抗菌抗病毒常用实验研究方法知识

抗菌抗病毒常用实验研究方法

细菌、病毒性疾病是目前国内外流行的主要传染病,尤其是近两年来,由冠状病毒引起的SARS及由流感病毒引起的禽流感给动物及人类带来的严重危害,是人所共知的"由于各种疫苗的不断出现,虽然一些细菌、病毒病已得到了有效的控制,但是其治疗尚无有效的解决方法因此研制高效、低毒的新型中药抗菌、抗病毒制剂已成为巫待解决的问题。

1、常用的抗菌方法

1、1稀释法

1、1、1试管稀释法

培养基内抗生素的含量按几何级数稀释并接种适量的细菌，经孵育后，观察能引起抑菌作用最低抗生素浓度，称最低抑菌浓度(MIC)为该菌对药物的敏感度。稀释法所获得的结果比较准确，常被用作校正其他方法的标准。如以下黄贝贝等的青钱柳抗菌作用的实验研究和黄利权等的火绒草的抗菌活性研究的实验方法:

1、应用试管稀释法,测定青钱柳提取物对试验菌的抑菌效果,检验不同浓度下青钱柳提取物对细菌、霉菌的抗菌作用。结果:青钱柳提取物在体外对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等革兰氏阳性菌具有较强的抗菌作用;而对大肠埃希氏菌、铜绿假单孢菌等革兰氏阴性菌的抗菌作用不明显;对黄曲霉、烟曲霉等霉菌的抗菌作用不明显[1]。

2、采用试管稀释法,分别测定了火绒草水煎液、水提醇沉液、醇提物、醇提石油醚部分、醇提乙酸乙酯部分、醇提正丁醇部分、醇提水溶部分等7种提取物对大肠杆菌C83882、大肠杆菌C8390

3、大肠杆菌C8391

4、沙门氏菌C79-20、金黄色葡萄球菌Newbould S-30

5、金黄色葡萄球菌临床分离株等6株病原菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。试验结果表明,火绒草醇提物及其石油醚部分和乙酸乙酯部分对两种金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用,其MIC为0114 mg/ml生药浓度,MBC为0127 mg/ml生药浓度,而其它部分对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱。火绒草醇提正丁醇部分和水溶部分对3株大肠杆菌和1株沙门氏菌具有较强的抑制作用,其MIC为2170 mg/ml生药浓度,MBC为2170 mg/ml 生药浓度,显示了较强的抗菌活性[2]。

1、1、2肉汤稀释法

以水解酪蛋白(M-H)液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待检细菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度(MBC)。

如刘菁菁的研究蓝玉簪龙胆对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA) 的体内外抗菌活性。蓝玉簪龙胆分别以乙醇、氯仿、正丁醇、蒸馏水提取，得到极性不同的4部分产物，利用肉汤稀释法测定其对 MRSA 和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌( MSSA) 的最低抑菌浓度( MIC) ; 体内实验部分: 采用腹腔注射 MRSA 法建立小鼠感染模型，分别给予蓝玉簪龙胆水提液高、中、低剂量，银黄胶囊治疗 15 d，并与模型对照组比较，观察存活率。结果：体外实验: 蓝玉簪龙胆各极性组分对 MRSA 和 MSSA 菌株均有不同程度的抑菌作用，其中正丁醇组分抑菌作用最强，其次为乙醇、水层组分; 体内试验: 除了蓝玉簪龙胆大剂量组，其余各治疗组存活率均高于模型对照组，而蓝玉簪龙胆中剂量组存活率最高。结论蓝玉簪龙胆对 MRSA 和 MSSA 均具有一定的抗菌作用，而且敏感性差异无显著性; 对MRSA 感染小鼠有一定治疗作用[3]。胡景玉等为了了解衡水地区大肠埃希菌的药

