辛酸硫酸铵纯化抗体
辛酸硫酸铵法提纯鸡抗新城疫病毒(NDV)IgG效果观察
Ｏ 瑚） 样 品稀释倍数。 Ｄ ×
关键词 ： 鸡新城 疫病毒 ； Ｇ Ｓ Ｓ Ｐ Ｇ ； ； 白浓度 ； Ｉ ； — Ａ Ｅ 纯度 蛋 ｇ Ｄ 效价
中图分类号 ：８８３ 文献标识码 ： 文章编号 ： ０ —８８ （ｏ ８ ｏ ． ０ ６— ２ ￥ ５ ．１ Ａ １ １ ５ １２ ｏ ） ４ ０ ８ ０ ０
Ｅ岱ｅ ｔｏ 近 ｃ ｔ ｎ ｏ ｇ ａ ａ ｎ ｔＮｅ ａ ｔｅ Ｄｉｅ ｓ ｒ ｓ ｉ ｉｋｅ ｃ ｆＰ叽 ａ ｉ ｆＩ Ｇ ｇ ｉ ｓ ｗｃ ｓ ｌ ｓ ａ ｅ Ｖｉｕ ｎ Ｃｈ ｃ ｎ ｂｙ ｏ Ｍ ｅ ｈ ｄ ｏ ｐｒ ｌｃ Ａｃ ｄ Ａｍｍ ｏ Ｕｎ ｕ ｆ ｔ ｅ ｉ ｔ ｔ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｃａ ｙ ｉ ｉ ｎｉ ｌＳ ｌａ ｅ Ｐｒ ｃｐｉａ ｉ ｏ
Ｓ ａ ＨＩＸｉｏ—ｙ ｎ， ＵＯ ｉｎ ， Ａ ａ Ｇ Ｌ ａ ｇ Ｗ ＮＧ ｎ—ｈ ｉ ＭＡ ｉ ｉ Ｙａ ｕ， Ｈａ —ｌ ’
（ｈｎｉ ｇｉ ｌ ｒ ｎｖｒｉ ，ａ ｕ ３８ １Ｃ ｉａ Ｓ ａｘ ｒ ｕ ｕａ Ｕ ｉｅｓｙ Ｔｉ ００ ，ｈｎ ） Ａ ｃｔ ｌ ｔ ｇ０
Ｉ ｇ Ｇ广泛应用于生命科学 的许多领域 ， 特别是用于 医学和兽医学上的诊断和治疗。Ｉ ｇ Ｇ主要来源于动物血
ｒｎ １００ｇ ａ ， ０ 离心３ ｉ； ｉ ０ ０ｒｎ取上清 ， １１ 体积 １ Ｐ Ｓ ａ 加 ／０ ０ Ｂ， Ｘ 调ｐ Ｈ至７４ ．。按每毫升混合液加入硫酸铵液 ０２７ｇ４ ．７ ， ℃搅拌 ３ ｉ， ０ 离心 １ ｉ。取沉淀溶于少量 ０ ０ｒｎ５ ０ｇ ａ ０ ５ｒｎ ａ ． ０５ｍ ｌＬ氯化钠溶液 ， ０ ｏ ／ 置相 同溶液透析 ４ ， ６ｈ ８ｈ 每 更 换透析液。 １４ 抗体效价的测定 ． 采用血凝抑制试验 检 测抗体 纯化前 、 后的效价 ， 样品均设 ３ 个重复。 １５ 血清及 Ｇ的蛋白浓度测定 ． 采用紫外分光光度 计法 ， ｕ Ｊ用 Ｖ一 ２０ ００型紫外分光光度计测定蛋 白质的 浓度 ， 公式 为 Ｉ ｍ ／ Ｌ ｇ Ｇ（ ｇ ｍ ）＝（ ．５ＸＯ ２ —０ ７ １ ４ Ｄ８ ０ ．４Ｘ
辛酸_硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用_陈丹
５ 结束语 脂质筏结构被人们认识以来， 其确切的生理功能仍然
ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｂｄｏｍａｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｔｏ ｔｈｅ ａｐｉｃａｌ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ， １９９２， ６８（ ３） ： ５３３－ ５４４． ［７］ ＢＲＯＷＮ Ｄ Ａ， ＬＯＮＤＯＮ Ｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ
［９］ ＤＡＮＩＥＬＳＥＮ Ｅ Ｍ．Ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｂｒｕｓｈ ｂｏｒｄｅｒｓ： ａｔｙｐｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， ２００３， １６１７（ １－ ２） ： １－ ９．
［１３］ 杨 福 愉 ．生 物 膜 结 构 研 究 的 一 些 进 展［Ｊ］．生 物 化 学 与 生 物 物 理 进
有待大量研究， 特别是对质膜微囊和脂筏介导的内吞途径
ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ ｒｉｃｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒａｆｔｓ ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２０００， ２７５（ ２３） ：
的分子细节了解， 而脂筏与微生物相互作用为这方面的研 究提供了一个非常好的实验模型。通过对病原微生物如何
１７２２１－ １７２２４． ［８］ ＳＩＬＶＩＵＳ Ｊ Ｒ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ： ｌｅｓｓｏｎｓ
ｆｒｏｍ ｌｉｐｉｄ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， ２００３， １６１０（ ２） ：
