小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与吞噬功能测定
吞 噬百分 率=
吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数 200 个巨噬细胞( 吞噬及未吞噬的)
×
100% ; 吞噬指数= 被2吞00噬个的巨鸡噬红细细胞胞÷2
2 实验结果
2. 1 倒置显微镜下巨噬细胞形态
台酚蓝排斥法检测巨噬细胞的成活 率> 95% 。巨噬细胞 在 0. 5h 内贴壁, 随后细胞逐 渐增大, 形 状呈椭圆 形, 梭形, 不 规则 形, 形成伪足 或突起 等, 形 态典型, 直 至形成单 层细 胞, 见图 1。
表 1 胆源性胰 腺炎危险因素 L og istic 多因素回 归分析结果
因素
偏回归系数
标准误
W al d
P值
OR 值
OR95. 0% 可信限
下限
上限
A1
- 0. 851
0. 1981
14. 785
0. 001
0. 365
0. 256
0. 571
A2
0. 799
0. 220
13. 542
0. 0002
HEIL O N GJIA N G M EDI CI NE A N D PHA RM ACY Oct . 2007, V ol. 30 N o . 5 · 9·
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与吞噬功能测定
张 华, 曲震寰, 王 莹, 阮洪生, 葛文中, 秦学功
( 黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院, 黑龙江 大庆 163319)
布的搪瓷盒中, 移至 37℃孵 箱温育30min, 然后以生理盐水液
漂洗, 晾干。1: 1 丙酮- 甲醇溶液固定5min, 晾干后以4% ( V /
V ) G iemsa/ 磷酸缓冲液染色 30min, 流水冲洗, 自然晾干。
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法(超详细~)
小鼠原代腹腔巨噬细胞提取方法（超详细）
实验前准备：
超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、2.5mL注射器、细胞吸管、3％肉汤淀粉溶液、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、细胞计数版、倒置显微镜等。
实验操作步骤
（1）我们对健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射3％肉汤淀粉溶液1 mL，持续3d，以便刺激腹腔巨噬细胞产生。
注：3％肉汤淀粉溶液提前配制，高温除菌后使用。
（2）小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒。
（3）固定小鼠，暴露腹腔。
（4）无菌条件下用剪刀沿腹中线剪开皮肤，暴露腹膜，切记勿伤及腹膜壁。
（5）向腹膜腔注射DMEM培养基3mL，并轻柔小鼠腹部片刻。
（6）用吸管反复冲洗腹膜腔并回收灌洗液。
（7）移入无菌的10ml的离心管中，以1000r/min，离心 5min，弃上清液。
（8）加入 5ml DMEM 培养基重悬细胞，上述步骤重复两次。
（9）加入含有10% FBS的DMEM培养液重悬细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×106 个/mL。
（10）将细胞悬液接种于 6 孔培养板中，放于37℃、5％二氧化碳
饱培养箱中培养，待后续实验研究。
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与吞噬功能测定
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与吞噬功能测定张华;曲震寰;王莹;阮洪生;葛文中;秦学功【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2007(030)005【摘要】目的:建立小鼠腹腔巨噬细胞体外分离培养的方法,并测定其体内吞噬功能.方法:0.5%淀粉生理盐水诱导小鼠腹腔产生巨噬细胞,体外分离培养并观察细胞形态;体内吞噬5%鸡红细胞悬液,测定细胞吞噬百分数和吞噬指数.结果:小鼠腹腔巨噬细胞活率＞95%,形态典型,形成良好细胞单层;平均吞噬百分率和吞噬指数分别为26%和0.28.结论:本方法可用于小鼠腹腔巨噬细胞培养研究.【总页数】2页(P9,10)【作者】张华;曲震寰;王莹;阮洪生;葛文中;秦学功【作者单位】黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,黑龙江,大庆,163319【正文语种】中文【中图分类】R329.2+8【相关文献】1.低氧对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力及氧依赖杀伤功能的影响 [J], 高世兰;张晓娜;胡方杰;李积东;蒲小燕;永胜;2.玉屏风散对小鼠红细胞免疫功能及腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 [J], 张红军;张晓莉;等3.BALB/c裸鼠与BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的比较 [J], 严朗;侍雯婧;田逸君;张吉芊竹;陈基快4.BALB/c裸鼠与BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的比较 [J], 严朗;侍雯婧;田逸君;张吉芊竹;陈基快5.小鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发中活性氧测定——影响小鼠腹腔巨噬细胞吞噬发光的实验因素 [J], 孙自镛;周宜开因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验具体步骤及方法巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。
步骤一、实验材料准备1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。
2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。
碘酒绵球和酒精绵球。
3. 器械：一次性注射器、手术器械。
二、实验方法如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。
不采用刺激物，直接开始下面的步骤。
1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。
用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。
2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。
