组装。
c.扩增：在DNA聚合酶的作用下，引物在模板上逐渐沿着DNA链延伸，产生新的DNA片段。
每一轮PCR循环结束后，荧光信号会相应地增加。
二、应用：1.目标基因表达分析：可以用实时荧光定量PCR测定特定目标基因的表达水平，从而研究基因的功能、调控机制或者生理功能的变化。
2.病原体检测：实时荧光定量PCR可以检测和定量各种病原体，例如病毒、细菌、真菌等。
常见的应用包括检测呼吸道病原体、性传播疾病病原体、食物中污染的细菌等。
3.肿瘤检测：实时荧光定量PCR可以用于肿瘤相关标志物的检测，帮助早期筛查和诊断肿瘤。
4.遗传突变检测：可以通过实时荧光定量PCR检测人类基因中的突变位点，提供遗传病检测和个体基因组分析的支持。
荧光pcr仪的工作原理
荧光pcr仪的工作原理荧光PCR仪是一种用于检测和分析核酸序列的仪器，其工作原理主要涉及PCR 反应和荧光探针技术。
PCR（聚合酶链式反应）是一种通过特定的温度循环，扩增DNA模板的方法。
PCR反应需要模板DNA，引物（primer）、DNA聚合酶和四种核苷酸。
PCR 反应的主要步骤包括变性、退火和延伸。
荧光PCR仪通过控制仪器内部温度循环，使PCR反应在高温变性、低温退火和中温延伸之间进行。
荧光探针技术是一种通过荧光信号检测并定量目标DNA的方法。
在PCR反应中引入特定的荧光探针，探针一般由荧光染料和荧光猝灭剂构成。
当探针与目标DNA序列结合时，荧光染料会被激活并发出荧光信号。
荧光PCR仪通过激光器激发染料，并通过光学系统将荧光信号收集、放大和检测。
具体的荧光PCR仪工作原理如下：1. 反应液配置：根据实验设计，将PCR反应所需的引物、模板DNA、核苷酸和PCR反应缓冲液按照一定配比混合。
可以根据实验需要向反应液中加入荧光探针。
2. 温度循环程序设置：设置PCR反应的温度循环程序。
温度循环程序包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应体系的温度会升至95-98，使DNA双链解开成为单链。
在退火步骤中，温度降至50-65，引物与模板DNA 序列特异性结合。
在延伸步骤中，温度升至72，DNA聚合酶进行延伸合成新的DNA链。
3. 实时荧光信号检测：荧光PCR仪通过激光器产生激发光束，激发荧光探针上的染料，使其产生荧光信号。
荧光信号会经过光学系统收集、过滤并进行放大，之后通过探测器转换成电信号。
电信号经过放大和采集后，会得到一个荧光强度值。
4. 数据采集和分析：荧光PCR仪会将每个阶段的荧光强度值记录下来。
根据实验需要，仪器通常会在每一个温度循环的特定时间点进行数据采集。
数据采集后，可以利用计算机进行数据分析和曲线绘制。
根据荧光信号的变化趋势，可以评估PCR反应的结果和目标DNA的数量。
总结起来，荧光PCR仪的工作原理涉及PCR反应和荧光探针技术。
荧光pcr原理
荧光pcr原理
荧光PCR是一种改进的聚合酶链反应技术，利用荧光探针实
时监测PCR反应过程中的增长情况。
它的原理如下：
首先，准备适当的DNA模板和引物。
DNA模板是待扩增的目标序列，引物则是用于扩增目标序列的一对短DNA片段。
接下来，在PCR反应体系中加入一种名为荧光探针的特殊探针。
这个荧光探针由两部分组成：一个与目标序列互补的
DNA序列和一个带有荧光信号发射器和荧光信号阻隔器的夹
双螺旋结构。
在初始状态下，探针的荧光信号发射器和信号阻隔器彼此靠得很近，导致荧光信号被信号阻隔器抑制，探针处于不发光的状态。
然后，将PCR反应混合液置于荧光PCR仪中开始扩增。
在PCR反应过程中，引物通过与DNA模板互补结合，产生一个
新的DNA链。
当反应体系达到适当的温度时，荧光探针结合
到新合成的DNA链上，并被聚合酶酶解。
聚合酶酶解过程中，会使得荧光信号发射器与信号阻隔器分离，荧光信号发射器获得活性，开始产生荧光信号。
荧光PCR仪会实时监测PCR反应过程中荧光信号的增长情况，并将其转化为荧光强度曲线。
根据荧光信号的增长情况，可以推测PCR反应中靶标序列的起始模板数量。
此外，荧光PCR
还可以结合软件分析来定量目标序列的起始数量。
总结来说，荧光PCR利用荧光探针实时监测PCR反应过程中
的增长情况，通过测量荧光信号的强度来推断目标序列的起始模板数量，为基因检测、病毒检测等领域提供了一种有效的技术手段。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析荧光定量PCR（qPCR）是一种广泛应用于分子生物学的实验技术，可以对DNA或RNA目标序列进行定量分析。
本文将介绍荧光定量PCR的原理和结果分析，包括实验步骤、PCR曲线的解读以及测定目标序列的相对表达水平等。
一、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR技术主要基于PCR的原理，即通过模板DNA的逐渐扩增，来定量分析起始模板DNA或RNA的数量。
在实验中，荧光定量PCR通常使用DNA合成酶来合成目标序列的拷贝，通过在每个扩增周期后测量荧光信号的变化，来定量反应的进程。
1.准备试剂和反应体系：包括引物、合成的目标序列等。
2.PCR反应：在热循环PCR仪中，通过一系列不同温度的循环，使模板DNA的扩增合成逐渐发生。
3.荧光信号检测：通过在每个循环后侦测荧光信号的变化，来定量PCR反应的进程和模板DNA的数量。
4.数据分析：通过荧光信号的变化来计算模板DNA或RNA的相对表达水平。