利用脂筏介导其内吞及内吞入胞后在胞内的转运的研究，
抗体的纯化
一、原理在酸性条件下( pH4.5)，非1gG的蛋白成份(包括白蛋白，部分Ig)，能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸/硫酸铵法比硫酸铵法能够获得更高纯度的IgG。
二、材料与方法1、材料（1）动物腹水（2）辛酸(caprylic acid，CA)，化学纯（3）硫酸铵，分析纯（4）SPA Sepharose 4FF亲合层析柱2、操作方法（1）蛋白含量测定紫外分光光度法测样品在波长260nm，280nm处的I及收光度(A 260, A 280)，蛋白含量按以下公式计算蛋白量（g/L）=(1.45* A 280- 0.74* A 260)*稀释倍数（2）主要步骤①腹水滤纸过滤去沉淀和脂质，滤液用4倍体积60mmo1/ L醋酸缓冲液(pH4.0)稀释后，用Na0H调，PH值至4.5。
②逐滴加入辛酸(终浓度25u1/ml)，室温h搅拌30分钟后，以6000-8000r/min.离心30分钟，收集上清液。
③上清液经滤纸过滤2次，将滤液与10*PBS(0.lmol/L，pH7.4按10:1比例混合，调pH至7.4,置冰浴冷至40度。
④每毫升上述混合液加0.2778固体硫酸钱，40度搅拌30分钟，以4000-6000r/min离心巧一20分钟，将沉淀溶于少量YBS，透析，测蛋白含量，冻存。
（3）硫酸铵沉淀法按常规方法将腹水分别经50%，33%饱和度硫酸铵沉淀。
（4）亲合层析取提取的样品，用0.01lmol/ L Na2HPO4 (pH7.4)透析，洗脱使样品中IgG结合于层析柱上，再用0. lmol/ L柠檬酸(pH4.0)洗脱，收集洗脱液即获纯化IgG。
（5）SDS—PAGE电泳鉴定抗体纯度（6）间接ELISA法测定抗体效价用sIgA包被酶标板，按常规方法测抗体效价。
处理细胞，包被酶标板，测定抗体效价。
（7）得率和回收率的计算每毫升原腹水中提取的抗体量即为得率(Y field，g/ L );提取所得抗体量与原腹水中抗体量之百分比即为回收率(Recovery，%)。
辛酸硫酸铵纯化方法
所需溶液配制：1.0.06mol/L pH=4.8醋酸盐缓冲液：无水醋酸钠0.29g，冰醋酸0.141mL，纯水定容至100mL。
2.2mol/L氢氧化钠溶液：16g氢氧化钠固体用于200ml纯水中。
3.2mol/L盐酸溶液：取33m L36.4%的浓盐酸定容至200mL纯水中。
4.0.1mol/L PBS缓冲液：80.0 NaCl，KCl 2.0g，Na2HPO4· 12H2O 29.0g，KH2PO4 2.0g，加超纯水定容至1L。
单克隆抗体采用辛酸-硫酸铵方法纯化，具体步骤如下：（1）将腹水从-20°C冰箱拿出室温解冻。
腹水用双层滤纸过滤，初步除去杂质、脂肪及细胞碎片。
4°C,12000r/min，离心15min，收集上清，弃沉淀。
精确定量腹水体积。
（2）一份体积的腹水与2-4份体积的醋酸盐缓冲液磁力搅拌混匀，用2mol/L HCL 调PH至4.5-4.8。
（3）磁力搅拌下缓慢加入正辛酸，33μL/mL腹水，加完后室温磁力搅拌半小时，后置4°C静置2h以上。
（4）4°C ,12000r/min，离心5min，收集上清，双层滤纸过滤，收集滤液。
（5）量取滤液体积，加入1/10体积的0.1M pH=7.4 的PBS,用2mol/L NaOH（记录NaOH 体积）调pH至7.4。
（6）将上清冰浴预冷，加硫酸铵固体至0.277g/mL，边加边搅拌，并于30min内加完，置4°C过夜。
（7）12000r/min，离心15min，弃上清。
用一定体积的0.01mol/LPBS溶解沉淀。
用PB 透析两天后换0.01mol/LPBS 透析两天。
收集透析液，12000r/min，离心15min，取上清，置-20°C预冻后真空冻干成粉保存。
张道宏师姐版本：用1/10原腹水体积的0.01mol/L pH值7.4 PBS溶解沉淀；对0.01mol/L pH值7.4的PBS透析一天，离心去掉不溶杂质，用纯水进行透析，优球蛋白析出后离心收集澄清抗体溶液，置于-20°C预冻；冻干保存。
应用辛酸硫酸胺法提取小鼠腹水和血清中的IgG抗体
应用辛酸硫酸胺法提取小鼠腹水和血清中的IgG抗体
白丽;钱金;王晶
【期刊名称】《大理学院学报（医学版）》
【年(卷),期】2000(009)004