3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。
台盼蓝拒染法计数，将细胞稀释到目的浓度后，接种即可。
4. 如果是作为饲养细胞使用，调整浓度至2x105个/mL，接种到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作为其它实验使用，可以调整成2x106/mL，加到24孔平底培养板中，1 mL/孔；5% CO2温箱孵育2 h后，换液，并用RPMI1640培养基洗1-2次，弃去未粘附细胞，贴壁细胞为单层的巨噬细胞。
三、结果巨噬细胞刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。
小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定
小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定[摘要] 目的建立小鼠三种不同部位巨噬细胞体外分离培养的方法，并对其进行鉴定。
方法分别从小鼠腹腔、脾脏、骨髓中分离获取巨噬细胞，经台盼蓝染色计数后于含10%胎牛血清的DMEM培养液、1%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养；通过活细胞形态观察；HE 染色光镜观察；吞噬鸡红细胞功能检测；酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。
结果获得高纯度的巨噬细胞，具有巨噬细胞的形态特征，具备良好的吞噬功能，鸡红细胞吞噬率分别为腹腔94.68%，脾脏92.47%，骨髓93.11%；酸性磷酸酶染色阳性率为腹腔89.43%，脾脏85.21%，骨髓88.55%；α-醋酸奈酚酯酶染色阳性率为腹腔85.32%，脾脏81.81%，骨髓85.76%。
结论小鼠三个不同部位均可简便实用的分离出巨噬细胞，可以满足不同的研究目的。
巨噬细胞不仅是许多病原体的宿主细胞,而且在先天性和后天性免疫应答过程中起着关键性作用[1-3],比如调节促炎和抗炎细胞因子的释放、吞噬或杀死胞内微生物和肿瘤细胞、降解和提呈抗原等。
它还可以与其他免疫细胞协同发挥更大的功能，比如树突状细胞、粒细胞、NK细胞和T细胞等。
小鼠巨噬细胞吞噬作用是反映机体非特异性免疫功能的主要指标，也是临床免疫学实验常用的方法之一。
现将已有的巨噬细胞分离方法改进，从3种不同部位分离小鼠巨噬细胞，并做以对比。
1 材料与方法1.1主要试剂和仪器DMEM培养基（Hyclone）；RPMI-1640培养基（GIBCO）；胎牛血清（GIBCO）；倒置显微镜（Olympus）；CO2培养箱（Binder，Thermo）。
1.2 从小鼠腹腔中分离巨噬细胞（1）取6~8周龄左右的小鼠，腹腔注射2mL无菌的液体石蜡。
待3~4d后收集腹腔细胞。
（2）颈椎脱臼法法处死小鼠，消毒，用注射器抽取5mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1~2 min，静置5min，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中。
小鼠腹腔巨噬细胞培养详细方法
小鼠原代腹腔巨噬细胞培养一．实验用品：器材：眼科镊，眼科剪，Pe铝箔，离心管（50ml两个），针管（5ml和1ml），酒精灯，移液枪，枪头，酒精棉球，75％酒精，酒精喷壶，烧杯。
器械：显微镜，细胞计数版，计数器。
试剂：PBS（磷酸盐缓冲液），TF,TG(巯基乙醇酸钠），含10％TBS的RPMI-1640培养液（重悬细胞）。
二．实验步骤：1.提取小鼠巨噬细胞前3-5天：向每只小鼠腹腔注射2ml-2.5ml的3％的TG(诱导巨噬细胞向M1型转化），充分酒精消毒。
2.前1天：高压器械（剪刀，镊子，铝箔纸，烧杯）3.提取巨噬细胞：三．结果：巨噬细胞：刚贴壁时偏圆形，或者类似鹅卵石形状，然后慢慢伸出伪足，铺开呈三角形或多角形。
巨噬细胞有吞噬的特性，当与细菌混合在一起的时候，在40倍物镜下可以看到巨噬细胞吞噬细菌，因此，巨噬细胞作为饲养细胞可以清除部分污染的细菌、支原体和部分细胞碎片。
巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。
巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。
巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养的应用：（1）用于细胞保种；（2）用于分子生物学研究；（3）用于基因治疗研究。
*注意：1. 巨噬细胞是终末分化细胞，不会增殖。
2. 很难消化下来，所以接种的时候，必须直接接种到目的培养器皿中。
3. 严格无菌操作，在超净台内进行。
4. 为避免交叉感染，每一只小鼠更换注射器。
5. 吸管吸取细胞悬液的时候，尽量不要吸到大小肠，否则容易引起成纤维细胞污染。
换液：培养液从4度取出回温，超净台中操作，用移液枪换液即可。
巨噬细胞的分离、纯化与培养
一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。
腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。
3～4天以后收集腹腔细胞。
2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。
放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。
消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H （含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。
轻轻按摩腹部5分钟。
3．以下均无菌操作。
剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。
合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。
用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。
二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。
仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。
以下过程注意无菌操作。
小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。
用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。
2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。
向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。
用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。
