第五章物证显微镜检验技术

第五章物证显微镜检验技术第一节光学显微镜的结构和光学参数一、光学显微镜的结构光学显微镜在结构上分为光学系统和机械系统两大部分。

（一）光学系统：光学系统是显微镜最重要的部分，其主要由物镜、目镜、照明装置（聚光镜、反射镜等）及光源等部件组成。

1、物镜：是显微镜光学系统中最重要的一个光学部件，它直接决定着显微镜的光学质量和光学性能，显微镜分辨率的高低主要取决于物镜的性能。

物镜安装在镜筒下端，由1--5组复式透镜所组成。

在组成物镜的各透镜中，唯有位于最下端的前透镜起着放大作用，其余透镜都是用于消除前透镜产生的各种像差的。

（物体经透镜放大后所获得的像，其形状、颜色与物体本身总是存在一定的差别，这种差别称为像差）2、目镜：安装在镜筒上方，将物镜造成的第一次放大物像（倒立实像）再次放大，成为眼睛能观察到的放大虚像。

目镜只起放大作用，不能提高分辨率。

目镜的结构比较简单，一般由两块凸透镜组成。

上方透镜称接目镜，直接用于眼睛观察；下端透镜称会聚透镜或视野透镜，也叫场镜。

上下透镜之间的物方焦平面处，设有视场光阑，用以限制物方视场的大小。

物镜的放大实像就成像在这光阑面上。

目镜的放大倍率一般为5--10倍，其放大率与接目镜的直径及目镜筒长有关，直径愈小、筒长愈短,则放大率愈大。

3、聚光镜：主要用以弥补光量的不足，同时也可以适当改变从光源射来的光线性质。

4、虹彩光阑：多安置在聚光镜的下方，其作用是调节聚光镜的数值孔径。

使进入物镜的光柱的角度正好能均匀照满物镜的前透镜。

5、反射镜：作用是改变从光源射出的光线的方向，将光线送至聚光镜。

6、滤光镜环：是安装在反射镜和聚光镜之间的可水平移动的金属环，其上可安放各种滤光镜片。

其作用是改变从光源射来的光线组成。

7、光源：显微镜的主要光源是灯光。

通常显微镜都配有内装式或外装式的专用照明灯。

常用的有白炽灯、氙灯、汞灯等。

（二）显微镜的机械系统显微镜的机械系统由镜座、镜臂、镜筒、镜台（载物台）、物镜转换器、调焦装置等组成。

二、显微镜的光学参数显微镜的光学参数包括：放大率、数值孔径、分辨率、视场、景深、镜像清晰度、镜像亮度、工作距离、机械筒长等。

其中决定显微镜性能的最重要参数是显微镜的分辨率。

显微镜的各个参数均有一定限度，彼此之间互相影响，互相制约。

（一）显微镜的放大率放大率是指被观察物体经物镜、目镜两次放大成像后，人眼看到的虚像的大小对原物大小的比值。

通常用显微镜的物镜单向放大率m与目镜的角放大率α两者的乘积来表示显微镜的放大率M。

即M= m α 。

物镜的单向放大率m与光学筒长S（物镜后焦距与目镜前焦距之间的距离）成正比，与物镜焦距f₁成反比。

S即m=f₁目镜的角放大率α与目镜焦距f₂成反比，与明视距离（250毫米）成正比。

250即α =f₂S 250由此可见，M = m α = ×f₁f₂（二）物镜的数值孔径物镜的数值孔径是被检物体与物镜间媒质的折射率与物镜孔径角的一半的正弦值的乘积。