【摘要】目的:从小鼠腹水和血清中纯化IgG抗体.方法:首先用辛酸沉淀小鼠腹水和血清中的非免疫球蛋白,然后用固体硫酸胺提取抗人T和B细胞白血病单克隆抗体(IgG1和Ig2b)和多克隆IgG抗体.结果:经SDS-PAGE和活细胞免疫荧光法鉴定,获得了纯度高、活性好的抗体,腹水中单抗的回收率达80%以上.结论:本方法是一种简单、价廉且有效的纯化小鼠腹水和血清IgG抗体的方法.
【总页数】2页(P3-4)
【作者】白丽;钱金;王晶
【作者单位】大理医学院微生物学及免疫学教研室云南大理 671000;大理医学院微生物学及免疫学教研室云南大理 671000;大理医学院微生物学及免疫学教研室云南大理 671000
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11
【相关文献】
1.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用 [J], 陈丹;孙广瑞;柳增善
2.改良的紫外荧光光度计法检测小鼠血清中多巴胺β羟化酶活性的方法 [J], 刘林林;孙宝胜;杨巍;刘晓岚
3.ELISA法检测囊尾蚴虫病IgG抗体中弱阳性质控血清的制备及应用 [J], 杨柳莹;孙黎;赵仪;陈曦阳;王晓凤;凌攀
4.应用辛酸硫酸铵法提取纯化兔IgG [J], 马贵军;韩素娟;剡根强;周霞
5.辛酸-硫酸铵法在纯化血清旋毛虫特异性IgG抗体中的应用 [J], 刘俊琴;申丽洁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。
如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。
引起蛋白质沉淀的主要方法有(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。
辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。
辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。
(二) 试剂和器材1. 试剂(1) 小鼠腹水。
(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。
称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。
冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。
配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。
(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。
贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100mlB 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml应用液: 取上述 A 液59ml 与B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至4.80.(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H2028.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至100Om1(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
详细介绍抗体的分离纯化
（一蛋）白盐质在析水的溶基液本中原的理溶解度是由蛋白质亲水基团、与水形成
水化膜的程度、以及所带有电荷的情况决定的。
当中性盐加入蛋白质溶液中，盐离子对水分子的亲和力大于
蛋白质，于是减弱甚至消除蛋白质分子周围的水化膜。同时， 盐离子所带的电荷中和部分蛋白质分子表面电荷，更加导致 其溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
CaCl2 /ml混匀 15 min并10 000 ×g离心
沉淀脂蛋白
乙烯聚合物
加入3% (w/v)后搅拌4 小时,并17000×g离心 可用于高脂蛋白的 样品,例如腹水 可以选择右旋硫糖苷
PEG(Mr > 4000) 最多到20%
血浆蛋白
丙酮(冷的)
聚乙烯亚胺 硫化精蛋白 硫酸链霉素
在0摄氏度最多到 80%,在最高转速离 心后收集 小球
这些列在下表中。
选择滤孔大小
滤膜通常的孔径大小 1um 0.45um 0.22um
色谱层析柱中柱材的颗粒大小 90um或者更大 30或者40um 3，10，15um，或者需要更加干净的样品时采用