再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。
平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。
小鼠腹腔巨噬细胞分离
小鼠腹腔巨噬细胞分离
小鼠腹腔巨噬细胞分离
1．取6周左右的小鼠，腹腔注射2ml 4％巯基乙酸肉汤或淀粉肉汤。
3～4天以后收集腹腔细胞。
2．颈椎脱臼法处死小鼠，消毒腹部，沿腹中线注入5mL冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）和2mL 空气。
轻轻按摩腹部5分钟。
3．剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H 冲洗腹腔2～3次。
合并渗出液于离心管中，4℃离心400g 5分钟，去上清液。
4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞1次，4℃离心400g 5分钟，去上清液。
用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并检测细胞活力。
分离巨噬细胞的方法
分离巨噬细胞的方法巨噬细胞是免疫系统中重要的成分之一，其功能是吞噬和消化细菌、病毒、细胞残骸等病原体或异常细胞。
为了研究巨噬细胞的生理和病理功能，科学家需要从体内或体外分离出巨噬细胞。
下面将介绍几种常用的分离巨噬细胞的方法。
1. 腹腔巨噬细胞分离法这是一种常用的方法，适用于小鼠或大鼠的巨噬细胞分离。
首先，用适当的方法将小鼠或大鼠的腹腔打开，将腹腔洗液抽取出来。
洗液中含有大量的巨噬细胞。
然后，将洗液经过离心，将沉淀中的巨噬细胞收集起来。
最后，用适当的培养基培养巨噬细胞，使其继续生长和分化。
2. 骨髓巨噬细胞分离法这种方法适用于从小鼠或大鼠的骨髓中分离巨噬细胞。
首先，将小鼠或大鼠的骨髓从骨骼中取出，并用适当的方法将骨髓细胞洗涤干净。
然后，将洗液经过离心，将沉淀中的骨髓巨噬细胞收集起来。
最后，用适当的培养基培养骨髓巨噬细胞，使其继续生长和分化。
3. 化学法分离巨噬细胞这种方法利用化学试剂的特定性质，使巨噬细胞与其他细胞分离。
例如，可以利用巨噬细胞表面特定的受体，使用特定的抗体标记巨噬细胞，并通过离心或磁珠分离得到纯净的巨噬细胞。
此外，还可以利用化学试剂的特殊性质，如巨噬细胞对特定染料的亲和性，来分离巨噬细胞。
4. 细胞排序分离巨噬细胞细胞排序是一种高级的细胞分离技术，可以根据细胞的特定性质，如大小、形状、表面标记等，将巨噬细胞从混合细胞中分离出来。
这种方法可以高效地分离出纯净的巨噬细胞群体，但设备和技术要求较高。
总结起来，分离巨噬细胞的方法有腹腔巨噬细胞分离法、骨髓巨噬细胞分离法、化学法和细胞排序法。
这些方法各有优缺点，科学家可以根据实验需求选择适合的方法。
通过分离巨噬细胞，科学家可以更好地研究巨噬细胞的生理和病理功能，为疾病的治疗和预防提供理论基础。
小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养
小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养
目的:建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离的简便方法,为低强度激光照*对巨噬细胞功能的影响研究提供实验细胞.方法:以无血清的RPMI-1640培养液灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中培养.采用倒置显微镜观察细胞形态,台盼蓝染*计算存活率,瑞氏染*计算纯度.结果:获得高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征.结论:本法是一种简便实用的分离小鼠腹腔巨噬细胞的方法.
肖丹,XIAODan(第四*医大学*事预防医学系,陕西,西安,710032)。
小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养
小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养一、引言巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，可以通过吞噬微生物、吸收细胞碎片等功能来保护机体免受外来侵害。
近年来越来越多的研究者将目光投向了巨噬细胞的研究领域，例如探究其功能调控、对特定疾病的影响等。
因此，了解如何分离和培养小鼠腹腔巨噬细胞是非常重要的。
二、实验材料1.小鼠（BALB/c或C57BL/6等品系）2.70%乙醇3.磷酸盐缓冲液（PBS）4.腺苷酸二钠（ADT）5.玻璃钝刀6.吹瓶（20ml）7.离心管（50ml）8.腹腔灌注针头9.离心机10.培养皿11.消化液（十氟化十六烷、胰酶混合液等）12.FBS（fetal bovine serum）13.RPMI-1640培养基14.静菌枪、离心管、显微镜等三、实验步骤1.准备工作选用2~3个月龄（约20g体重），性别未限制的小鼠，放至3-4人一笼中，在恒定温度（22-24℃）、湿度（40-60%）下，24小时自由进食饮水，减轻其压力。
实验前，将所需物品全部准备好，消毒好所需器材。
消毒方式可以选择用70%的乙醇喷震或者紫外线照射15min等方式进行消毒，确保实验平凡洁净。
2.腹腔巨噬细胞的分离（1）小鼠腹腔巨噬细胞的处理将麻醉过的小鼠放于消毒好的操作台上，用70%乙醇消毒好腹部，剖开腹腔，将肝、脾、小肠等剔除，留下含有腹腔巨噬细胞（PC）的腹腔。
用离心管接住腹腔内的生理盐水，加1mM ADT处理吸入至腹腔中，轻摇腹腔5分钟，将其取出至消化液中，消化液中加入0.2%的凯西酶和50ug/mL的DNA酶，然后用13g钩头灌注针将其搅拌并吸入管内灌注30分钟，在摇床上50转/分钟恒温摇晃1h。
将腹腔液收集到离心管内离心，离心350g 20分钟，去除上清流体，重悬沉淀细胞于PBS液中。
（2）巨噬细胞的筛选将离心沉淀细胞的上清液放在吹瓶中，吹出细胞液，离心25min后，去掉上清，用PBS液中悬浮细胞过滤到细胞培养皿70%PMI-1640中化为单细胞。
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定
小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。
方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。
采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。
结果获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。
结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。
