SDS-PAGE分离胶-浓缩胶配方

SDS-PAGE自制胶操作规程

SDS-PAGE自制胶操作规程一：试剂准备SDS-PAGE电泳所用溶液：30 %聚丙烯酰胺溶液(100 mL)丙稀酰胺(Arc)29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺(Bis)0.8g，加入去离子水定容至100mL，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

将商品用的40 %聚丙烯酰胺溶液稀释到浓度为30 %，冰箱4℃保存。

分离胶缓冲液1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：23.23gTirs碱，溶于80mL去离子水中，加入盐酸调节pH值至8.8，定容至150mL。

浓缩胶缓冲液0.5mol/L Tris·HCl，pH6.8： 6.0gTirs碱，溶于60mL去离子水中，加入盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL。

10％SDS：2gSDS溶于去离子水中，定容至20mL，加热至68℃助溶。

10％过硫酸铵：0.1g过硫酸铵，溶于1mL去离子水中；现配现用或分装冷冻备用。

TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。

1×Tris-甘氨酸缓冲液(1 L)Tris碱 3.03甘氨酸(电泳级) 14.4gSDS 1g2×SDS凝胶还原型加样缓冲液(5mL)0.25 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 1 mLSDS 0.25g甘油0.189gβ-巯基乙醇 2.5ml(DTT（二硫苏糖醇）0.385g溴酚兰0.001g双蒸水定容到5ml考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R-250 1.0g甲醇450 mL冰醋酸100 mLddH2O 450 mL考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性）450mL乙醇（甲醇）450mL冰醋酸100mLddH2O 450mLPH7.4PBS（0.01M）1LKH2PO4 1 mLNa2HPO40.25gNaCl 0.189gKCl 2.5ml二：凝胶配置1 2 3 41．将短玻璃板放在带有边条的长玻璃板上，做成玻璃板夹心。

玻璃板应保持干燥洁净。

SDS_PAGE分离胶_浓缩胶配方

SDS-PAGE1、SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳2、Acr：丙烯酰胺；配胶时用30%Acr〔质量比Acr：Bis=29:13、Bis：甲叉双丙烯酰胺4、DDW：超轻水5、SDS：十二烷基硫酸/磺酸钠,阴离子去污剂〔配胶时用10%6、APS：过硫酸铵NH4S2O4配胶时用10%7、TEMED：四甲基乙二胺,促凝剂8、Tris-Hcl：3羟基氨基甲烷盐酸缓冲液,配胶时〔分离胶ph=8.8,浓缩胶ph=6.89、DTT：二硫苏糖醇,DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原,可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。

10、IMA：碘乙酰胺,碘代乙酰胺用于有机合成,在蛋白组学中组氨酸和半胱氨酸的烷基化试剂,用于多肽测序以及酶抑制剂等,蛋白组学级试剂。

CH>2ICONH>2,是和碘乙酸一样,可通过下列反应不可逆地抑制SH酶类的物质。

1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度,再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶<即下层胶>：SDS-PAGE 分离胶浓度最佳分离范围6%胶50-150kD 8%胶30-90kD注：如果配制非变性胶,参考上述配方,不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。

1)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶<也称堆积胶、积层胶或上层胶>：TBST 缓冲液每2L体积中含：1)抗体去除液每50mL抗体去除液中含：SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS〔十二烷基硫酸钠,SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式：logMW=K-bX,式中：MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS-PAGE电泳试剂配制

SDS-PAGE电泳试剂1)30%储备胶溶液:丙烯酰胺(Acr）29。

0g，亚甲基双丙烯酰（Bis)1。

0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C；2）1。

5M Tris—HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8。

0，定容至100mL；3) 1M Tris—HCl（pH 6。

8）：Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8，定容至100 mL；4）4⨯分离胶缓冲液：0。

4gSDS溶于1.5M Tris—HCl（pH 8。

8），定容至100mL;5) 4⨯浓缩胶缓冲液: 0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6。

8），定容至100mL;6）10⨯电泳缓冲液(pH 8.3）：Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O溶解，定容至100mL；7) 10％过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH2O至10mL；8) 2⨯SDS电泳上样缓冲液:1M Tris-HCl(pH 6.8）2。

5mL，β-巯基乙醇1.0mL，SDS 0。

6g，甘油2。

0 mL，0。

1％溴酚兰1。

0 mL,ddH2O 3.5mL；9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501。

25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL;10）脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；11) 分离胶(12。