注意：
• 用一个预跑来检测目标蛋白的收率，因为有时候样品可能被滤膜 表面非特异性吸附。
• 过滤器可能会饱和——就是滤膜有一个特定的载量，因此在建立一 个纯化步骤时，需要考虑这些。
优点： ①重现性好，简单易行； ②分辨力强，回收率高； ③具有多孔性，表面积大、交换容量大； ④具有亲水性，对大分子的吸附不牢固，层析条件温和，不致引起
21
物质变性或失活。
12/12/2016
一、 基本原理
离子交换法的固定相是离子 交换剂； 若担体带有正电荷，可吸附 着负电荷分子，则为阴离子 交换法；不带净电荷的分子 ，以及阳离子则直接流出， 不会被吸附上去。 这些被固相单体所吸附的离 子，统称为 counter ion（抗 衡离子），因为其电荷与担 体上的电荷相反 (counter 是 "相反" 的意思)
抗体分离纯化技术研究进展
但 不 论 用 何 种 方 法所 制备 的 抗 体 ， 都 必 须在 后 期 选 择 合 适 的 分
离 纯 化 方 法 对 抗 体 进 行 分 离纯 化 ， 以满 足 不 同要 求 。
抗 体 的纯 化 有 两 个 原 则 ： （ １ ） 在 确 定 抗 体 的 具 体 纯 化 方 法 之前 ， 先 明确纯化后抗体的用途 ， 不 同用 途 的 抗 体 ， 纯 化 要 求 也 不 同。（ ２ ） 从 多克隆抗体 、 单 克 隆 抗 体 到 基 因 工 程 抗 体 及 其 他
迄 今 抗 体 制 备 技 术 的发 展 大 致 分 为 三 个 阶 段 ： （ １ ） １ ８ ９ ０年
Ｂ ｅ ｈ ｒ ｉ ｎ ｇ和 Ｋｉ ｔ ａ ｓ ａ ｔ ｏ发 现 白喉 抗 毒 素 （ 抗 白喉 毒 素 抗 体 ） ， 开 始
了 以抗 原 免 疫 动 物 来 获 得 多 克 隆 抗 体 （ Ｐ Ａｂ ｓ ） 即 抗 血 清 的 途
径； （ ２ ） １ ９ ７ ５年 Ｋｏ ｈ ｌ ｅ ｒ 和 Ｍｉ ｌ ｓ ｒ ｅ ｉ ｎ创 建 杂 交 瘤 技 术 制 备 单 克 隆
抗体 （ Ｍｃ Ａｂ ） ； （ ３ ） １ ９ ８ ４年 Ｍｏ ｒ ｒ ｉ ｓ ｏ ｎ Ｓ Ｌ 以基 因 工 程 方 法 制 备
基 因工 程 抗 体 （ ＧＥ Ａｂ ） 。根 据 制 备 方 法 抗 体 可 分 为 三 大 类 型 ：
的基 础 上结 合 有 机 溶 剂 沉 淀 法 发 展 而 来 的 。 辛 酸 沉 淀 法 是 在 酸 性 条 件下 （ ｐ Ｈ４ ． ５ ） 往血 清 中加入 一定 量 短链脂 肪 酸 辛 酸， 使 血 浆 蛋 白中 的 清 蛋 白 、 ａ及 球 蛋 白成 分 沉 淀 ， 取 Ｉ ｇ Ｇ 成 分 为 主 的上 清 液 ， 再 经 硫 酸 胺 沉 淀 。该 法 仅 需 两 步 沉 淀 分 离 ， 过 程简便 ， 成 本 低 廉 。 陈丹 等 ＿ ３ 分 别采用 辛酸法 ， 硫 酸 铵 法 和 辛 酸一 硫酸铵联合 沉淀法纯化抗体 。结果 表明 ， 联 合 使 用 辛 酸一 硫 酸 铵 较 单 纯 的辛 酸 法 或 硫 酸 铵 法 效 果 好 。 目前 ， 多 抗 以亲 和 层
抗体纯化方法汇总与比较
抗体纯化方法汇总与比较
1. 概论
制备出效价高，特异性强，稳定性好的抗体是免疫学实验取得成功的基础，抗体质量的好坏直接影响着研究者研究的成败，不同的免疫学实验方法（如ELISA，IHC，IP，ICC,SDS-PAGE, WB等）对抗体的效价，浓度和纯度有不同的要求。
我们知道，一般免疫血清中含有特异性抗体和非特异性抗体，血清蛋白以及其他各种杂蛋白等，在制备特异性抗体过程中当抗体的效价达到实验预期之后，我们所制备的抗体的纯度关键取决于所选择的纯化方法。
下面就一一介绍常用抗体纯化方法及其相关原理。
免疫球蛋白主要有5种，轻链和重链的组成也有较大差异。
其结构如下图所示：
各类免疫球蛋白有不同的亚型，下图展示人免疫球蛋白各亚型的理化性质：
2. 沉淀法
硫酸铵/辛酸沉淀法是纯化抗体最传统的方法之一，被广泛用于血清和腹水抗体的浓缩和粗纯，此方法可大规模粗纯抗体，但纯化后纯度不高，还需配合其它方法继续纯化。
通常是将饱和硫酸加入血清或腹水中，将抗体沉淀下来，然后在溶解沉淀继续下一步的纯化。
辛酸沉淀抗体通常要先将腹水或血清的pH调至4.8，然后缓慢的滴加辛酸，是蛋白沉淀，抗体在上清中，上清继续下一步的纯化。
3. 离子交换层析
离子交换层析也常用于抗体的纯化，通量大，工业上用离子交换层析成本低，主要用于除去非抗体蛋白，及用亲和层析纯化时混入的Protein A/G等亲和填料脱离的配基，内毒素的去除等。
离子交换纯化时，根据抗体的pI选择合适的离子交换类型，在pI未知时可以分别用阴阳离子交换填料去试验。