【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定0.引言巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1，2] ，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。
有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。
本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。
1.材料与方法1.1实验对象清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。
1.2实验方法1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。
轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。
再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。
用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。
倒置显微镜观察细胞形态。
1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定（1）台盼蓝染色计算存活率。
4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。
小鼠腹腔巨噬细胞的分离及其功能性观察
小鼠腹腔巨噬细胞的分离及其功能性观察一、实验目的1. 学习小鼠腹腔巨噬细胞的制备技术；2. 通过对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬蟾蜍红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义；3.掌握小鼠腹腔注射给药及脊椎脱臼处死方法。
二、实验器材显微镜，注射器，盖玻片，载玻片，滴管，试管，烧杯，离心机，离心管三、试剂1. 任氏液：Nacl 6.5gKCl 0.14gCacl2 0.12gNaH2PO4 0.01gNaHCO3 0.20g蒸馏水 1000ml2. 阿氏液（红细胞保存液）：葡萄糖 2.05g柠檬酸钠 0.89g柠檬酸 0.05gNaCl0.42g蒸馏水 100ml调pH至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min,置4℃冰箱保存。
3. 4%台盼蓝染液：台盼蓝 4gNaCl 0.9g蒸馏水 100ml4．6%淀粉肉汤：牛肉膏 0.3g蛋白胨 1.0gNaCl0.5g蒸馏水 100ml加入可溶性淀粉6.0g，加热促使溶解，再煮沸灭菌，置4℃冰箱保存，使用时以水浴融化，加入适量4%台盼蓝染液混匀。
5. PBS溶液6. 3%NaHCO3溶液四、生物材料1．小鼠（体重20g左右）；2．1%蟾蜍红细胞悬液：采用穿刺法处死蟾蜍后，迅速从心脏采血1ml,放入盛有4ml 阿氏液的瓶中，混匀置4℃冰箱保存备用，使用前加入任氏液离心（1500rpm,10min）洗涤两次，再用任氏液配成浓度为1%的细胞悬液。
五、实验步骤1. 先用右手抓住鼠尾提起，放在实验台上（或放在篮子里，方便固定），用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳和头颈皮肤，将鼠体置于左手手心中，把后肢拉直，用左手的无名指和小指按住尾巴和后肢，前肢可用中指固定，即可在腹部1/2处的一侧注射。
2. 实验时，取一只小鼠，腹腔注射1%蟾蜍红细胞悬液1ml。
（一定要刺破腹腔，不能注射到皮下）另一只小鼠，先腹腔注射1ml淀粉台盼蓝溶液，再腹腔注射1%蟾蜍红细胞悬液1ml。
3.20-30分钟后，用CO2麻醉后再以颈部脱臼法处死小鼠。
免疫实验 腹腔巨噬细胞的分离与免疫细胞化学染色
小鼠腹腔巨噬细胞分离 及免疫细胞化学染色
实验原理
原理：抗原抗体反应＋免疫标记技术 应用：细胞的蛋白质抗原进行亚细胞水平的
定位；观察抗原分布；比较不同抗原的分布 差异；设立对照后可检测细胞表达蛋白质的 相对量。 检测方法：示踪物的荧光或酶的有色反应、 放射性或高电子密度可在光镜或电镜下进行 定性或定位观察。
分子杂交
分子杂交
原理：具有一定同源性的两条核酸 单链在一定条件下可按碱基互补原 则退火形成双链。
应用细胞因子核酸探针，通过 分子杂交检测细胞内细胞因子 mRNA的表达。 斑点杂交
Northern blot Cell/tissue原位杂交
特特 定定 DD NN 片A片A 段段 的 体的 体 外外 增扩 增扩
温箱孵育60min，PBS冲洗。 5. 各加50ul二抗，37度温箱避光孵育30min，PBS冲洗3次，每次
2min。 6. 加入DAB显色液各一滴，避光室温显色5min后显微镜下观察。
腹腔巨噬细胞染色
细胞因子的检测技术
细 胞因子 的检测 技术
机体的 免疫细 胞 (如淋巴 细胞、 单 核 巨噬细 胞) 及非免 疫细胞能 产生不 同 种 类的细 胞因 子，它 们在免 疫应答 中 起 调控作 用。 细胞因 子检测 是判断 机 体 免疫功 能的 重要指 标，对 某些疾 病 的 诊断、 病程 观察、 预后判 断等是 十 分必 要的。
实验目的
检测小鼠腹腔巨噬细胞表面细胞 膜分子CD68的表达情况
实验材料
四人一组
小鼠1只/组
器材名称 1ml 5ml注射器 3%H2O2-甲醇液
剪刀、镊子 滴管（配胶帽）
EP管 载玻片 加样器（1000/20ul） 加样器头 倒置显微镜 酒精棉
小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取
=====WORD完整版----可编辑----专业资料分享=====小鼠腹腔巨噬细胞制备及提取实验动物：6-8周的SPF级雄性BALB/C小鼠，小鼠取细胞前三天每天腹腔注射0.5-1mL淀粉肉汤，或者取细胞前一小时注射1mL淀粉肉汤。
试剂：75% 乙醇、RPMI 1640 （Gibcol/BRL，美国）、含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)步骤：1、取6周左右的小鼠，剃去腹部的毛并消毒。
2、引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入75%酒精中3～5秒。
3、倒立小鼠，置动物于解剖台上，固定四肢，75%酒精擦洗腹膜壁后，用9号针头5ml注射器沿腹中线将预冷的不含小牛血清的PBS 5mL注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。
轻轻按摩腹部2-3分钟，静置5-7分钟。
4、无菌条件下，剪开腹壁，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。
再用75%酒精擦洗腹壁。
5、用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸入注射器内。
小心拔出针头。
把液体注入50ml离心管中。
再用同样容量的PBS冲洗腹腔2～4次。
