辛酸硫酸铵纯化抗体

辛酸-硫酸铵法从人血清中纯化IgG
一、 实验目的
1初步掌握从血清中提取纯化 IgG 的方法步骤。

2、了解辛酸-硫酸铵法纯化IgG 的原理。

二、 实验原理 辛酸-硫酸铵法分两步进行。

第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下
可沉淀血清或腹水中的白蛋白或其他非 Ig
蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将 Ig 沉淀下来,
操作步骤如图3-10所示。

经SDS-PAGE 电泳检测能得到电泳纯度较高的
Ig 。

_______ ►沉淀(白蛋白和其他ir igG 蛋白质)
匕消液(igG)
硫酸钱沉淀
T
沉淀(IgG)
T
溶解沉淀
图3—竹辛酸一硫酸谖法从血漬中纯化IqG 操作流程
三、仪器、原料和试剂
1、仪器
磁力搅拌器、离心机、低温冰柜。

2、原料 抗血清(兔抗鸡血清)。

血清或腹水
丫酸沉淀
3、试剂
(1) 乙酸-乙酸钠缓冲液：60mmol/L, pH4.0。

(2) 10X磷酸盐-NaCI 缓冲液(PBS : 100mmol/L PBS pH7.4。

称NaCI 80g、Ns fe HPO12H2O 29g、KCl 2g、KHPQ 2g,加蒸馏水溶解，加入100mmoI/L EDTA 20ml，用去离子水定容至1000ml 。

(3) 透析液10mmol/L Na 2HPQKH2PQ缓冲液，含15mmol/L NaCl，pH7.2。

(4) 硫酸铵。

⑸辛酸。

四、操作步骤
1、抗血清用4倍体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，用0.1mol/L NaQH调至血清稀释液为pH4.5。

2、室温下边搅拌(磁力搅拌器或电功搅拌器)，边缓慢滴加辛酸( 25ml/L血清稀释液)，
滴加完后继续搅拌30min。

3、离心(10000r/min , 30min)，收集上清夜，弃去沉淀。

4、上清液用多层纱布过滤。

5、按1/10 体积加入10X PBS 用5mol/L NaQH 调至PH7.4。

6、上清液4 C预冷，计算溶液总体积，在4C按277g/L加入硫酸铵粉沫(45%包和度)，边
加边搅拌，加完后继续搅拌30min。

7、离心(5000r/min , 15min))，弃去上清液。

收集沉淀。

8、沉淀用少量透析液溶解(一般为血清体积的1/10 ),透析并更换两次透析液或用Sephadex G-50脱盐。

9、Ig溶液在50〜55C水浴中加热20min，离心(5000r/min , 20min),上清液-20 C保存或冻干保存。