线粒体的提取与纯化
动物线粒体DNA提取的原理和方法
动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲 刘彦群 鲁 成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室 重庆 400716)摘 要 从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。
关键词 线粒体 线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。
它是细胞进行氧化磷酸化的场所。
线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。
线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。
由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。
动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。
进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。
线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。
线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。
线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。
其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。
线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。
锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。
线粒体研究思路及方法
线粒体研究思路及方法1.引言1.1 概述线粒体是细胞中的一个重要细胞器，它是细胞内的“动力中心”，对于维持细胞的正常功能起着至关重要的作用。
随着科学技术的不断进步，对线粒体的研究也日趋深入。
了解线粒体的研究思路和方法对于揭示其功能、生理和病理过程具有重要意义。
线粒体的研究思路主要包括传统的研究思路和新兴的研究思路。
传统的研究思路主要依赖于细胞学、遗传学和生物化学等基础科学的方法和技术，通过对线粒体的形态、结构和功能进行观察和分析，来揭示其在细胞代谢、能量供应和细胞信号传导等方面的作用机制。
然而，传统方法存在着技术手段有限、观察分析精度不高等缺点，难以全面深入地研究线粒体。
随着新兴技术的发展，包括基因工程、蛋白质组学和转化技术在内的新方法和新工具为线粒体研究提供了更多的可能性。
通过基因工程技术可以对特定线粒体相关基因进行敲除、过表达、突变等处理，从而研究其对线粒体功能的影响。
蛋白质组学技术可以高通量地鉴定和定量线粒体蛋白，进一步揭示线粒体功能的组成和变化。
转化技术可以将外源基因导入线粒体，从而实现对线粒体的定位和操控。
除了研究思路的创新，线粒体的研究方法也在不断发展。
细胞培养方法可以提供大量的线粒体样本，为线粒体的研究提供了可靠的实验材料。
而分离纯化方法则可以将线粒体与其他细胞组分分离开来，方便对线粒体进行更深入的研究和分析。
综上所述，线粒体的研究思路和方法在不断地革新和发展中。
传统思路和新兴思路的结合，以及不断更新的研究方法为我们揭示线粒体的奥秘提供了更好的途径和手段。
未来的研究将继续深入探究线粒体的生理功能和相关疾病的发生机制，为健康和疾病治疗提供更有效的技术和策略。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以按照以下方式编写：文章结构本文按照以下结构进行组织：引言、正文和结论。
引言部分分为概述、文章结构和目的。
正文分为线粒体研究思路和线粒体研究方法两个部分。
结论部分包括总结研究思路和展望未来研究方向。
适用于线粒体基因组测序的高纯度线粒体DNA提取和鉴定方法优化
适用于线粒体基因组测序的高纯度线粒体DNA提取和鉴定方法优化作者：李君朱嘉晋邓雨萍吴文鹤来源：《中国现代医生》2022年第04期[摘要] 目的优化线粒体DNA（mtDNA）提取和纯度鉴定方法以满足线粒体基因组测序的要求。
方法利用简化的蔗糖密度梯度离心法、DNA酶Ⅰ并结合质粒提取试剂盒提取纯化mtDNA、尽量降低核DNA（nDNA）污染的可能。
获得的mtDNA经NanoDrop检测、琼脂糖凝胶电泳和荧光定量PCR绝对定量法测定nDNA/mtDNA拷贝数比值等鉴定其纯度。
结果从小鼠肝脏和大脑组织中提取纯化得到mtDNA产率分别为311.7 μg/g和59.1 μg/g，其A260/280均介于1.8～2.0，A260/230浓度均大于2.0，荧光定量PCR绝对定量法测定nDNA/mtDNA拷贝数比值均低于0.005%。
结论本研究优化了mtDNA提取和鉴定方法，得到的高纯度mtDNA 适用于后续线粒体基因组测序等分子生物学研究。