27抗体的纯化——沉淀法
抗体的纯化方法很多,最为常用的为以下四种方法，基于工业化生产工艺开发的规模化生产方法要比这些复杂得多，甚至多个纯化策略联合使用，有兴趣的科研工作者可以查阅相关的文献。
1）沉淀法：利用抗体蛋白疏水性不同，提高盐离子浓度蛋白沉淀，常用的沉淀方法有硫酸铵沉淀法、辛酸沉淀法、辛酸-硫酸铵沉淀法、优球蛋白沉淀法和聚乙二醇沉淀法；这类纯化各有各的优缺点，往往对某些亚型抗体有偏爱性。
2）广谱亲和纯化：这类纯化主要是利用金黄色葡萄球菌ProteinA /G蛋白可以特异性与抗体的Fc结合的原理进行的。
3）抗原特异性纯化：将特异性的抗原偶联到琼脂糖凝胶等固相载体上，纯化方法与ProteinA /G纯化方法相同。
4）离子交换法：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50）为弱碱性阳离子交换剂。
用NaOH 将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。
血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。
pH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。
因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG。
1. (NH4)2SO4沉淀法纯化抗体1.1 饱和硫酸铵配制：无菌去离子水加入足量硫酸铵之后，加热到65℃以上，在磁力搅拌器上搅拌溶解至底部仍有未溶解的硫酸铵，待冷却后，取上清滤纸过滤。
1.2 样品（血清或腹水），12,000rpm离心30min（4℃），除去细胞碎片，保留上清液并测量体积。
1.3 边搅拌边缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液到上清液中，溶液放在磁力搅拌器上室温搅拌6h或搅拌过夜（4℃），使蛋白质充分沉淀。
1.4 蛋白溶液12,000rpm离心30min（4℃），沉淀用原样品体积的PBS溶液重悬，重悬后12,000rpm离心10min（4℃），上清转移到一个新离心管。
辛酸-硫酸铵法纯化细胞培养上清中单克隆抗体的条件优化
［ 关键 词 ］ 辛酸－ 硫酸铵法 ； ｍ Ａ ｂ ； 纯化 ； 正交实验
常 用 的单 克 隆抗 体 （ ｍｏ ｎ ｏ ｃ ｌ ｏ ｎ ａ ｌ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ，ｍ Ａ ｂ ）
离， Ｅ ， ３ ｏ ｍ ｉ ｎ ； 重复 ２ ７ ７ ｇ ／ Ｌ饱 和度硫 酸铵沉淀 １次 ， 终 沉淀溶
辛 酸一 硫 酸铵 法纯 化 细胞 培 养上 清 中单 克 隆抗 体 的条 件 优 化
刘若 飞 ，张 萃 ，葛如 意 ，陈 玉琼 ，刘晓 波 （ 广东药学院微生物学与免疫学教研室， 广东 Ｆ － ｋ ＇ ｑ ｌ ５ １ ０ ０ ０ ６ ）
［ 中图分类号 ］ Ｒ ３ ９ ２ ． １ １ ，Ｑ ８ １ ３ ． ２ ［ 文献标志码 ］ Ａ
１ 材料 和 方法
１ ． １ 材料 本 室建立 的 ３株 鼠源性 杂交 瘤细胞 含血 清培 养
辛酸终浓度分别 为（ １ ５ 、２ ０ 、２ ５ 、３ ０ 、３ ５ ） Ｌ ／ ｍ Ｌ的条件 下进 行实验 。实验重复 ３次 。 １ ． ２ ． ５ 硫 酸铵 溶液饱 和度单 因素 实验 实 验条件 设定 为上
量抗 体 丢 失 ，为 ｍＡ ｂ的 进 一 步 开 发 利 用 提 供 实 验 进行实验 。所有实 验重复 ３次。 条件 。 １ ． ２ ． ４ 辛 酸终浓度单 因素 实验 实验条 件设定为 上清一 缓冲
液体积 比为 １ ： １ ， 硫 酸铵饱 和度为 ２ ４３ ｇ ／ Ｌ ，ｐ Ｈ为 ６ ． ８ ， 在 正
清－ 缓 冲液体 积比为 １ ： １ ， 辛酸终浓度为 ２ ０ Ｌ ／ ｍ Ｌ ， ｐ Ｈ为６ ． ８ ，
在硫酸铵溶液 饱和 度分 别为 （ ２ ０ ９ 、２ ４３ 、 ２ ７ １ 、３ １ ３ 、３ ５ １ ）ｇ ／ Ｌ
单克隆抗体纯化
单克隆抗体的纯化一、简介抗体或免疫球蛋白（Ig）是B 淋巴细胞针对暴露于外源抗原后产生的独特的可溶性糖蛋白。
通常可从血浆（占总蛋白20%），血清，腹水，细胞培养基，蛋黄，植物提取物或细菌和酵母培养物中分离得到抗体。
常用于纯化的材料主要以腹水和细胞培养上清为主。
单抗纯化方式常用的技术：DEAE 离子交换层析柱，凝胶过滤法和亲和层析。