合并渗出液于50 mL离心管中。
直至冲洗液变澄清。
6、4℃250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。
7、用PBS培养液洗涤细胞3次，每次4℃250×g（1000 rpm/min）离心10min，去上清。
8、用含10%小牛血清RPMI-1640液(10%牛胎血清、青霉素100U/ml、链霉素10μg/ml)悬浮细胞。
将调整细胞浓度调整至5×106 cells/mL 加入培养皿中培养9、将培养皿置于5% CO2、37℃培养箱中培养3 h，然用37℃预温的RPMI-1640培养液清洗培养皿2-3次，去除未贴壁的细胞，即得到纯化的贴壁巨噬细胞。
种96孔板。
2h细胞贴壁。
小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养
·６３８·现代生物医学进展删．ｂｉｏｍｅｄ．ｎｅｔ．ｃａＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＭｏｄｅｒｎＢｉｏｍｅｍｃｉＩＩｅ２００８Ｖ０１．８Ｎｏ．４小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养李海涛１肖丹２屈学民１刘渊声１马长升１杨继庆１（１第四军医大学生物医学工程系陕西西安７１００３２；２第四军医大学军事预防医学系陕西西安７１００３２）摘要目的：建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离的简便方法，为低强度激光照射对巨噬细胞功能的影响研究提供实验细胞。
方法：以无血清的ＲＰＭＩ．１６４０培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含１０％小牛血清的ＲＰＭＩ．１６４０培养液中培养。
采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。
结果：获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。
结论：本法是一种简便实用的分离小鼠腹腔巨噬细胞的方法。
关键词：小鼠；巨噬细胞；分离中图分类号：Ｑ８１３文献标识码：Ａ文章编号：１６７３—６２７３【２００８１０４—０６３８—０２ＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＭｏｕｓｅＰｅｒｉｔｏｎｅａｌＭａｃｒｏｐｈａｇｅｓＬＩＨａｉ－ｔａｏ，ＸＩＡＯＤａｎ，ＱＵＸｕｅ－ｍｉｎ，ＬＩＵＹｕａｎ－ｓｈｅｎｇ，ＭＡＣｈａｎｇ－ｓｈｅｎｇ，ＹＡＮＧＪｉ－ｑｉｎｇ（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｔｈｅＦｏｕｒｔｈＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ＇ａｎ７１００３２，Ｃｈｉｎａ；２ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＰｒｅｖｅｎｔｌ＂ｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅＦｏｕｒｔｈＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，尉，翩７１００３２，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳｌｌＲＡＣＴＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｅｌｌｓｆｏｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｌｏｗ－ｅｎｅｒｇｙｌａｓｅｒｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｍｏｕｓｅ’ＳｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｃａｖｉｔｙｗａｓｄｏｕｃｈｅｄｂｙｕｓｉｎｇＲＰＭＩ一１６４０ｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｏｕｔＦＣＳ，ａｎｄｔｈｅｍｏｕｓｅ’Ｓｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄａｎｄｏｂｔａｉｎｅｄ，ｂｅｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＲＰＭＩ一１６４０ｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１０％ＦＣＳ．ＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓＷａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓＷａｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｒｙｐａｎｂｌｕｅｓｔａｉｎ．ＴｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＷｒｉｇｈｔ’Ｓｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｈｉｇｈｌｙｐｕｒｉｆｉｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｈａｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｍａｃｒｏｐｈａｇｅｉｎｏｒｇａｎｉｓｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｅａｓｙｔｏａｐｐｌｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｏｕｓｅ；Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；ＳｅｐａｒａｔｉｏｎＣｈｉｎｅ∞ＬｉｂｒａｒｙＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｑ８１３Ｄｏｃｕｍｅｎｔｃｏｄｅ：ＡＡｒｔｉｃｌｅＩＤ：１６７３－６２７３（２００８）０４－０６３８－０２前言巨噬细胞是机体的重要防御细胞，在抗感染、抗肿瘤及免疫调节中起着非常重要的作用。
小鼠腹腔巨噬细胞 提取量
小鼠腹腔巨噬细胞提取量
小鼠腹腔巨噬细胞的提取量可以根据实验所需的具体目的和方法来确定。
以下是一种常用的提取方法：1. 将小鼠处死后，用70%乙醇消毒小鼠腹部。
2. 用剪刀将小鼠腹部的皮肉切开，暴露腹腔。
3. 使用无菌吸管或针头，注入预冷PBS缓冲液到腹腔内，轻轻摇动或用力揉搓腹部几分钟，以充分洗涤腹腔巨噬细胞。
4. 用吸管或注射器将洗涤液吸取出来，转移到离心管中。
5. 对洗涤液进行离心，速度和时间要根据巨噬细胞的大小和沉降速度来确定。
通常，离心速度为