5%)：ddH2O 4mL，30％储备胶5 mL，4⨯分离胶缓冲液3mL，10% Aps 0。

1mL(现配），TEMED（N，N,N'，N’—四甲基乙二胺）10μL;12）浓缩胶（5％）:ddH2O 2.65mL，30％储备胶0。

85mL，4⨯浓缩胶缓冲液1。

25mL，10%Aps 50μL,TEMED 5μL.Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸)- SDS —PAGE蛋白质电泳1 Tricine —SDS —PAGE蛋白质电泳溶液准备1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1。

SDSPAGE分离胶配方表及其原理

S D S P A G E分离胶配方表及其原理The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，、分离胶缓冲液(Tris—HCl，，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

SDS-PAGE凝胶配方及制胶

SDS-PAGE 凝胶配方及制胶12%分离胶试剂5ml 8ml 10ml 15ml 25ml30ml 60ml 90ml 120ml 30%Acr-Bis （ml ） 2 3.2 4610122436 48 1.5M Tris-HCl PH8.8（ml ） 1.25 2 2.5 3.75 6.25 7.5 15 22.5 30 ddH2O （ml ） 1.65 2.64 3.3 4.95 8.25 9.9 19.8 29.7 39.6 10%SDS （ul ） 50 80 100 150 250 300 600 900 1200 10%APS （ul ） 50 80100 150 250300 600 900 1200 TEMED （ul ） 3 4.8 6 9 15 18 36 54 725%浓缩胶试剂4ml 6ml 8ml 12ml 16ml 20ml 24ml 36ml 48ml 30%Acr-Bis （ml ） 0.66 0.99 1.32 1.98 2.64 3.3 3.96 5.94 7.92 1M Tris-HCl PH6.8（ml ） 0.5 0.75 1 1.5 22.5 34.56ddH2O （ml ） 2.74 4.14 5.48 8.28 11.02 13.7 16.56 24.84 33.12 10%SDS （ul ） 40 60 80 120 160 200 240 360 480 10%APS （ul ） 40 60 80 120 160 200 240 360 480 TEMED （ul ）4681216202436481、按顺序加溶液，每加完一个溶液摇匀一下。

2、TEMED 要在通风橱中加，加入后混匀30秒左右后再注胶；吸打时枪头不出液面，以减少气泡3、分离胶配好后要用水封顶，聚合至少40min （也可聚合一夜）4、加入浓缩胶后插梳子（要洗干净），梳子倾斜插入，避免产生气泡。

SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理

SDSPAGE电泳原理：之欧侯瑞魂创作聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据分歧蛋白质分子所带电荷的差别及分子大小的分歧所发生的分歧迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子概况活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超出其自己原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差别。

因此，各种蛋白质SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDSPAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差别这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此经常使用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采取垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。

SDS-PAGE凝胶配制方法

SDS-PAGE凝胶配制方法
1.主要组成成分
该套内包含六个组分，主要成分如下：
产品名称（简述）
规格
储存条件
30% Arc-Bis(29:1)
100mL
2-8˚C，避光
过硫酸铵(AP)
0.1g x 3
2-8˚C
TEMED
1mL
2-8˚C，避光
1M Tris-HCl, pH6.8
30mL
2-8˚C
1.5M Tris-HCl, pH8.8
5mL
10mL
15mL
20mL
25mL
30mL
40mL
50mL
6% Gel
H2O
2.6
5.3
7.9
10.6
13.2
15.9
21.2
26.5
30% Arc-Bis(29:1)
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
8.0
10.0
1.5M Tris-HCl, pH8.8
1.3
2.5
3.8
5.0
6.3
7.5
10.0
10%过硫酸铵（AP）
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
0.016
0.02
15% Gel
H2O
1.1
2.3
3.4
4.6
5.7
6.9
9.2
11.5
30% Arc-Bis(29:1)

SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理

SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，、分离胶缓冲液(Tris—HCl，，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝，pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。

SDS-PAGE_配胶

PAGE是聚丙烯酰胺凝胶电泳的简称.（polyacrylamide gel electrophoresis;PAGE)
采用聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳.凝胶是通过丙烯酰胺单体与交联剂亚甲基双丙烯酰胺在催化剂和加速剂作用下聚合而成的,它具有重复性好、分辨力强、凝胶孔径大小可调节、化学性能稳定、操作简便等优点已广泛应用于蛋白质、核酸等物质的分离分析.普通PAGE根据电荷多少及分子大小,即电荷效应和分子筛效应使样品得到分离.若在凝胶中加入阴离子运河污剂——十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）掩盖其电荷效应,主要以分子筛效应进行分离,用于检则蛋白质分子量,称为SDS-PAGE.若在凝胶中加入两性电解质产生pH梯度,用以测定蛋白质等电点称为聚焦电泳；若使凝胶产生一定的浓度梯度,适用于蛋白质分子量测定,称为梯度凝胶电泳.电泳方式常用单向电泳,亦可使用两种原理不同的电泳如-DS-PAGE和聚焦电泳结合起来进行双向电泳.电泳装置多采用垂直板型,操作简便.。