二、技术方法及原理（一）单抗粗提1.硫酸铵沉淀法（1）原理：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，故可利用不同盐浓度来沉淀不同蛋白质，硫酸铵因其溶解度大，温度系数小，不易使蛋白质变性而应用广泛。
（2）方法：①若样本体积较小，可配置100%饱和硫酸铵（375 g 硫酸铵加入500 mL 的蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出晶体任其留在瓶中，用氨水或者硫酸调节pH 至7.0）；若体积较大直接使用固体硫酸铵，根据表格（1）称取所需质量。
②盐析：缓慢向腹水中加入一定量的饱和硫酸铵溶液（或者缓慢加入固体硫酸铵，0.277 mg/mL 终浓度为45%），缓慢搅拌30 min ，室温静置2 h ，再5000 rpm 离心25 min ，去上清，沉淀用PBS 溶解。
③脱盐：主要有柱层析和透析法a）柱层析：将上述样品过Sephadex G-25 层析柱，以PBS 或Tris-HCl 缓冲液为平衡液和洗脱液，第一个蛋白峰即为脱盐后的抗体溶液；b）透析法：将样品装入处理后的透析袋（2% NaHCO3，1mM EDTA 煮沸10 min，蒸馏水洗净）中，置换缓冲溶液为PBS 或Tris-HCl 缓冲液，期间更换4-5 次透析液；2.辛酸-硫酸铵沉淀法（1）适用范围：该法简单易行，适用于提纯IgG1 和IgG2b ，但对IgG3 和IgA 的回收率及纯化效果差。
（2）试剂：0.06M 醋酸缓冲溶液（pH5.0），1M HCl，辛酸，1xPBS ，1M NaOH；（3）方法：在预处理后的腹水中加入2 倍体积的0.06M 醋酸缓冲溶液（pH5.0），按比例加入辛酸（11uL 辛酸/mL 腹水），室温搅拌下逐滴加入，30min 内加完，4℃静置2 h ，10000 rpm 离心30 min ，弃沉淀，上清过滤（经尼龙筛125uM），加入1/10 的1xPBS，再用1M NaOH 调节pH 至7.2；4℃下加入饱和硫酸铵至45% 饱和度，静置1h ，10000 rpm 离心30 min ，弃上清；沉淀用PBS 溶解；3.优球蛋白沉淀法（1）适用范围：适用于提纯IgG3 和IgM 的提取，不会影响抗体活性；复溶缓冲溶液（1M NaCl ，0. 1M Tris-HCl ，pH8.0）（2）试剂：NaCl ，CaCl2，（3）方法：取一定量的预处理后腹水，先后加入NaCl（终浓度0.2M）和CaCl2 （终浓度25mM），可看到纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，透析或层析过滤，缓冲体系为去离子水，超高速离心30min；弃上清，沉淀用1M NaCl，0. 1M Tris-HCl，pH8.0 溶液复溶，再经过透析或层析过滤更换缓冲体系；（二）亲和层析法1.基本原理：基因工程改造的protein A 和protein G 能特异性结合哺乳动物IgG 的Fc 区段，将protein A 和protein G 结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG 及其亚类与片段纯化出来。
常用抗体纯化方法
常用抗体纯化方法抗体纯化是分离和纯化单克隆或多克隆抗体的方法，以获得高纯度和高活性的抗体样品。
常用的抗体纯化方法包括亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤法、亲和电泳法、硫酸铵沉淀法等等。
下面将对常用的抗体纯化方法进行详细介绍。
1.亲和层析法：亲和层析法是一种基于抗原-抗体互作原理的分离纯化方法。
先制备含有抗原的固相材料，如亲和树脂或亲和膜，然后将抗体样品与这些固相材料接触，使抗体与抗原结合，其他非特异性蛋白质被洗脱，最后用适当的溶液洗脱目标抗体。
这种方法可以用于多克隆或单克隆抗体的纯化。
2.离子交换层析法：离子交换层析法是利用样品中的离子性蛋白质与离子交换树脂（正离子交换或负离子交换）之间的相互作用进行分离的方法。
通过改变洗脱缓冲液的离子强度和pH值，可以将目标抗体从离子交换树脂上洗脱下来。
这种方法适用于广泛的抗体样品，可以快速纯化大量的抗体。
3.凝胶过滤法：凝胶过滤法是一种分子大小分离纯化方法，适用于分离分子量较大的抗体。
基本原理是通过调节凝胶孔隙大小，使大分子如抗体可以滞留在凝胶中，而小分子如低分子量杂质则可以通过凝胶孔隙逸出。
这种方法操作简单，纯化速度快，适合于大量抗体的纯化。
4.亲和电泳法：亲和电泳法是利用抗体在电场中迁移速度与分子特性有关的原理进行纯化的方法。
可以通过改变电场强度、溶液pH值和溶液离子浓度等参数来调节抗体的迁移速度，从而实现抗体的纯化。