[关键词] 线粒体DNA;提取;纯化;核DNA[中图分类号] R394.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2022）04-0040-04[Abstract] Objective To optimize mitochondrial DNA （mtDNA） extraction and purity identification methods to meet the requirements of mitochondrial genome sequencing. Methods Simplified sucrose density gradient centrifugation， DNase I， and plasmid extraction kit were used to extract and purify mtDNA and minimize the possibility of nuclear DNA （nDNA） contamination. The purity of the obtained mtDNA was determined by NanoDrop detection， agarose gel electrophoresis， and determination of nDNA/mtDNA copy number ratio by fluorescence quantitative PCR absolute quantitative method. Results The yields of mtDNA extracted and purified from mouse liver and brain tissues were 311.7 μg/g and 59.1 μg/g， respectively. The A260/280 ranged from 1.8 to 2.0， and the A260/230 concentration was greater than that of 2.0. The ratio of nDNA/mtDNA copy number determined by fluorescence quantitative PCR absolute quantitative method was lower than 0.005%. Conclusion This study optimizes the mtDNA extraction and identification methods， and the high purity mtDNA obtained is suitable for subsequent mitochondrial genome sequencing and other molecular biology research.[Key words] Mitochondrial DNA; Extraction; Purification; Nuclear DNA随着测序技术的快速蓬勃发展，获取线粒体基因组序列变得更为容易[1]，如何高效分离和纯化线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）而避免核DNA（nuclear DNA，nDNA）的污染是线粒体基因组测序及后续序列分析的关键[2]。
线粒体DNA的提取方法
A buffer: 10 mmol/L Tris-HCL ， pH 7.4 ； 500 mmol/L ； 20 mmol/LEDTA；0.2%BSA；0.2%β-mercaptoethanol B buffer: 10 mmol/L Tris-HCL ，pH 7.4；600 mmol/L sucrose; 20 mmol/L EDTA
实验原理
1、4000rpm 离心可以沉淀分离出叶绿体、 细胞核和组织碎片，12, 000 rpm离心才可 沉淀分离线粒体。 2、用蔗糖浓度梯度纯化线粒体，不同浓度 蔗糖的缓冲液因比重不同而分层。
3、SDS可以从植物各样组织类型中释放和 结合的细胞核酸。
仪器设备： Apparatus:
研钵和研杵；冷冻离心机；过滤装置（漏 斗，玻棒） pH 计；移液器；水浴箱； 50mL 离心管；2；1.5 mL离心管。 mortar (cold); Centrifuged; filter; pH meter; water bath boiler; 50mL centrifugal tube; eppendorf tube .
2.线粒体在37℃下裂解4 h后(或60℃下裂解40min)，往裂解液中加 入等体积的酚-氯仿异戊醇，轻轻混匀，静置5 m in。在12 000rpm 4℃下离心 10 min。吸出上清，再用酚 - 氯仿 / 异戊醇抽提，吸取上 清，加入?RNase,在37℃下保温30m in后,加入酚-氯仿/异戊醇抽提， 吸出上清，再用氯仿 /异戊醇抽提。吸出上清 ,加入1/10 体积的乙 酸钠和两倍体积的异丙醇，置- 20 ℃ 2 h 或过夜。 2. The material were lysed in 2% SDS, constantly shaking the mixture. If the tissue coalesces, warm the tubes in a 60℃water bath for 40 min (or in a 37℃water bath for 4h) until the organelles are fully lysed. Shake the mixture intensively for 10min with an equal volume of equilibrated phenol. Centrifuge for 10min at 12,000 rpm. Remove the upper aqueous phase. The RNase treatment was done at 37℃ for 30minutes. Then add phenol∶chloroform∶isoamyl alcohol （ 25∶24∶1 ） . Repeat the procedure. Add chloroform∶isoamyl alcohol （24∶1）. Repeat the procedure. Precipitate the DNA with 1/10 vol of 3M NaAC and 2 vol of isopropanol at -20℃ for 2-3h or overnight.