(完整版)SDS-PAGE分离胶-浓缩胶配方

SDS-PAGE1、SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳2、Acr：丙烯酰胺；配胶时用30%Acr（质量比Acr：Bis=29:1）3、Bis：甲叉双丙烯酰胺4、DDW：超轻水5、SDS：十二烷基硫酸/磺酸钠，阴离子去污剂（配胶时用10%）6、APS：过硫酸铵NH4S2O4配胶时用10%7、TEMED：四甲基乙二胺，促凝剂8、Tris-Hcl：3羟基氨基甲烷盐酸缓冲液，配胶时（分离胶ph=8.8，浓缩胶ph=6.8）9、DTT：二硫苏糖醇，DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。

10、IMA：碘乙酰胺，碘代乙酰胺用于有机合成，在蛋白组学中组氨酸和半胱氨酸的烷基化试剂，用于多肽测序以及酶抑制剂等，蛋白组学级试剂。

CH>2ICONH>2，是和碘乙酸一样，可通过下列反应不可逆地抑制SH酶类的物质。

1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。

1)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：TBST 缓冲液每2L体积中含：1)抗体去除液每50mL抗体去除液中含：SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS-PAGE试剂配方

SDS-PAGE电泳所用溶液：30 %聚丙烯酰胺溶液 (100 mL)丙烯酰胺 (Arc) 29 gN,N’-亚甲双丙烯酰胺 (Bis) 1 g用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

5×Tris-甘氨酸缓冲液 (1 L)Tris碱 15.1 g甘氨酸(电泳级) 94 g10 %SDS 50 mL使用时稀释5倍使用2×SDS凝胶加样缓冲液(10mL)0.5 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 2 mL10％(W/V)SDS 4 mL甘油 2 mLβ-巯基乙醇 1.0 mL(DTT（二硫苏糖醇） 0.31g)溴酚兰 0.02g双蒸水 0.5 mL室温存放备用考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R-250 （G-250） 1.0 g甲醇 450 mL冰醋酸 100 mLddH2O 450 mL0.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95％乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性）甲醇 100 mL冰醋酸 100 mLddH2O 800 mL医用酒精：冰醋酸：水=4.5：0.5：5(V：V：V)SDS-PAGE所需溶液:A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。

C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。

SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理

SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，、分离胶缓冲液(Tris—HCl，，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝，pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。

SDS-PAGE所有详细试剂配方

S D S-P A G E 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide【组分浓度】各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)30%Acr-Bis(29:1) 1000ml 100ml29%Acrylamide(丙烯酰胺) 290g 29g1%BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺) 10g 1g【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。

0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。

严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。

使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。

如有沉淀，可以过滤。

【保存条件】4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。

称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。

1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)【组分浓度】1MTris-HCL名称用量备注Tris 12.1g去离子水80ml浓盐酸9ml (36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH 值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。

应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

【保存条件】室温保存。

【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。

1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer)【组分浓度】1.5MTris-HCL名称用量备注Tris 18.17g去离子水80ml浓盐酸3ml (36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】1L称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。

浓缩胶分离胶-配方

不连续胶的配置
2017.8.18 10% SDS-PAGE (mL)
12% SDS-PAGE
浓缩胶（mL）
配胶操作步骤：
⑴配胶准备：将玻璃板、梳子有清洁剂或稀酸泡洗，电泳装置用水冲洗并晾干，
亦可用酒精棉球擦洗灌胶面晾干，根据厂家说明书安装玻璃板。

⑵确定所需凝胶溶液体积，按上表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓
度配制一定体积的分离胶溶液。

一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。

(3) 灌bio-rad迷你垂直板两块板共约需7.5ml.故实际操作时，我们通常在加
AP和TEMED前将上述混合液均分为两份。

一份放4度保存，下次用；一份继续加0.075ml的AP和3μl的TEMED，混匀后，立即灌胶。

用双蒸水封胶，压平胶面。

留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5-1cm)。

(4) 等待过程中，配制浓缩胶溶液，AP和TEMED使用前加入。

也可进行样品
的准备工作，具体做法在转膜中将又专门讲解。

(5) 室温约30分钟-40分钟后聚合。

倒去双蒸水，再用滤纸吸净残留水。

灌浓
缩胶，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-20分钟
(6) 浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子。

把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加
入Tris-甘氨酸电极缓冲液。

SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理之欧阳化创编

SDSPAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDSPAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl －，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。

SDS-PAGE分离胶配方表-及其原理之欧阳德创编

SDSPAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDSPAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pKa=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。