亲和电泳法适用于纯化低丰度目标抗体和快速分离纯化。
5.硫酸铵沉淀法：硫酸铵沉淀法是利用硫酸铵的沉淀作用将目标抗体从混合物中分离出来的方法。
通过调节溶液的硫酸铵饱和度和沉淀时间，可以得到纯度较高的抗体样品。
该方法简单、快速，适用于大量抗体的纯化。
总的来说，抗体纯化方法有很多种，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，可以根据具体的实验要求和抗体性质选择最适合的纯化方法。
同时，也可以结合两种或多种方法进行联合纯化，以获得更高纯度和活性的抗体。
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体??辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。
如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。
引起蛋白质沉淀的主要方法有(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。
辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。
辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。
(二) 试剂和器材1. 试剂(1) 小鼠腹水。
(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。
称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。
冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。
配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。
(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。
贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100mlB 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml应用液: 取上述 A 液59ml 与 B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至 4.80.(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H20 28.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至100Om1(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。
三种方法纯化相思子毒素单抗的比较
三种方法纯化相思子毒素单抗的比较罗胜军;王哲;李小兵;魏东;马惠海;徐慧娟;姜涛;刘国文;谢光洪;高英杰【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2006(27)11【摘要】采用不同的方法纯化相思子毒素单抗,寻求一种效果好、操作简便的纯化方法.采用硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法和硫酸铵-蛋白A亲和层析法三种方法分离纯化相思子毒素单抗,并采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)、BCA蛋白检测试剂盒(BCA Protein Assay Kit)和双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)对纯化产物进行相对分子质量、浓度、纯度、回收率及免疫活性的鉴定.结果表明,纯化后单抗的回收率以硫酸铵沉淀法及辛酸-硫酸铵法较高,硫酸铵-蛋白A亲和层析法较低;产物纯度以硫酸铵-蛋白A亲和层析法和辛酸-硫酸铵法较高,硫酸铵沉淀法较差;不同方法纯化后的单抗活性未见降低.