线粒体dna分离试剂盒原理
线粒体dna分离试剂盒原理全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：线粒体DNA（mtDNA）是细胞内的一种特殊DNA，主要存在于细胞的线粒体中。
它是由母亲遗传给子代的，与细胞核DNA有着不同的特征和功能。
线粒体DNA在细胞的能量产生过程中起到关键作用，因此对其进行研究对于理解细胞功能和疾病的发生具有重要意义。
为了研究线粒体DNA，需要将其从细胞中分离出来。
而线粒体DNA分离试剂盒就是为了这个目的而设计的。
它包含了借助化学试剂和特殊操作步骤将线粒体DNA从细胞中提取出来的各种试剂和工具。
线粒体DNA分离试剂盒的原理主要可以分为以下几个步骤：第一步：细胞裂解细胞裂解是线粒体DNA分离过程中的第一步。
通过加入裂解缓冲液和蛋白酶，使细胞膜和细胞核膜失去完整性，从而释放出细胞内的线粒体和线粒体DNA。
第二步：线粒体分离在细胞裂解后，线粒体需要从细胞中分离出来。
这一步通常需要使用离心过程，通过调节不同离心速度和时间来沉淀线粒体，从而与其他细胞器分离。
第三步：DNA提取在成功分离出纯净的线粒体后，就需要进行DNA提取。
通过加入相应的试剂和离心操作，将线粒体DNA从线粒体中提取出来。
这一步需要注意避免DNA的降解和污染。
第四步：DNA纯化提取出的线粒体DNA可能还含有其他杂质，需要进行纯化操作。
通过加入适当的试剂和离心操作，将线粒体DNA纯化成较纯的形式，以便后续的实验操作。
线粒体DNA分离试剂盒的原理就是通过上述步骤将线粒体DNA 从细胞中提取出来，并经过分离、提取和纯化等操作得到纯净的线粒体DNA样品，以供进一步的实验研究。
线粒体DNA在人类疾病的研究中具有重要的应用价值。
许多遗传性疾病和退行性疾病都与线粒体DNA的突变和功能异常有关，因此通过研究线粒体DNA可以更好地理解这些疾病的发生机制，并为临床诊断和治疗提供新的思路和方法。
总的来说，线粒体DNA分离试剂盒的原理是通过一系列化学试剂和操作步骤将线粒体DNA从细胞中提取出来并进行纯化，为线粒体DNA的研究提供了重要的技术支持和工具。
线粒体蛋白组学流程
线粒体蛋白组学流程
线粒体蛋白组学研究流程主要包括以下几个步骤：
1. 线粒体分离纯化：首先从生物样本中分离纯化线粒体，常用方法包括超速离心、密度梯度离心等。
2. 蛋白提取：对纯化的线粒体进行裂解，提取其中的蛋白质，确保充分溶解而不破坏蛋白结构。
3. 蛋白酶解：将提取的蛋白酶解成肽段，便于后续质谱分析。
4. 质谱分析：将酶解产物通过液相色谱与质谱联用技术（LC-MS/MS）进行定性和定量分析。
5. 数据处理与分析：通过生物信息学方法解析质谱数据，鉴定线粒体中的蛋白质种类及其含量变化，构建线粒体蛋白组图谱。
6. 功能注释与验证：对鉴定出的蛋白质进行功能注释，探究其在生理病理过程中的作用，并可能通过实验验证其功能。
简而言之，线粒体蛋白组学通过分离纯化、酶解、质谱检测和数据分析等步骤，系统研究线粒体内蛋白质的组成和变化规律。
线粒体dna分离试剂盒原理
线粒体dna分离试剂盒原理全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：线粒体DNA分离试剂盒原理是通过一系列化学反应和物理方法将细胞中的线粒体成功分离出来，进而提取其中的DNA。
线粒体DNA是细胞中的一个重要组成部分，它负责细胞能量代谢的调控，对细胞的正常功能发挥起着至关重要的作用。
分离线粒体DNA对于研究细胞的功能及疾病的发生机制具有重要意义。
线粒体DNA分离试剂盒原理主要包括以下几个步骤：细胞溶解。
在进行线粒体DNA的分离之前，首先需要将细胞溶解，使得线粒体能够从细胞内部被释放出来。
通常使用含有细胞膜破裂酶的缓冲液进行细胞溶解，破坏细胞膜结构，释放出细胞内的线粒体。
线粒体富集。
在细胞溶解后，线粒体和其他细胞器混合在一起，需要通过质量差异将线粒体富集起来。
这一步可以利用超速离心对细胞提取物进行离心分离，线粒体在特定离心速度下沉降速度比较快，因此可以富集到下沉的沉淀物中。