显微镜的分辨本领与物镜的数值孔径成正比，因此，数值孔径是衡量显微镜性能的极为重要的参数之一，其决定并影响着显微镜的其它参数。

例如，其与放大率成正比，与景深成反比，其平方与镜像亮度成正比，其值愈大则视场与工作距离愈小等。

（三）显微镜的分辨率显微镜的分辨率是指其分辨物体细微结构的能力。

分辨率是衡量显微镜质量的重要参数之一。

分辨率的高低是根据能够被分辨清楚的物体上两点之间的最小距离来估算的。

显微镜能分辨的两点间的最短距离，称为最小分辨距离，用Z表示。

显微镜的最小分辨距离与分辨率成反比，即Z值愈小，分辨率愈大。

当被检物体两点间距离小于Z时，就不能分辨两点而只能看成一点了。

（四）显微镜的视场（视野）从显微镜中能观察到的圆形范围称为视场或视野。

视场大小由设在目镜中的光阑大小所确定。

不同的物镜、目镜搭配使用时，其视场大小不同。

理论上讲，视场越大越便于观察，但视场直径会随放大率的增加而变小。

因此在使用时可以使检材依次移动位置，轮流进入视场内进行观察。

（五）显微镜的景深当显微镜调焦于某一物平面时，位于该平面的前后、能被观察者看清楚的两个物平面之间的距离，即能看清的物体厚度，称为显微镜的景深，也称焦点深度。

景深与物镜的数值孔径及放大率成反比，要求高分辨率和高放大率，则景深只能变浅。

由于显微镜的景深很小，在制作检材时要求其厚度要薄，一般为4--6微米。

（六）显微镜的镜像清晰度被检物体经过显微镜放大以后，所得物像的轮廓清晰程度，称为镜像清晰度。

一般来说，显微镜透镜的像差校正的愈好，镜像清晰度愈高。

显微镜的放大率愈高，像差也被放大，像的清晰度就愈差。

实践证明，选择合适的物镜，适当搭配物镜和目镜，保持标准筒长，调选合适的盖玻片等均能提高显微镜的镜像清晰度。

（七）显微镜的镜像亮度显微镜的镜像亮度是指通过显微镜所观察到的像的明暗程度。

在高倍镜下进行显微摄影或进行投影、暗场、偏光等观察时，镜像亮度具有特别重要的意义。

镜像亮度与数值孔径的平方成正比，与放大率的平方成反比。

在使用时，应合理选用物镜和搭配好目镜，以期获得最佳镜像亮度。

（八）显微镜的工作距离显微镜的工作距离是指物镜的前表面中心到被观察物体之间的距离。

其与物镜的数值孔径有关，数值孔径越大，工作距离越小。

工作距离还与物镜种类、光学结构等有关。

注：使用显微镜时，各光学参数之间是互相联系又互相制约的。

例如，当使用较大数值孔径的物镜时，放大率提高了，分辨率提高了，但视场小了，工作距离短了，景深也小了。

因此，针对不同的检材和不同的检验要求，合理考虑光学系统的内在联系，分清主次，统筹兼顾，是显微镜检验工作的关键所在。

第二节物证检验中常用的几种光学显微镜一台基本的显微镜架，安装上不同的附件之后，即可供不同的检验之需。

如物证检验中常用的生物显微镜、偏振光显微镜、金相显微镜、荧光显微镜、微分干涉显微镜等，都可以在基本的显微镜架基础之上添加一定的配件而形成。

除此之外，还有供特种需要专门设计的实体显微镜、比对显微镜等。

下面介绍几种常用的光学显微镜。

一、体视显微镜体视显微镜，又称立体显微镜，实体显微镜。

其特点是能观察到物体的立体三维图像，具有空间立体感。

体视显微镜属于双筒显微镜，具有两个目镜。

其之所以能观察到立体图像，是因为它的两个目镜能使人的左右两眼从不同的视角观察物体。

体视显微镜是观察物证表面结构特点的理想工具。

在物证检验中，常利用其作为初检工具。

在立体形象痕迹（工具痕迹、枪弹痕迹等）检验、笔画先后顺序检验、伪造文件检验、油漆碎片、玻璃碎片、纸张、纤维等的检验中都有广泛的应用。

二、暗场显微镜暗场显微镜，又称暗视野显微镜，超显微镜，属于较高级的特种生物显微镜。

它利用特别的聚光器，不使照射物体的光线直接进入物镜，而使斜射光线照射被检物体表面，使物体发出的反射光及衍射光进入物镜，从而在暗视场中见到明亮的物像。

由于暗场显微镜是利用被检物体表面的反射光和衍射光来观察物体，所以不能看清物体的结构特点，但能够看到物体的存在和运动。

对于在0.2--0.004微米之间的微小粒子，暗场显微镜具有明场显微镜无法达到的分辨能力。

明场显微镜的最小分辨距离一般为0.2微米，而暗场显微镜能观察到0.002--0.004微米以上的超显微粒子的存在，其分辨率比普通光学显微镜提高了100--200倍。