300-400 g，离心时间为5-10分钟。
6. 将上清液去除，留下含有巨噬细胞的沉淀。
7. 再次加入适量的预冷PBS缓冲液进行洗涤，重复上述离心步骤。
8. 最后，根据实验要求，将沉淀溶解或悬浮于适合的细胞培养液中，用于后续实验。
需要注意的是，提取量的多少受到小鼠体内巨噬细胞的数量以及实验处理步骤的差异等因素的影响。
因此，在每个实验中，都需要根据具体实验要求进行优化和调整。
《小鼠腹腔巨噬细胞的快速提取及培养》.pdf
小鼠腹腔巨噬细胞的快速提取及培养范仕郡,刘㊀鑫,黄㊀敏,王㊀宁,郑㊀江㊀(第三军医大学西南医院中心实验室,重庆400038)㊀㊀[摘㊀要]㊀目的㊀建立一种小鼠腹腔巨噬细胞快速提取的方法,为细胞实验提供便捷㊂方法㊀用生理盐水灌洗小鼠腹腔,分离获取小鼠腹腔巨噬细胞,转入高糖DMEM 培养液中培养㊂采用台盼蓝染色计算存活率,瑞氏染色计算纯度,倒置显微镜观察细胞形态㊂结果㊀获得较高纯度的巨噬细胞,具备巨噬细胞的形态特征㊂结论㊀本方法是一种简便实用的提取小鼠腹腔巨噬细胞的方法㊂㊀㊀[关键词]BALB /c 小鼠;巨噬细胞;提取;培养;鉴定㊀㊀[中图分类号]Q813.1㊀[文献标识码]A㊀[文章编号]1672-5042(2015)02-0130-02㊀doi:10.11659/jjssx.11E014005㊀[基金项目]国家自然科学基金项目(81171781)㊀[收稿日期]2014-11-12㊀㊀[修回日期]2014-12-20Establishment of a rapid method for the isolation of murine peritoneal macrophagesFAN Shi-jun,LIU Xin,HUANG Min,WANG Ning,ZHENG Jiang㊀(Central Laboratory,Southwest Hospital,Third Military Medi-cal University,Chongqing 400038,China)㊀㊀Abstract :Objective ㊀To establish a rapid method for the isolation of murine peritoneal macrophages.Methods ㊀Abdominal lavagewas performed with NS and the peritoneal macrophages was purified from the lavage,which was later transferred into high glucose DMEM cul-ture medium.Cell viability was measured via the typan blue staining.Purity was observed via Wright's stain.Results ㊀High purity macropha-ges with typical morphology were obtained.Conclusion ㊀A simple and realistic method was set up for the isolation of murine peritoneal mac-rophages.㊀㊀Keywords :BALB /c mice;macrophage;extraction;culture;identification㊀㊀巨噬细胞是一类重要的天然免疫细胞,来源于外周血中的单核细胞,具有吞噬降解细菌㊁释放炎症介质㊁介导炎性细胞趋化㊁抗原提呈等活性,在抗感染㊁抗肿瘤免疫中发挥着非常重要的作用[1-2]㊂因此研究巨噬细胞的功能,对于深入理解机体免疫防御和免疫调节机制具有重要意义㊂获取原代细胞是体外研究巨噬细胞功能的重要方法㊂巨噬细胞在肺㊁肝㊁脑等实质器官以及腹腔等空腔部位以不同的形式分布㊂国内外已有不少文献报道从多种组织器官中成功分离和纯化巨噬细胞[3-5]㊂然而在实质脏器中的巨噬细胞,往往受到环境介质中各种理化和生物刺激因素的影响,已发生炎性活化或产生了定向分化,为其体外研究造成了干扰㊂而腹腔中存在大量静息状态的巨噬细胞,且腹腔中细胞种类较少简单,易于分离,是获取巨噬细胞的常用部位[6-9]㊂目前有关腹腔巨噬细胞的分离方法较为复杂,且操作耗时较长㊂本方法在既往文献报道基础上,对小鼠腹腔巨噬细胞提取方法加以改良,建立了一种更为简便实用的小鼠腹腔巨噬细胞的提取方法㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料及实验设备㊀㊀实验用材料及试验设备有:8周龄BALB /c 雌性小鼠(由北京华阜康生物科技股份有限公司提供)㊁生理盐水㊁胶头滴管㊁75%乙醇㊁眼科剪㊁眼科镊㊁10mL 一次性注射器㊁50mL 离心管㊁台盼蓝㊁瑞氏染液㊁奥林巴斯IX71倒置显微镜㊁奥林巴斯E400显微镜㊁细胞培养箱等㊂1.2㊀实验方法1.2.1㊀实验准备㊀㊀将眼科剪㊁眼科镊㊁胶头滴管高压灭菌;离心管辐照消毒;BALB /c 小鼠3只禁食8h;实验前将超净台紫外线消毒30min㊂1.2.2㊀细胞提取㊀㊀将小鼠脱颈椎处死,并浸入75%乙醇中10s㊂然后取出小鼠,沥干,将其仰卧于不锈钢方盘上㊂用注射器吸6mL 生理盐水液注入腹腔中,轻揉小鼠腹部2min,使液体在腹腔内充分流动㊂用眼科镊提起下腹皮肤,使动物微倾向一侧㊂剪开腹部皮肤后在肌肉层剪1个小口,用胶头滴管将腹腔液吸出转入离心管中㊂每只吸出量约为4~5mL㊂1.2.3㊀细胞培养㊀㊀在4ħ条件下,将收集的腹腔灌洗液在1000r /min 条件下离心10min,去上清,加入高糖DMEM 细胞培养液用细胞计数板计数㊂显微镜下(10ˑ100倍)计数巨噬细胞㊂调整细胞浓度至所需,接种至细胞培养瓶,37ħ培养箱孵育4h,充分贴壁后,弃上清,除去非粘附细胞再加入高糖DMEM 细胞培养液,放回培养箱中培养备用㊂2㊀结果2.1㊀台盼蓝染色㊁瑞氏染色结果㊀㊀分别用台盼蓝染色计数(图1a)㊁瑞氏染色计算纯度(图1b)㊂台盼蓝染色后,3min 内,镜下分别计数活细胞和死细胞㊂死细胞被染成蓝色,而活细胞呈无色透明状㊂细胞活力(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)ˑ100%>95%㊂瑞氏染色后,在镜下通过细胞形态计数巨噬细胞和细胞总数㊂巨噬细胞获得率(%)=巨噬细胞细胞总数/细胞总数ˑ100%>90%㊂a:台盼蓝染色;b:巨噬细胞瑞氏染色,箭头指示为瑞氏染色后巨噬细胞图1㊀提取细胞台盼蓝染色㊁瑞氏染色(ˑ1000)2.2㊀细胞形态观察㊀㊀培养12h 后,在倒置显微镜下可观察到细胞呈椭圆形㊁多角形或不规则形,部分贴壁(图2a)㊂培养24h 后观察可以观察到细胞贴满培养瓶,大部分出现伪足㊂部分细胞伸展开并牢固粘附在培养瓶表面(图2b)㊂a:培养12h 后细胞形态;b:培养24h 