全国结核病细菌学诊断培训
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病人减少百分比
=发现率×治疗覆盖率×完成治疗率×治愈率
0.3 ×0.9×0.9×0.9＝ 0.22 0.4 ×0.9×0.9×0.9＝ 0.29 0.5 ×0.9×0.9×0.9＝ 0.36 0.6 ×0.9×0.9×0.9＝ 0.44 0.7 ×0.9×0.9×0.9＝ 0.51
现代结核病控制策略
省卫生厅 地市卫生厅
县卫生局
省CDC （结防所）
地市CDC （结防所）
县结核病 防治机构
省参比实验室 地市实验室 县结核病实验室
NTP中主要的实验室工作
➢ 涂片镜检
简单、快速、最具成本/效益
➢ 培养
比涂片更敏感、特异 可以获得培养物
➢ 药物敏感性试验及鉴定
用药参考 流行病学评价
涂片染色镜检相关的生物学性状
5、涂片
编号 涂抹痰标本 自然干燥
2cm
1 cm
2 vertical lines, 1 cm each = 100 fields
不得使用火焰加热的 方法加速痰膜干燥
×
痰膜的厚薄
太厚
适宜
太薄
6、染色
萋尼氏热染色法
➢ 加热固定 ➢ 石炭酸复红初染 ➢ 盐酸酒精脱色 ➢ 美兰复染
抗酸菌
非抗酸菌
抗酸性的基本特性：
1.属特异性
富脂质网状胞壁结构
α烷基β羟基脂肪酸
分枝杆菌分支菌酸 碳链 28 ~ 40
棒状杆菌分支菌酸 碳链 40 ~ 60
诺卡氏菌分支菌酸 碳链 60 ~ 90
2.变异性
培养条件： 丙三醇 糖苷
组织内环境
不同菌状态
3. 抗酸性是分枝杆菌属特异性
不能作为分枝杆菌种水平鉴定的生物学指标
采集时间：即时痰、晨 痰、夜间痰
3、标本接收和登记
检查标本性质，不合格的痰 标本可以要求病人重新留取
核对申请单和痰盒上的标本 信息
登记在实验室记录本上
4、材料的准备
痰盒 玻片（一端带有磨砂边） 竹（木）签 定时器 染色池、染色架 酒精灯 加热棒 玻片盒 废料缸 漏斗（滤纸) 镊子 染色液 镜油、镜头纸
假阳性 假阴性 假阴性 假阴性 涂阴培阳
结核菌涂片镜检、分离培养 标准化操作
1、对象
结核病可疑者
咳嗽、咳痰超过3周 咳血或伴有血痰 发热或胸痛超过2周 胸部X线异常
确诊并正在接受治疗的结核病人
2、痰标本收集
容器：广口、螺旋盖、 可密闭、不易泄漏
标本性状：干酪痰、血 痰、粘液痰、唾液
初染
脱色 复染
加热固定
将涂片排放在染色架上，注意间隔
滴加碱性复红
滴加碱性复红染色液，铺满玻片*
Flooding Slides with Carbol Fuchsin
加热
Heating of Slides
流水冲洗
Washing the Slide after Carbol Fuchsin
盐酸酒精脱色
传统萋尼氏染色法（1882）
1. 碱性复红
5克
酚
25 克
乙醇 95%
50 毫升
蒸馏水
500 毫升
热染 3分钟
2. 乙醇 95%
970 毫升
浓盐酸
30 毫升
3. 孔雀绿 亚甲兰 苦味酸
2.5 克 2.5 克 3.5 克
蒸馏水
500 毫升
Tam Thiam Hok法（1962）
1. 碱性复红
20 克
酚
40 克
乙醇 95%
100 毫升
蒸馏水
500 毫升
冷染 3分钟
2. 亚甲兰
5克
乙醇 95%
150 毫升
蒸馏水
250 毫升
硫酸 96%
100 毫升
分枝杆菌的形态多样性： Bergy’sMannual of Systematic Bacteriology典型描
述：
杆状， 0.3-0.6×1-4μm, 直或稍些弯曲， 单个，偶呈串状， 染色均匀或不规则，常见异染质， 有分枝样生长或集簇倾向
政府承诺 开展以痰检为主的病人发现工作 应用标准短程化疗并实施督导管理 建立正规的药物供应系统 建立监测系统
结核病控制是由政府提供给大众的卫生 服务－NTP（national TB control program）
我国结核病实验室工作网络的组织管理（疾控）
NTP
Biblioteka Baidu
卫生部
国家CDC
国家参比实验室
形态多样性：
陈旧培养物