然后，DNA提取。
在线粒体获得富集后，接下来需要进行DNA的提取。
通过添加蛋白酶、盐溶液等进行线粒体膜的破裂，释放出线粒体内的DNA。
然后使用乙醇沉淀法或硅胶柱法将DNA分离出来，并通过离心将DNA沉淀下来。
纯化和检测。
分离出的线粒体DNA往往还会存在一定程度的杂质，需要进行纯化处理。
通过特定的柱式层析或凝胶电泳等方法进行DNA 的纯化，去除掉余留的蛋白质、RNA等杂质。
通过比色法或荧光定量等方法检测DNA的浓度和纯度，以确保获得的线粒体DNA能够用于后续的实验研究或分析。
线粒体DNA分离试剂盒原理是通过一系列化学反应和物理方法将细胞中的线粒体成功分离出来，提取其中的DNA，并进行纯化和检测，为后续的研究工作提供可靠的实验材料。
通过这一技术手段，研究人员可以更加深入地了解细胞内线粒体的功能及其在疾病发生中的作用，为疾病的诊断和治疗提供更多的理论依据。
【2000字】第二篇示例：线粒体DNA（mitochondrial DNA，简称mtDNA）是线粒体内含有的一种特殊的DNA，其具有独特的特性和功能。
叶绿体、线粒体的提取
泡桐叶绿体和线粒体的提取与分离一、试验目的：1、将泡桐叶片中的叶绿体和线粒体提取出来。
2、掌握植物叶片中叶绿体和线粒体提取与分离的基本技术。
3、学习蔗糖沉淀差速离心法和差速离心法提取线粒体的方法。
二、实验材料与仪器：实验材料：泡桐新鲜叶片。
实验试剂：蒸馏水；液氮；缓冲液A（50 mmo l/L Tr is,，25 mmo l /L EDTA，1.25 mo l/L N aC l ，10 mmo l/Lβ-巯基乙醇, ψ=0. 1% (W /V ) BSA (牛血清蛋白) , ψ= 2% (W /V) CTAB, 10 g /L PVP, pH = 8. 0）；缓冲液B (Tris2HCl 0.105 mol/ L, 蔗糖0.15 mol/ L, EDTA 0.1005 mol/ L, BSA 0.11% , 巯基乙醇0.11%, pH =7.15)；缓冲液C( Tris2HCl 0.105 mol/ L, 蔗糖0.13 mol/L, MgCl2 0.101 mol/ L, pH 7.15)；缓冲液D( 0. 2 mol/ L 蔗糖、0. 3mol/ L 甘露醇、50 mol/ L Tris2Cl、1 mol/ L EDTA、0. 1% BSA 、0. 6% PVP、0. 1% B2巯基乙醇,pH 7. 5)；缓冲液E( 蔗糖0. 3 mol/ L、50mol/ L T ris2Cl, pH 7. 5)；缓冲液F( 50 mol/ LTris2Cl、0. 3 mol/ L 甘露醇、0. 2 mol/ L 蔗糖、0. 1% BSA、0. 6% PVP, pH = 7. 5)；纱布等。
试验仪器：研钵，研磨棒；离心管（250ml）；高速冷冻离心机；移液枪；高速组织捣碎器等三、试验步骤：1、叶绿体的提取与分离(1) 称取新鲜泡桐叶片50 ~ 100 g, , 暗处理12小时，蒸馏水洗干净在液氮中保存3 h以上, 以最快速度磨成粉末, 然后用6层无菌纱布过滤, 收集滤液, 弃渣。
线粒体DNA的提取方法.
线粒体DNA的提取方法
Protocol for Extracting Mitochondria DNA
实验目的 从植物组织提取高纯度线粒体 DNA
实验原理
1、4000rpm 离心可以沉淀分离出叶绿体、 细胞核和组织碎片，12, 000 rpm离心才可 沉淀分离线粒体。 2、用蔗糖浓度梯度纯化线粒体，不同浓度 蔗糖的缓冲液因比重不同而分层。
3、SDS可以从植物各样组织类型中释放和 结合的细胞核酸。
仪器设备： Apparatus:
研钵和研杵；冷冻离心机；过滤装置（漏 斗，玻棒） pH 计；移液器；水浴箱； 50mL 离心管；2；1.5 mL离心管。 mortar (cold); Centrifuged; filter; pH meter; water bath boiler; 50mL centrifugal tube; eppendorf tube .