二、荧光定量PCR结果分析1.PCR曲线的解读在荧光定量PCR反应中，通常会绘制荧光信号与PCR循环数的关系图即PCR曲线。
根据PCR曲线的形状，可以得到以下几个关键结果：(1)阈值循环数（Ct）：阈值循环数是PCR曲线上荧光信号超过背景信号的循环数。
Ct值越小，目标序列的初始模板数量越多。
(2) 扩增效率（Efficiency）：扩增效率可以通过计算PCR曲线斜率的反向值得到，通常表达为百分比。
扩增效率越高，说明PCR反应的有效性越好。
(3)Ct值偏移：Ct值偏移是指实验组与对照组（如阴性对照或基准组）之间的Ct值差异。
Ct值偏移的大小可以用于计算相对表达水平。
2.相对表达水平的测定相对表达水平是指在不同实验条件下，目标序列在不同组织或细胞中的表达量相对比较和定量分析。
常用的计算方法有：(1)∆∆Ct法：通过计算实验组与对照组的相对Ct值差异来获得相对表达水平。
∆∆Ct值越大，目标序列的表达水平差异越明显。
荧光定量PCR原理及实验步骤
荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
荧光定量pcr原理
荧光定量pcr原理荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）是一种可以在实验室中快速准确测量DNA的技术，它使用荧光来检测和计算特定DNA序列的定量，在生物学和医学研究中极其重要。
本文旨在深入讨论荧光定量PCR的原理，以及它是如何在分子生物学研究中发挥作用。
一、荧光定量PCR原理荧光定量PCR（qPCR）是一种检测DNA的技术，它使用荧光探针和背景抑制剂来检测DNA片段的存在。
qPCR使用DNA复制的反应来放大特定的DNA序列，并使用荧光探针来检测这些序列。
荧光定量PCR的过程包括三个主要阶段：反应制备、反应启动和反应完成。
在反应制备阶段，实验室工作人员将模板DNA、反转录酶（RT）、DNA聚合酶（Taq）、荧光探针和背景抑制剂放入PCR反应管中。
在反应启动阶段，Taq DNA聚合酶将反应温度升至95摄氏度以上，以启动DNA复制。
在复制过程中，荧光探针捕获复制产物，并发出荧光信号，使其可以被检测到。
在反应完成阶段，实验室工作人员将反应温度降至60摄氏度以上，以终止DNA复制。
在这个阶段，实验室工作人员可以使用特定设备（如实时PCR仪或qPCR仪）测量DNA复制产物的定量，以确定模板DNA的定量。
二、荧光定量PCR的应用荧光定量PCR在分子生物学研究中发挥着重要作用，它可以用来精确测量模板DNA的定量，以及从细胞或组织样本中快速鉴定出特定的基因。
它还可以用来研究不同细胞和组织中特定基因的表达水平，以及研究基因突变、转录因子的活性等问题。
荧光定量PCR在病毒感染的检测中也发挥着重要作用，它可以快速确定病毒的存在，以及病毒在体内的活跃度。
例如，可以使用qPCR快速检测COVID-19病毒，从而帮助诊断和控制疾病的传播。
此外，荧光定量PCR还可以用于在肿瘤组织中鉴定具有致癌潜能的基因突变，并帮助确定患者是否需要接受放疗或化疗治疗。
qPCR技术也可以用于检测细菌和真菌感染，以及检测抗药性菌株，帮助确定最佳治疗方案。
荧光PCR原理
荧光PCR原理1．荧光染料荧光基团通常各自拥有单一的光吸收峰.在光的刺激下，荧光基团吸收光的能量后通常以三种方式释放出能量：1) 光能许多荧光基团吸收光能后仍旧以光能形式释放能量，并且发射光的峰值大于吸收峰。
比如荧光染料Fam的光吸收峰为490nm，而发射峰为530nm.2) 热能某些荧光基团吸收光能后，能量转换为热量扩散到环境中,如Dabcyl。
3) 转移给临近的分子当临近的分子满足发生能量转移的要求时，能量从荧光基团传递到临近的分子。
2．荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET）当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时,能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移（FRET），实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。
3．荧光PCR荧光PCR不同于其他PCR的地方在于PCR过程中利用荧光染料在光刺激下释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，荧光信号变量与扩增产物变量成正比，并通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析以达到对原始模板量定量的目的。
主要有以下几类：1) 荧光染料直接结合扩增产物如SYBB Green I,类似于EB，能特异性地区分单双链DNA,只与双链DNA结合。
2) 荧光标记引物对引物进行荧光标记从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物.3) 荧光标记探针常规引物以外，引入荧光基团标记的特异性探针，探针可与模板发生一对一结合关系。
a) Taqman双标记探针（TaqmanTM 5—nuclease assay)b）分子信标探针(Molecular beacon TM）c）LightCycler TM杂交双探针荧光标记探针的最大优点在于其特异性非常强,避免了非特异性扩增造成的假阳性信号。