后细胞形态图2㊀培养后细胞形态3㊀讨论㊀㊀在鉴定细胞方面,采用台盼蓝染色其原理是活细胞的胞膜结构完整,台盼蓝不能够进入胞内,不能着色㊂反之死细胞的细胞膜通透性增加,台盼蓝进入后被染成蓝色㊂因此,采用台盼蓝染色计数死细胞和活细胞非常简便快捷,是组织和细胞培养中经典的鉴定染色方法㊂瑞氏染液为中性染料,它使细胞核及胞浆着色㊂染液中含有缓冲液来调节酸碱度,因此细胞染色后,蓝色和红色都比较适中,细胞核㊁胞浆显色都非常清楚,是目前在细胞染色中最简单和常用的方法㊂在细胞的提取过程中要注意无菌操作,注意器械和实验环境的消毒㊂选用雌性小鼠是因其肠壁脂肪较少,方便腹腔液的收集㊂周龄较大的小鼠腹腔巨噬细胞数量较少,最好选用6~8周龄小鼠㊂㊀㊀巨噬细胞广泛分布于体内,它不仅在非特异性免疫反应中发挥重要作用,而且也是机体特异性免疫中的一类关键细胞[10-11]㊂由于腹腔巨噬细胞多游离存在,易于获得,因此,许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系㊁或筛检免疫增强药物和探讨其作用机制时,往往选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象[12-13]㊂本方法在提取时,和其他方法一样,均是灌洗腹腔后,吸出含有巨噬细胞的灌洗液,然后离心培养㊂但传统方法中均采用淀粉肉汤㊁无菌液体石蜡等腹腔注射预刺激几天,以提高其获得率㊂预刺激处理一方面增加了操作的复杂程度,另一方面可影响分离巨噬细胞的静息特征㊂本方法实验前不需预刺激,减少了污染概率,大大缩短了细胞获取的准备时间,所得的巨噬细胞活力和获得率均大于90%㊂因此,此方法是一种简便实用的小鼠腹腔巨噬细胞的提取方法,为巨噬细胞的相关实验研究奠定了基础㊂[参考文献][1]Classen A,Lloberas J,Celada A.Macrophage activation:classical versus alternative[J].Methods Mol Biol,2009,531(6):29-43.[2]Bayne LJ,Beatty GL,Jhala N,et al.Tumor-derived granulocyte-macro-phage colony-stimulating factor regulates myeloid inflammation and Tcellimmunity in pancreatic cancer[J].Cancer Cell,2012,21(6):822-835.[3]Kitani H,Takenouchi T,Sato M,et al.A novel isolation method for mac-rophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat livercells[J].J Immunol Methods,2010,360(1-2):47-55.[4]Neng L,Zhang W,Hassan A,et al.Isolation and culture of endothelialcells,pericytes and perivascular resident macrophage-like melanocytes from the young mouse ear[J].Nat Protoc,2013,8(4):709-720.[5]Zhang X,Goncalves R,Mosser DM.The isolation and characterization of murine macrophages[J].Curr Protoc Immunol,2008,83(14):1-14.[6]Schon Hegrad MA,Holt PG.Improved method for the isolation of puri-fied mouse peritoneal macrophages [J ].J Immunol Methods,1981,43(2):169-173.[7]黄㊀琼,李志场,杏㊀芬,等.流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能[J].中国药理学与毒理学杂志,2007,21(2):140-146.[8]张㊀华,钟英英,方廖琼,等.羊胎盘免疫调节因子对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响[J].中国生化药物杂志,2005,26(2):70-72.[9]李海涛,肖㊀丹.鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养[J].现代生物医学进展杂志,2008,8(4):638-639.[10]Biswas SK,Mantovani A.Macrophage plasticity and interaction withlymphocyte subsets:cancer as a paradigm [J].Nat Immunol,2010,11(10):889-896.[11]Mantovani A,Biswas SK,Galdiero MR,et al.Macrophage plasticity andpolarization in tissue repair and remodelling [J].J Pathol,2013,229(2):176-185.[12]Davies JQ,Gordon S.Isolation and culture of murine macrophages[J].Methods Mol Biol,2005,290(8):91-103.[13]Ghosn EE,Cassado AA,Govoni GR,et al.Two physically,functional-ly,and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets [J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(6):2568-2573.(编辑:周小林)。
小鼠腹腔巨噬细胞提取方法
小鼠腹腔巨噬细胞提取方法
操作步骤
一、将小鼠以颈椎脱臼法处死，仰卧，固定四肢。
二、依次用碘酒及酒精棉球消毒腹部，以镊子提取腹壁，剪去小块皮肤，继以镊子提取腹腔。
剪一小口，以注射器注入少量冲洗液。
用滴管吸出，再注入冲洗液并吸出，滴管在腹腔内各个位置吸取液体，冲洗每只小鼠腹腔约5ml。
三、将腹腔细胞悬液滴于干净载玻片上，置37度湿盒内，1-2小时后倾去玻片上的液体，
并用腹腔冲洗液轻洗玻片，即可见玻片上有毛玻璃样的单层巨噬细胞粘附，巨噬细胞含量可达90%
四、在显微镜下计算巨噬细胞的百分比，检测分离结果。
小鼠腹腔巨噬细胞的提取与鉴别方法探讨。
腹腔巨噬细胞分离
小鼠腹腔巨噬细胞的分离
根据文献报道的方法获取并培养小鼠腹腔巨噬细胞【19】．3％的脱水硫羟乙酸培养基2ml注入小鼠腹腔，4天后收集腹腔细胞。
先将小鼠颈椎脱臼处死，75％酒精浸泡5分钟，取出小鼠，腹面朝上，用镊子提起小鼠下腹部皮肤，剪开-d,口，撕开皮肤，完全暴露腹膜。
然后用20ml注射器注入8ml无血清培养基，针尖朝上，避开肠和脂肪，回抽，吸出腹腔液，将收集的腹腔液放于50ml的离心管。
细胞悬液1400rpm离心5分钟，用含有10％FCS的RPMI 1640重悬。
若有红细胞，则用"Iris·NH4CI裂解红细胞（此步可省略）。
细胞悬液置入培养板，37"C培养4小时后吸弃上清，用预热培养基洗一次，留下贴壁细胞，即为新鲜分离的小鼠腹腔巨噬细胞。