5.弃上清，沉淀中加入0.1 mL/g FW 的缓冲液A，离心 管 底 部 再 缓 缓 加 入 0.2 mL/g FW 的 缓 冲 液 B ， 12 000rpm离心20 min，所得沉淀即为纯化的线粒体 Re-suspend the organelle pellet with a soft paintbrus in minimal volume of A buffer (0. 1 mL/g FW), B-buffer were added slowly to the tube bottom making a final concentration 0.2mL/g FW of material again. Collect the organelle pellets by centrifugation, 12,000rpm, for 20 min. Keep the pellet at -20℃ or lyse it at once Keep the pellet at -20℃ or lyse it at once
线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内唯一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今一直是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或万转/分离心机。
2.组织捣碎机或匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布（尼龙布）、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器（氧极普测试系统）。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl（0.05M，pH7.2）缓冲液。
3.磷酸缓冲液（0.2M，Ph7.2）。
4.提取洗涤液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml），EDTA（0.001M），TriS-HCl（0.01M，pH7.2）缓冲液。
5.悬浮液（同试剂4，但不加BSA）。
6.反应液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、蔗糖（0.25M）、KCl（10ml，pH7.2）、EDTA（0.2mM）、MgCl2（5mM）、TriS-HCl（10mM，pH7.2）。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素（物理和化学的）作用而失活，特别是膜的完整性极为重要，因为只有完整的线粒体才能进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下（0-4 o C）进行。
[2].要注意分离介质的pH值，pH值应和被采用的材料一致。
[3].捣碎时间要控制得当，或匀浆适度，争取获得更多的完整线粒体。
动物线粒体DNA提取的原理和方法
动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲 刘彦群 鲁 成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室 重庆 400716)摘 要 从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。
关键词 线粒体 线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。
它是细胞进行氧化磷酸化的场所。
线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。
线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。
由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。
动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。
进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。
线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。
线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。
线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。
其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。
线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。
锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。
细胞核及线粒体的分级分离实验报告
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线粒体的分离与鉴定
线粒体的分离与鉴定
实验简介
线粒体是真核细胞内一种重要和独特的细胞器，人体内95%
的ATP是由线粒体中的呼吸链所产生的，因此线粒体是细胞
内的“能量加工厂”，线粒体通过氧化磷酸化作用，进行能量 转换，为细胞进行各种生命活动提供能量。
本实验以小鼠肝组织为实验材料，通过对肝组织匀浆液悬浮
在蔗糖介质中进行差速离心法制备线粒体样本，然后通过詹 纳斯绿活染法进行显微镜观察线粒体的形态。 实验学时3个。
四、实验操作