敏情况，采用肉汤稀释法18种抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）并计算其MIC

50

和

MIC

90

。结果亚胺培南、哌拉西林、他唑巴坦和头孢哌酮、舒巴坦显示良好的抗菌

作用，其MIC

50分别为0.5 μg/ml、1 μg/ ml、0.5 μg/ ml；MIC

90

均为2 μg/ml，

其他药物显示不同程度的耐药，且大肠埃希菌产ESBLs的检出率较高。结论检出的大肠埃希菌存在多重耐药，仅对亚胺培南、哌拉西林、他唑巴坦和头孢哌酮、舒巴坦普遍敏感[4]。Kianbakht S等通过肉汤稀释法研究刺蒺藜不同部位（果、茎叶、根）的甲醇提取物对金黄色葡萄球菌ATCC 29213、粪肠球菌ATCC 29212、肠埃希氏菌ATCC 25922、绿脓杆菌ATCC 27853四种细菌的抗菌能力，研究结果表明：果、茎叶对四种菌的MIC值均为2mg/ml；根的甲醇提取物对MIC值对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肠埃希氏菌均为4mg/ml，对绿脓杆菌的MIC值为2mg/ml[5]。

1、1、3琼脂平板稀释法

将不同浓度的抗菌药物，分别加入到定量的琼脂培养基中，混匀，制成固体含药平皿，使每一个平皿中所含抗菌药物的浓度相差2倍，用多点接种仪把待测细菌点种到含有抗菌药物的琼脂培养基的表面上，在特定温度下培养适当时间后，平皿上无菌落生长的最低药物浓度为抗菌药物对受试菌种的最低抑菌浓度。每一次实验都应用标准菌株做质控。琼脂平板稀释法本法的特点是可同时进行大量菌株的药敏测定。也适用于中草药和厌氧菌的药敏测定。

如汪黎虹等应用超微粉碎法将虎杖、石榴皮、马齿苋、苦楝皮、大黄等10种中药进行加工处理至粒径为5~10μm后，利用琼脂稀释法测定其实验室近年来收集的患病鳗鲡中分离得到的18 株常见致病菌的抑菌作用。结果表明: 上述10种中药单用对除B12 肺炎克雷伯菌以外的17株养殖鳗鲡主要致病菌均有一定的抑制作用，其平均抑菌浓度( MIC) 范围为0. 165~128 mg /mL，平均杀菌浓度(MBC) 范围为0. 210~128 mg /mL[6]。

1、1、4浓度梯度法

浓度梯度试验是一种定量的抗生素药敏测定技术，可用于非苛养革兰阳性和阴性需氧菌(如肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌和肠球菌)以及苛养菌(如厌氧菌、肺炎链球菌和嗜血杆菌)的药敏测定。该系统包含有一个预先制备好的抗生素浓度梯度，可用于在琼脂培养基判断某抗生素对微生物的最小抑菌浓度(MIC)。如刘芳等的武汉地区住院患儿感染肺炎链球菌的耐药状况。

如刘芳等的收集医院2009年1-12月住院患儿分离的肺炎链球菌1521株, 采用纸片扩散法及E-test法进行抗菌药物敏感试验;按CLSI 2008 年版判断结果；使用X2检验分析耐药性的变化。研究结论为武汉地区住院患儿分离的肺炎链球菌对红霉素、克林霉素、四环素及磺胺甲噁唑、甲氧苄啶的敏感率极低, 对左氧氟沙星及万古霉素均有极高的敏感率, 对青霉素仍保持较高的敏感率, 可作为治疗普通肺炎链球菌感染的首选药物[7]。

1、1、5 试管两倍稀释法

试管两倍稀释法取生长浊度达9×108mg/ml菌液，菌液用培养液稀释，接种于无菌试管中，然后加入不同浓度的抗菌药物或未知药物，37℃孵育。16～24 h，以无细菌生长的最低浓度为MIC。将无细菌生长的完全清晰液再移种于不含抗菌药物的血平板中，经37℃过夜培养，菌落数不超5个的平板的最低药物浓度即为该药物的MBC。一般以MIC来评价细菌对药物的敏感度。

马加庆等的采用试管两倍稀释法观测利胆止痛胶囊在体外对甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌及痢疾杆菌、大肠杆菌和沙门菌生长