匹基生物开发的荧光PCR检测试剂盒主要基于Taqman技术（TaqmanTM 5—nuclease assay）:除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针.该探针的5端标记一个荧光基团,3标记另一个荧光基团。
荧光pcr法和电泳
荧光pcr法和电泳荧光PCR法和电泳引言PCR技术是一种重要的基因分析技术，它能够扩增DNA，从而使得检测更加敏感。
荧光PCR法和电泳是PCR技术中常用的两种方法。
本文将详细介绍荧光PCR法和电泳的原理、应用以及优缺点。
一、荧光PCR法1.1 原理荧光PCR法是一种利用荧光探针检测扩增产物的方法。
在扩增过程中，引物结合到模板DNA上，并且在DNA聚合酶的作用下进行扩增。
同时，荧光探针也会结合到目标区域上，并且与DNA结合后发生融合，导致发射出特定波长的荧光信号。
这个信号可以被检测器捕获并且分析。
1.2 应用荧光PCR法被广泛应用于病毒、细菌等微生物检测以及基因突变、SNP等基因分型等领域。
例如，在乙型肝炎病毒检测中，可以利用荧光探针来检测病毒载量；在基因突变分析中，可以利用荧光探针来检测SNP等基因多态性。
1.3 优缺点荧光PCR法具有高灵敏度、高特异性、高通量等优点。
同时，荧光PCR法可以进行实时检测，从而减少了实验时间和成本。
但是，荧光PCR法的探针设计比较困难，而且需要使用昂贵的仪器。
二、电泳2.1 原理电泳是一种利用电场对DNA分子进行分离的方法。
在电泳过程中，DNA分子会在电场作用下向阳极或阴极移动，移动速度与DNA分子大小成反比。
因此，在一定时间内，不同大小的DNA分子会被分离开来，并且可以通过染色剂进行可视化。
2.2 应用电泳被广泛应用于DNA测序、基因型鉴定、病原体检测等领域。
例如，在DNA测序中，可以利用电泳将不同长度的DNA片段分离出来，并且进行序列测定；在基因型鉴定中，可以利用电泳将不同基因型的PCR产物分离开来，并且通过染色剂进行可视化。
2.3 优缺点电泳具有简单、易操作、成本低等优点。
同时，电泳可以进行大规模样品分析，从而适用于高通量分析。
但是，电泳需要使用大量的试剂和设备，并且对于低浓度的DNA样品灵敏度较低。
结论荧光PCR法和电泳是PCR技术中常用的两种方法。
荧光PCR法具有高灵敏度、高特异性、高通量等优点，适用于微生物检测和基因分型等领域；而电泳具有简单、易操作、成本低等优点，适用于DNA测序和基因型鉴定等领域。
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实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。
其特点有：(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。
(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。
Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。
实时荧光定量PCR技术的基本原理在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质有其特定的波长。
仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。
并且引入一个——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR 循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。
一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。
通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。
方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R²＞0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量。
实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。
实时荧光定量PCR技术的应用1. 基因工程研究领域①基因表达研究：对β地中海贫血症患者β与γ珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解β地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据。
②转基因研究：利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因老鼠接合性。
该方法为45个转基因动物的同型结合及异质结合提供了明确的鉴定结果。
通过实时定量PCR检测，同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。
这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大的用途。
③单核苷酸多态性（SNP）及突变分析：实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基于两条探针和基因组的不稳定性。