淋巴结，干酪组织内呈生理多样性和形态多样性
杆菌相（型）：
抗酸性
+++
短杆状
++ - +++
丝状
+ /±
球菌相（型）：
诺卡氏菌胞壁缺陷型
+/±/-
李斯特菌胞壁缺陷型
±/-
颗粒相（型）：
-
滤过相（型）：
-
细菌学限制：形态多样性和可培养性
典型杆状 短杆状 球状、丝状 胞壁缺陷 部分缺陷 完全缺陷 L-型 颗粒 莫赫颗粒 滤过型
沥去玻片上的水，自然干燥
Drying the Stained Slides
太厚 太大、不均匀 太大、不均匀、脱色不佳 涂片不佳、不均匀 太小 脱落 脱落 太薄 不均匀、脱落、脱色不佳
7、镜检
➢ 在油镜下，至少检查300 个（100个）有用的和有 代表性的视野（至少5分 钟）
荧光染色镜检
FM比ZN镜检法的特异性 差
因此 FM 阳性结果应该利 用 ZN进行确认
FM 方法可以阅读更多的 涂片，适用于标本量较多 的实验室
8、结果报告
阴性 报告实际菌落数 阳性1＋ 阳性2＋ 阳性3＋ 阳性4＋
未发现抗酸菌/ 300 视野 1-8 条 /300 视野 1-9 条 / 100 视野 1-9 条 / 10 视野 1-9 条 / 每视野 达到或超过 10 条 /每视野
涂片阳性的意义？
结果
实际菌数 1＋ 2＋ 3＋ 4＋
抗酸性 + + +、±
镜检阳性依据 + ？ -
±
-
-
-
±/-
-
-
-
-
-
分离培养 + + ？
？ ？ -
菌形态多样性 排菌间歇性 痰样本中菌分布不均匀性
结果：常规涂片染色镜检是以正常杆菌形态为阳 性判定标准出现漏检的假阴性
影响涂片染色镜检的因素
抗酸性的属特异性 抗酸性变异性 形态多样性 均分布不均匀性 低敏感度
Decolourizing with Acid Alcohol
流水冲洗脱色液
Washing the Slide after Decolourization with Acid Alcohol
亚甲兰复染
Counter staining with Methylene Blue
流水冲洗亚甲兰
Washing the Slide after Methylene Blue
=发现率×治疗覆盖率×完成治疗率×治愈率
0.3 ×0.9×0.9×0.9＝ 0.22 0.4 ×0.9×0.9×0.9＝ 0.29 0.5 ×0.9×0.9×0.9＝ 0.36 0.6 ×0.9×0.9×0.9＝ 0.44 0.7 ×0.9×0.9×0.9＝ 0.51
现代结核病控制策略
省卫生厅 地市卫生厅
县卫生局
省CDC （结防所）
地市CDC （结防所）
县结核病 防治机构
省参比实验室 地市实验室 县结核病实验室
NTP中主要的实验室工作
➢ 涂片镜检
简单、快速、最具成本/效益
➢ 培养
比涂片更敏感、特异 可以获得培养物
➢ 药物敏感性试验及鉴定
用药参考 流行病学评价
涂片染色镜检相关的生物学性状
5、涂片
编号 涂抹痰标本 自然干燥
2cm
1 cm
2 vertical lines, 1 cm each = 100 fields
不得使用火焰加热的 方法加速痰膜干燥
×
痰膜的厚薄
太厚
适宜
太薄
6、染色
萋尼氏热染色法
➢ 加热固定 ➢ 石炭酸复红初染 ➢ 盐酸酒精脱色 ➢ 美兰复染
抗酸菌
非抗酸菌
抗酸性的基本特性：
1.属特异性
富脂质网状胞壁结构
α烷基β羟基脂肪酸
分枝杆菌分支菌酸 碳链 28 ~ 40
棒状杆菌分支菌酸 碳链 40 ~ 60
诺卡氏菌分支菌酸 碳链 60 ~ 90
2.变异性
培养条件： 丙三醇 糖苷
组织内环境
不同菌状态
3. 抗酸性是分枝杆菌属特异性
不能作为分枝杆菌种水平鉴定的生物学指标
采集时间：即时痰、晨 痰、夜间痰
3、标本接收和登记
检查标本性质，不合格的痰 标本可以要求病人重新留取
核对申请单和痰盒上的标本 信息
登记在实验室记录本上
4、材料的准备
痰盒 玻片（一端带有磨砂边） 竹（木）签 定时器 染色池、染色架 酒精灯 加热棒 玻片盒 废料缸 漏斗（滤纸) 镊子 染色液 镜油、镜头纸
假阳性 假阴性 假阴性 假阴性 涂阴培阳
结核菌涂片镜检、分离培养 标准化操作