暗场显微镜适合于观察生物物证中的一些活的微生物，如观察某些病毒，观察透明活细胞浆中的微粒等。

常见的暗场显微镜是抛物面暗场显微镜。

其聚光器透镜呈抛物面形，在抛物面的底部中央有一片遮光板，只让边缘的筒状光线射入抛物面，使之改变为斜射光线。

三、荧光显微镜荧光显微镜是用以观察受激发出荧光的检材的荧光图像的显微镜。

用荧光显微镜观察的先决条件是被测物质在紫外线或短波可见光（蓝光或绿光）的照射下可以发出可见荧光，或经过染色以后可以发出荧光。

荧光显微镜与普通光学显微镜的基本结构是相同的，区别在于所用的光源不同。

荧光显微镜的光源是能发出特定波长紫外光或蓝紫光的高压水银石英灯或氙灯。

由于荧光显微镜的光源在发射紫外线的同时还放出很大的热量，因此在其光源之前要设置吸热水槽（内装10%硫酸铜水溶液）。

荧光显微镜必须配备相应的滤光片组：一是激发滤光片组，设置在光源之前，将紫外线以外的不同波长的可见光都滤掉；二是抑制滤光片组，设置在物镜上方或目镜下方，只允许荧光通过，将紫外线滤掉，同时起到保护眼睛的作用。

另外，荧光显微镜通常是在黑暗的背景下观察被检物的荧光图像，其对比度约为普通显微镜的100倍。

可观察到普通显微镜下看不到的微小物体和细节特征，从而提高了显微镜的分辨能力。

荧光现象是物证检验中鉴别不同物质属性时经常利用的特征之一。

例如，对墨水笔画、圆珠笔笔画、复写纸笔画、图章印文的印油等进行检验时，往往要利用荧光显微镜观察它们的荧光现象。

还可用于分析某些生物物证的化学成分（因几乎所有的有机分子都能够直接或经适当处理后发出荧光而被观察分析），鉴定血迹、唾液斑及毛发物证的性别属性等。

四、偏光显微镜偏光显微镜是利用偏振光区别均质与非均质物体，而且还能观察研究物体非均质性本身强弱和各种差异的显微镜。

（一）偏振光光的振动方向与波的传播方向垂直。

从普通光源发出的光线，其振动的方向随机分布，在各个方向振动的强度也相等。

如果光被某些物体特殊反射或透射后，其反射光的振动方向被限制在垂直光波传播方向的一个直线上振动，这种光波称为偏振光，也称为完全偏振光。

如果光波在某个方向上的振动强度比其它方向的振动强度大，则这种光波称为部分偏振光。

（二）双折射体自然界中的物质存在着人的肉眼无法观察到的均质与非均质的差别。

非均质物质具有双折射性质，称双折射体。

自然光通过“双折射体”后，可形成两束振动方向互相垂直的偏振光（正常光和异常光两种偏振光），两者的光速、折射率和波长均有不同。

（三）尼科尔棱镜将具有一定方向性的两块方解石（为六方晶体，具有双折射性）用树胶粘合起来，制成尼科尔棱镜。

自然光进入尼科尔棱镜的一侧后分解成正常光和异常光两种偏振光，其中正常光的折射率较树胶的大，不能通过树胶；异常光与树胶的折射率近似，可以通过树胶。

即正常光不能通过尼科尔棱镜；异常光可以通过尼科尔棱镜。

（四）偏振器偏振器是用尼科尔棱镜制成的、只允许在一个方向振动的光波通过的光学元件，分为起偏器和检偏器两种。

偏光显微镜在光源与样品之间，加有起偏器，通过其获得偏振光；在物镜与目镜之间装有检偏器，用以检查是否有异常光通过双折射体。

当起偏器与检偏器的方向平行时，通过起偏器的光振动恰好能通过检偏器，其视野是亮的；转动起偏器，使起偏器通过的光振动方向与检偏器通过的光振动方向相垂直，其视野是暗的。

此时在载物台上放入具有双折射性质的非均质物质，由于产生偏光干涉而使视野变亮。

旋转载物台时，每90˚样品变暗一次，而放入单折射体时，视野中的物像始终是暗的。