(完整版)甲基化检测方法(亚硫酸氢盐修饰后测序法)

甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法）第一部分基因组DNA的提取。

这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。

DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。

因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。

否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。

两者均于-20度保存。

验证提取DNA的纯度的方法有二：1：紫外分光光度计计算OD比值；2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。

1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；3：42℃水浴30min；水浴期间配制：4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。

这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。

PH一定要准确为5.0。

加520ul至上述水浴后溶液中。

6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。

7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。

8：50℃避光水浴16h。

一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am 以后收，时间上很合适。

这一步细节：1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。

2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。

3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。

第三部分修饰后DNA纯化回收EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。

1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。

2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3ml-5ml注射器。

将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。

加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。

4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。

此为洗涤步骤。

5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。

此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。

6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。

7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul。

3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。

4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。

5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。

其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。

不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。

6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。

有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。

并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。

如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小时，也是可以的，再短就不敢发表意见了）7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。

不必吸净。

8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。

轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。

离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。

此为洗涤步骤，共2次。

9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul-30ulDDW，溶解沉淀。

至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。

10：-20℃保存DNA溶液。

此步细节：1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。

2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。

3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。

此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。

因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。

第四部分修饰后DNA用于PCR这一步也没有悬念。

我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。

如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。

如果不是这样，还是参考文献更好些。

首先查阅SCI 分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。

查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。

然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。

用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。

我也是按此行事，算比较顺利。

2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。

我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液。

有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。

如何选择，可以根据自己的情况。

初作者还是用好一点的酶。

3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。

其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。

一般和文献报道差别不大。

只是扩增片断特异性的问题。

建议根据文献。

4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。

5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。

不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。

第五部分PCR产物的凝胶回收这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。

把切下来的胶按说明书操作即可。

几个细节：1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。

凝胶浓度1%-2%均可。

2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。

3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。

4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。

第六部分PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）15ul体系T-easy 1ulLigase 1ul2xbuffer 7.5ulDNA 5.5ul4度，过夜。

2：连接产物的转化1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；3）42度，90秒钟；4）冰上2分钟；5）800ul LB培养基；6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）先涂：X-gar 35ulIPTG 25ul后涂：混悬液过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。

3：取白斑，划种于新板上新板：先涂：X-gar 35ulIPTG 25ul然后于板底划出分区，进行标记。

根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。

针头挑白斑划2道于板上相应区域内。

37度，孵箱过夜。

4：联系测序公司送测序。

一般一个克隆在35-45元。

这一部分的细节：1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。

甲基特异性的PCR扩增（MS-PCR）示意图。

DNA经重亚硫酸盐处理后，以处理后的产物作为模板，加入甲基化特异性的引物（primerⅠ）或非甲基化的引物（primerⅡ），进行特异性的扩增（如图所示），只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。

这种方法的优点是：1.避免了使用限制性内切酶及其后续相关问题；2.敏感性高；可用于石蜡包埋样本[12]；缺点是：1.要预先知道待测片段DNA的序列；2.引物设计至关重要；3.若待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡，则检测时较为复杂；4.这种方法只能作定性研究，即只能明确是否存在甲基化；若要求定量，则需用其他的方法进行进一步检测；5.存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性。