1、对象
结核病可疑者
咳嗽、咳痰超过3周 咳血或伴有血痰 发热或胸痛超过2周 胸部X线异常
确诊并正在接受治疗的结核病人
2、痰标本收集
容器：广口、螺旋盖、 可密闭、不易泄漏
标本性状：干酪痰、血 痰、粘液痰、唾液
初染
脱色 复染
加热固定
将涂片排放在染色架上，注意间隔
滴加碱性复红
滴加碱性复红染色液，铺满玻片*
Flooding Slides with Carbol Fuchsin
加热
Heating of Slides
流水冲洗
Washing the Slide after Carbol Fuchsin
盐酸酒精脱色
传统萋尼氏染色法（1882）
1. 碱性复红
5克
酚
25 克
乙醇 95%
50 毫升
蒸馏水
500 毫升
热染 3分钟
2. 乙醇 95%
970 毫升
浓盐酸
30 毫升
3. 孔雀绿 亚甲兰 苦味酸
2.5 克 2.5 克 3.5 克
蒸馏水
500 毫升
Tam Thiam Hok法（1962）
1. 碱性复红
20 克
酚
40 克
乙醇 95%
100 毫升
蒸馏水
500 毫升
冷染 3分钟
2. 亚甲兰
5克
乙醇 95%
150 毫升
蒸馏水
250 毫升
硫酸 96%
100 毫升
分枝杆菌的形态多样性： Bergy’sMannual of Systematic Bacteriology典型描
述：
杆状， 0.3-0.6×1-4μm, 直或稍些弯曲， 单个，偶呈串状， 染色均匀或不规则，常见异染质， 有分枝样生长或集簇倾向
政府承诺 开展以痰检为主的病人发现工作 应用标准短程化疗并实施督导管理 建立正规的药物供应系统 建立监测系统
结核病控制是由政府提供给大众的卫生 服务－NTP（national TB control program）
我国结核病实验室工作网络的组织管理（疾控）
NTP
Biblioteka Baidu
卫生部
国家CDC
国家参比实验室
形态多样性：
陈旧培养物
淋巴结，干酪组织内呈生理多样性和形态多样性
杆菌相（型）：
抗酸性
+++
短杆状
++ - +++
丝状
+ /±
球菌相（型）：
诺卡氏菌胞壁缺陷型
+/±/-
李斯特菌胞壁缺陷型
±/-
颗粒相（型）：
-
滤过相（型）：
-
细菌学限制：形态多样性和可培养性
典型杆状 短杆状 球状、丝状 胞壁缺陷 部分缺陷 完全缺陷 L-型 颗粒 莫赫颗粒 滤过型
沥去玻片上的水，自然干燥
Drying the Stained Slides
太厚 太大、不均匀 太大、不均匀、脱色不佳 涂片不佳、不均匀 太小 脱落 脱落 太薄 不均匀、脱落、脱色不佳
7、镜检
➢ 在油镜下，至少检查300 个（100个）有用的和有 代表性的视野（至少5分 钟）
荧光染色镜检
FM比ZN镜检法的特异性 差
因此 FM 阳性结果应该利 用 ZN进行确认
FM 方法可以阅读更多的 涂片，适用于标本量较多 的实验室
8、结果报告
阴性 报告实际菌落数 阳性1＋ 阳性2＋ 阳性3＋ 阳性4＋
未发现抗酸菌/ 300 视野 1-8 条 /300 视野 1-9 条 / 100 视野 1-9 条 / 10 视野 1-9 条 / 每视野 达到或超过 10 条 /每视野
涂片阳性的意义？
结果
实际菌数 1＋ 2＋ 3＋ 4＋
抗酸性 + + +、±
镜检阳性依据 + ？ -
±
-
-
-
±/-
-
-
-
-
-
分离培养 + + ？
？ ？ -
菌形态多样性 排菌间歇性 痰样本中菌分布不均匀性
结果：常规涂片染色镜检是以正常杆菌形态为阳 性判定标准出现漏检的假阴性
影响涂片染色镜检的因素
抗酸性的属特异性 抗酸性变异性 形态多样性 均分布不均匀性 低敏感度
Decolourizing with Acid Alcohol
流水冲洗脱色液
Washing the Slide after Decolourization with Acid Alcohol
亚甲兰复染
Counter staining with Methylene Blue
流水冲洗亚甲兰
Washing the Slide after Methylene Blue