速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷 到0～4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0～4℃条件下，
制备小鼠肝细胞匀浆：实验前小鼠空腹12h，拉颈处死，剖腹取肝，迅
按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液 应分数次添加。匀浆液用200目铜筛过滤备用。 离心：先将9ml 0.34mol/L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心
六、注意事项
注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程 不宜过长，以保持组分的生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中 进行。 将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离 心，以防匀浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层 效果。 姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应 用液不可使用。
地加入9ml肝匀浆使其覆盖于上层。用冷冻高速离心机按下图顺序进行 差速离心。 差速离心提取鼠肝线粒体流程见下图。
差 速 离 心 提 取 鼠 肝 线 粒 体 流 程 图
沉淀 （细胞核及质膜碎 片） 沉淀
取5g 鼠肝
先用生理盐水洗净血水，滤纸吸干，然后 用预冷的0.25M蔗糖溶液洗3次。
洁净的肝组织
枸杞线粒体DNA的提取
浮沉淀 ，取 ｌ 滴悬浮 液 ，用詹 纳斯绿 Ｂ染色后 显微 镜下 检查所 得线粒体 的数量及纯度 。
１ ２ ｍｔＮ 的分 离与提 取 ． Ｄ Ａ
１ 研 究方 法
试 验采 用 的枸杞 品种 为 “ 宁杞 １ ” 号 ，来 自北 方 民族 大学 实验 基地 。
１ １ 线 粒体 的分 离与 纯化 ．
无菌 离心 管 ｍｎ
取 ｌ 做水装 片于显微 镜下检查 细胞破碎情况 ； 滴
将 上 清 液 ２０ ０ ／ ０ ０ ｇ １ ｍｉ、 １ ０ ｇ ２ ｉ 、 ｎ ５０ ０ ／ ０ｍ ｎ
分子组成 ，在一个线 粒体上 通常含几 个 ｍＤ Ａ，是 ｔＮ
ｍｔＮ Ｄ Ａ纯度 高、污染少 、电泳条 带清晰。
关 键 词 ：枸 杞 ；线 粒 体 ＤＮ Ａ 中 图分 类号 ：Ｑ ９ ３ ２ ４ ． 文 献标 识 码 ：Ａ
线粒 体是真 核细胞 的半 自主性 细胞器 。植 物线
粒体 Ｄ Ａ （ ｔ Ｎ Ｎ ｍ Ｄ Ａ） 通 常 由一群 环 状 或线 状 Ｄ Ａ Ｎ
维普资讯
第３ 卷 ３
第 ４期
林 业 科
技
Ｖｏ ． ３ Ｎｏ １３ ．４
２ ０ ０ ８年 ７ 月
ＦＯ ＲＥＳＴＲＹ ＳＣＩ ＥＮ ＣＥ ＆ ＴＥＣＨ Ｎ ＯＬＯ Ｇ Ｙ
Ｊ ｌ ｕｙ
２００８
文 章 编 号 ：１０ ９ ９ （ｏ ８ ０ ０ ５ ０ ０ １— ４ ９ ２ｏ ） ４－ ０ ７— ３
Ｐ Ｐ ％ ，临用 时加 入 ；Ｂ一巯基 乙醇 ２ ５ ，临用 Ｖ １ ．％
时加 入 ） ５ 保 温 ４ ｒｎ裂 解 ，期 间 颠 倒 数 次 。 ，６ ℃ ５ｉ ａ 加 入 等体 积氯 仿／ 异戊 醇 （４ １ 混匀 ，室 温混合 ２：）
线粒体功能学研究常用实验方法
线粒体功能学研究常用实验方法刘江涛;王霖霖【摘要】线粒体作为细胞病变或损伤时最敏感的指标之一,对其功能的研究是分子细胞病理学检查的重要内容.目前研究线粒体功能的方法主要有线粒体耗氧量、线粒体呼吸链复合体活性、线粒体膜电位、细胞内ATP水平、线粒体膜离子通道的开放状态、活性氧类的变化、免疫蛋白印迹以及线粒体DNA拷贝数检测等.该文就线粒体功能学研究常用实验方法进行综述.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2015(021)001【总页数】3页(P6-8)【关键词】线粒体;呼吸链复合体;线粒体膜电位;活性氧类【作者】刘江涛;王霖霖【作者单位】宁波市第二医院骨科中心,浙江宁波315010;宁波市第一医院妇产科,浙江宁波315010【正文语种】中文【中图分类】R34线粒体是一种存在于大多数真核细胞中的双层膜细胞器。
线粒体具有自身的遗传系统，但其基因组大小有限，且受核基因组的调控，所以是一种半自主的细胞器[1]。
线粒体产生ATP为细胞供能，并在细胞中间代谢产物的氧化、细胞内环境稳态的调节等细胞活动中发挥着重要作用[2]。
线粒体是细胞内氧自由基产生的场所，同时本身也是氧自由基攻击的靶目标[3]。
线粒体功能障碍可引起细胞内多种信号级联反应、氧化应激反应，并启动程序性细胞死亡，其在几乎所有疾病的发生、发展中起至关重要的作用[4]。
线粒体作为细胞病变或损伤时最敏感的指标之一，对其功能的研究是分子细胞病理学检查的重要内容[5]。
现就线粒体功能学研究常用实验方法综述如下。
1 线粒体的提取蔗糖密度梯度离心法是提取线粒体的经典方法[6]，其根据细胞各组分密度的不同，将细胞或组织匀浆液悬浮于均匀的悬浮介质中，采用差速离心的方法进行分离。
缓冲的蔗糖溶液(0.25 mol/L蔗糖)比较接近细胞质的分散相，可在一定程度上保持各种细胞器的结构以及酶的活性，成为最常应用的悬浮介质。
此外，在pH值=7.2的条件下，各亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
线粒体染液-詹姆斯绿B Janus green B的使用及其原理