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小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定
【摘要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。
方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。
采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。
结果获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。
结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。
【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定
0.引言
巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞，具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1，2] ，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。
有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。
本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象，探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。
1.材料与方法
1.1实验对象
清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。
1.2实验方法
1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养
随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。
轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。
再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。
用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。
倒置显微镜观察细胞形态。
1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定
（1）台盼蓝染色计算存活率。
4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。
使用时。
用PBS稀释至0.4%。
（也可买Gibco的成品）；
胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。
染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9：1混合混匀。
（终浓度0.04%）；计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。
镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
（2）瑞氏染色计算细胞纯度。
细胞涂片自然干燥后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。
随后将玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其盖满涂片，大约1分钟后，滴加等量或稍多的II液，用吸耳球轻轻混匀。
冲洗：染色5-10分钟用流水染液，待干。
结果观察，将干燥后的血涂片置显微镜下观察。
先用低倍镜观察涂片，再用油镜。
2.结果
2.1小鼠巨噬细胞的分离培养
（1）巨噬细胞的观察与鉴定.
巨噬细胞体外培养24h观察结果。
如图1
（2）台盼蓝染色结果。
从腹腔分离出来的巨噬细胞进行台盼蓝染色结果显示巨噬细胞的成活率>95%，如图2
（3）瑞氏染色结果。
从腹腔分离出来的巨噬细胞进行瑞氏染色结果显示巨噬细胞的纯度>98%，如图3
图1巨噬细胞体外培养24h观察图2台盼蓝染色结果
图3 瑞氏染色结果
3.讨论及结论
巨噬细胞广泛分布于体内，它不仅参与非特异性免疫，而且是特异性免疫中一类关键的细胞，参与集体众多的生理和病理反应过程，如巨噬细胞的吞噬和消除病原微生物[5]，通过加工处理提成抗原，启动特异性免疫应答[6]，以及巨噬细胞通过细胞凋亡清除吞噬的致病病原体等。
由于腹腔巨噬细胞多游离存在于腹腔的腹水中，易于获得，因此许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系、或筛选免疫增强药物和探讨其作用机制时，往往选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象。
虽然腹腔巨噬细胞的提取方法都是灌胃洗腹腔后，吸出含有巨噬细胞的灌洗液了，但具体操作略有差异[7]。
预先注入的巨噬细胞刺激剂有淀粉溶液、肉汤、糖原等，以产生大量的巨噬细胞计入腹腔。
虽然这些刺激剂能分离收集到大量的巨噬细胞，但注入的大分子抗原物质对巨噬细胞吞噬功能有一定的影响，获得的巨噬细胞已不再是原体内巨噬细胞的基础功能。
本实验提取巨噬细胞的方法是对文献中方法的改进，关键在于活体腹腔注射不含血清的培养液，轻揉腹部后静置几分钟，然后颈椎脱臼致死小鼠，无菌打开腹腔吸取腹腔液[4]。
此方法相对处死小数后进行系列操作而言，洗出的灌洗液中混杂的白细胞少，提取局势细胞的纯度高，是一种简便的小鼠腹腔巨噬细胞的分离方法，为巨噬细胞的相关研究奠定了基础。
【参考文献】
[1]徐远义，黄允宁，常越，等.多抗甲素诱导小鼠腹腔巨噬细胞对癌细胞杀伤增强机制的研究[J].免疫学杂志，2006，22（4）：396-398.
[2]黄琼，李志，杨杏芬，等.流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能[J].中国药理学与毒理学杂志，2007，21（2）：140-146.
[3]张华，钟英英，方廖琼，等.羊胎盘免疫调节因子对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响[J].中国生化药物杂志，2005，26（2）：70-72.
[4]李海涛，肖丹，等.小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养[J].现代生物医学进展杂志，2008，8（4）：638-639.
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[7]尹美珍，李世普，等.大鼠腹腔巨噬细胞的分离培养与鉴定[J].武汉理工大学学报，2009，31（9）：40-42.。