基因突变基于两条探针，一条探针横跨突变点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交。
两条探针用两种不同的发光基团标记。
如靶序列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体得稳定性，从而降低其熔解温度（Tm）。
这样便可对突变和多态性进行分析。
2. 医学研究领域①病原体检测：由于实时荧光定量PCR方法可靠性和重复性好，并且操作简便、快速、结果判断客观，目前，人们用此方法对人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原体的检测。
荧光定量PCR问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。
②药物疗效考核：利用实时荧光定量PCR技术检测临床样品中与抗药性相关的基因的表达。
结果证明，实时荧光定量PCR系统是定量检测抗药基因表达的可靠方法，应用这种技术可以预测化疗将引起的反应。
③肿瘤基因检测：肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。
目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因、肿瘤MDRI 基因、白血病WTI基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。
随着与肿瘤相关的新基因的不断发现。
荧光定量PCR 技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。
3. 其他领域用实时荧光定量PCR方法对免疫组分进行分析是其应用的重要方面。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
检测方法1.SYBRGreenⅠ法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）2.TaqMan探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
服务流程1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；6.正式定量实验：对所有样品上机检测；7.实验结果和数据分析，形成报告。
收费标准优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复）Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数（如图1所示）。
1. 荧光阈值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-152. Ct值与起始模板的关系每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。
现将其原理简述如下：1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
而新型TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。
3. 分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。
PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。
1．传统定量PCR方法简介1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。
上游引物用荧光标记，下游引物不标记。
在模板扩增的同时，内标也被扩增。
在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。
在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。
扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。
常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
2．内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。
同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。
加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。
但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3．内标对定量PCR的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。
但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。
也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。
因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。