【总页数】4页(P72-75)【作者】罗胜军;王哲;李小兵;魏东;马惠海;徐慧娟;姜涛;刘国文;谢光洪;高英杰【作者单位】吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062;吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062;吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062;吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062;吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062;吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062;吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062;吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062;吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062;吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062【正文语种】中文【中图分类】S859.87【相关文献】1.经济植物DNA提取与纯化的三种方法比较 [J], 孙晓东;李小丹;郭晏海;李军2.相思子毒素单克隆抗体的制备纯化及鉴定 [J], 张立营;赵怀龙;马凤龙;傅兴伦;孙英姿;高波3.体外纯化乳鼠雪旺细胞的三种方法比较 [J], 田林强;陈钢;杨彩虹;郭风劲;陈安民;陈少坚;孙凯4.A型肉毒毒素Hc基因的原核表达、纯化及单抗的制备 [J], 李秀山;刘选明;赵李剑;高姗;王景林5.相思子毒素-a的纯化及鉴定 [J], 李小兵;谢光洪;周昌芳;张志刚;宋文学;周晓翠;张乃生;王兴龙;高宏伟;王哲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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辛酸-硫酸铵法从人血清中纯化IgG
一、 实验目的
1初步掌握从血清中提取纯化 IgG 的方法步骤。
2、了解辛酸-硫酸铵法纯化IgG 的原理。
二、 实验原理 辛酸-硫酸铵法分两步进行。
第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下
可沉淀血清或腹水中的白蛋白或其他非 Ig
蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将 Ig 沉淀下来,
操作步骤如图3-10所示。
经SDS-PAGE 电泳检测能得到电泳纯度较高的
Ig 。
_______ ►沉淀(白蛋白和其他ir igG 蛋白质)
匕消液(igG)
硫酸钱沉淀
T
沉淀(IgG)
T
溶解沉淀
图3—竹辛酸一硫酸谖法从血漬中纯化IqG 操作流程
三、仪器、原料和试剂
1、仪器
磁力搅拌器、离心机、低温冰柜。
2、原料 抗血清(兔抗鸡血清)。
血清或腹水
丫酸沉淀
3、试剂
(1) 乙酸-乙酸钠缓冲液：60mmol/L, pH4.0。
(2) 10X磷酸盐-NaCI 缓冲液(PBS : 100mmol/L PBS pH7.4。
称NaCI 80g、Ns fe HPO12H2O 29g、KCl 2g、KHPQ 2g,加蒸馏水溶解，加入100mmoI/L EDTA 20ml，用去离子水定容至1000ml 。
(3) 透析液10mmol/L Na 2HPQKH2PQ缓冲液，含15mmol/L NaCl，pH7.2。
(4) 硫酸铵。
⑸辛酸。
四、操作步骤
1、抗血清用4倍体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，用0.1mol/L NaQH调至血清稀释液为pH4.5。
2、室温下边搅拌(磁力搅拌器或电功搅拌器)，边缓慢滴加辛酸( 25ml/L血清稀释液)，
滴加完后继续搅拌30min。
3、离心(10000r/min , 30min)，收集上清夜，弃去沉淀。
4、上清液用多层纱布过滤。
5、按1/10 体积加入10X PBS 用5mol/L NaQH 调至PH7.4。
6、上清液4 C预冷，计算溶液总体积，在4C按277g/L加入硫酸铵粉沫(45%包和度)，边
加边搅拌，加完后继续搅拌30min。
7、离心(5000r/min , 15min))，弃去上清液。
收集沉淀。
8、沉淀用少量透析液溶解(一般为血清体积的1/10 ),透析并更换两次透析液或用Sephadex G-50脱盐。
9、Ig溶液在50〜55C水浴中加热20min，离心(5000r/min , 20min),上清液-20 C保存或冻干保存。