Cas 编号: 2869-83-2 EINECS 编号: 220-695-6 MDL 编号: MFCD00011758 Beilstein 编号:分子式: C30H31ClN6 分子量: 511.06中文别名:詹姆斯绿B，健那绿，健那绿B，双氮嗪绿，真那氏绿，詹姆斯绿，烟鲁绿，3-(二乙基氨基)-7-[[4-(二甲基氨基)苯基]偶氮]-5-苯基吩嗪翁氯化物3-Diethylamino-7-(4-dimethylaminophenylazo)-5-phenylphenazinium chloride小鼠肝细胞线粒体的Janus green B染色及观察1. 实验目的：学习超活染色的原理及方法，用詹纳斯绿B给小鼠的肝细胞线粒体染色。
2. 实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、双凹载玻片（2）实验药品：蒸馏水、Ringer液、詹纳斯绿B染液（3）实验材料：小鼠3. 实验原理：（1）活体染色又称超活染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色又无毒害的一种染色方法。
这种染色方法常用的是化学染料。
目的：显示生活中细胞的某种结构，不影响细胞的生命活动或产生任何的物理、化学变化以致细胞的死亡。
应用：研究生活状态下细胞的形态结构和生理病理状态。
（2）通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。
体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。
碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。
但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。
一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。
线粒体提取
线粒体提取缓冲液A(100 mM Tricine-KOH (pH 7.4), 300 mM sucrose, 10 mM KCl, 1 mM MgCl, 1 2mM potassium-EDTA, 0.1% BSA, 5 mM DTT and protease inhibitors: 1 mM PMSF, 10,g/ml pepstatin A)。
缓冲液B(pH 7.4, 无DTT ，余下同分离缓冲液A)。
1、将拟南芥叶片10g,置于研钵中，剪碎。
2、加25ml分离缓冲液A，冰上充分研磨。
3、匀浆液经4层纱布过滤。
滤液取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(1)。
4、于2,600g 离心15 min(Beckman J2-HS)，弃沉淀。
上清取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(2)。
5、上清液进一步在12,000g 离心15 min，此时得到线粒体粗提样。
6、弃上清，将沉淀轻柔地悬浮于2 ml分离缓冲液B中。
从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(3)。
7、铺制蔗糖密度梯度于38ml超离管中，介质由上到下依次包括6 ml / 0.6 M sucrose, 6 ml/ 0.9 M sucrose, 8 ml/ 1.2 M sucrose, 8 ml /1.45 M sucrose 和 8 ml/ 1.8 M sucrose。
介质均用缓冲液B配制。
8、然后将2 ml悬浮液铺于蔗糖密度梯度介质上。
9、然后以24000rpm离心90 min(SW Beckman rotor)。
2810、超离结束后，收集1.45M/1.2M层组分于50ml离心管中，缓冲液B稀释5倍。
11、12000g离心15min，沉淀即为纯化的线粒体。
13、将沉淀重悬于500ul缓冲液B中，从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(4)。
14、纯化的线粒体液氮速冻，存于-80?。
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mt DNA的分离及纯化
按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。
按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。
1.2 1000 g•min-1离心15min；取上清液；15000 g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L•g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 µg•m L-1，30℃下作用30min。
1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。
15000g•min-1离心20min。
沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。
1.4 按0.5 m L•g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。
1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。
取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。
1.6 15000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl，
0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。
1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50µg•m L-1，37℃保温1h。
4℃保存待用。