第三章高效液相色谱分析

固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱入口压强（kg/cm2） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
经典液相色谱法
一般规格 75~500 20~30% 10~100
2~5 0.01~1 10~100 1~10 1~20 非仪器化
永久性气体
低、中、高沸点有机 化合物
离子型无机化合物 热不稳定化合物
生物活性分子
总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相 色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的 发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物 学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核 酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物 等物质的分离和分析。
高效液相色谱法 （分析型） 特殊规格 3~20 <5% 10~30 0.1~0.5 20~300 104~105 10-7~10-2 0.05~0.5 仪器化
2．高效液相色谱法与气相色谱法
气相色谱法对挥发性样品是非常有效的分离方法．但是， 对分子量超过300的组分及热分解产品都不适用．由于样品 在工作温度下必须汽化这个特点限制了它的应用．为此， 人们不得不通过柱前衍生法使样品能够汽化，这样大大加 重了分析前处理的复杂性和数据的准确性．
现代液相色谱
现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅 是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化操 作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱 效低，分析周期长。
而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压 输送;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使 柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）； 同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因 此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。
对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径 0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出 20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。 又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯 度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效
第三章 高效液相色谱 分析法
主要内容
• 3-1 HPLC的发展 • 3-2 HPLCE与经典液相色谱法和GC的差
异 • 3-3液相色谱法的原理和特点 • 3-4高效液相色谱的分类和原理 • 3-5液相色谱仪 • 3-6液相色谱的固定相与流动相 • 3-7影响分离的因素与操作条件的选择
3-1 HPLC的发展
色谱柱可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可 以收集单一组分或做制备。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分 配色谱、化合键合色谱Hale Waihona Puke Baidu离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
特点：
高压——压力可达150～350 x105Pa。色谱柱每米降压为
75 kg/cm2以上。 高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份 可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样 品少。
高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这 是它的主要缺点。
3-3液相色谱法的原理和特 点
液相色谱分离原理
原理：是指流动相为液体的色谱技术
液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰 性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动 相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根 据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分 子（溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作 用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
而高效液相色谱只需要样品能制成溶液，不需汽化，不 受样品挥发性的限制．特别适用于高分子化合物，易热降 解的物质及生物活性物质的分离，因此应用面比气相色谱 要高得多．
应用范围 分离效果
选择性
温度 灵敏度 (g/ml)
气相色谱（GC）
高效液相色谱 （HPLC）
占有机物的20% 占有机物的80%
高
更高
流动相是气体，只 能选择固定相
液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：
第一位认识到色谱法是一种有效的分离方法的科学 家是俄国植物学家Tswett.他1903年发表的文章描述 了用100多种不同吸附剂得到的实验结果。 1931年 Kuhn和Lederer用氧化铝和碳酸钙做吸附剂 分离了植物色谱。
按照不同的相可以分为气-固色谱法，气-液色谱法 （GLC），临界状态色谱法，液-固色谱法，液-液 色谱法。
流动相是液体，流 动相、固定相都可 选择。选择性广。
高温
常温（分离效果好）
10-12
10-9
项目
气相色谱法
高效液相色谱法
进样方式 样品需气化或裂解
样品制成溶液
流动相
惰性气体
溶液
分离原理 检测器
吸附和分配
吸附、分配、筛析、亲 和等
TCD、FID、ECD
等
UVD、PDAD、RID等
应用范围
低沸点有机化合 物
3-2 HPLCE与经典液相色 谱法和GC的差异
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高 速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比 经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出 速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高 可达 103cm·min-1.