1 第一章 绪论和基本理论知识

肝细胞产生酪氨酸转移酶特性的丧失；

已证明肝细胞产生酪氨酸转移酶需要激素 (胰岛素、可的松) 的诱导
和与相应细胞基质 (如 Collagen) 的相互作用，只要这些条件存在， 便可产生。


培养细胞分化的改变主要因环境改变所致。
细胞在体外培养时间越长，分化改变越大。

细胞刚离体培养时，先出现的现象可能属不适应，即由于
环境的改变而出现的变化。
2．脱分化或去分化 (Dedifferentiation)

即细胞失掉发生分化的能力。

肝细胞为例，当肝细胞失掉产生精氨酸酶、氨基转移
酶等特性后，则失掉贮存肝糖原能力，并很难再现。

不适应和脱分化两个不同的概念。

不适应是因生存条件的改变使分化发生阻抑。 脱分化很可能是基因变异所致。


单层培养法得以建立了很多细胞系 (Cell Line)。
1948 年 Sanford 创建了单细胞分离培养法，应用这一技术可以建立遗 传性状相同的克隆细胞株 (Cell line 或 Cell Strain)。根据研究工作的 特殊需要. 1951 年 Pomerat 设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中， 便于做显微摄影和细胞代谢等研究。
美国和欧洲细胞库









ATCC（细胞株及胚胎干细胞库） 1）下载细胞库目录：http://www.atcc.org/pdf/tcl.pdf 2）查询细胞株：http://www.atcc.org/SearchCatalogs/CellBiology.cfm 2）胚胎干细胞库：http://stemcells.atcc.org/products/cells.cfm CABRI (包括ECACC、DSMZ) http://www.cabri.org/HyperCat/cells/all.htm CAMBREX http://www.cambrex.com/Content/General/CatalogMap.asp 意大利 I.A.Z. http://www.i-a-z-zellkultur.de/haupt_en/cell.html 欧洲细胞实验室列表（大全) http://www.biotech.ist.unige.it/cldb/labs.html 意大利 IZSLER 细胞库 http://www.bs.izs.it/cataloghi/cellule/ ABi 病毒 http://www.abionline.com/products/viruses/default.htm 德国 PromoCell 原代细胞 http://www.promocell.com/en/Navigate/product0.php3?target1=11&la ng=US Cellgro http://www.cellgro.com/
1）体外培养细胞不仅有分化潜能，实际上随细胞来源种属
和遗传性状的不同，很多细胞也仍然呈现着一定程度的分
化表达现象。

如毛细血管内皮细胞在体外培养时，可形成类似血管样结构，但
仅限初代培养和接种在类似基膜物质底物上生长时才可发生。

说明：

与体内条件越近似，细胞愈易发生分化。 细胞离体培养时间越长，分化能力越差。


(一) 现代组织培养的建立

1907 年，Harrison 创建了盖片覆盖凹窝 玻璃悬滴培养法。

在无菌条件下，用淋巴液做培养基， 培养蛙胚神经组织生活了数周，并曾 观察到神经细胞突起的生长过程。

建立了体外培养组织和细胞的基本模
式系统。但要维持细胞在体外长期生 存和生长，还必须克服污染和解决营 养问题。
培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。
2）细胞体外培养时，因环境的改变，细胞分化的表达形式
也发生了与原体内时不同的变化。
要有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力； 熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和与 此有关的基本理论知识。
第二节 组织培养细胞生物学

生长和增殖并非同一概念，

细胞生长指的是：细胞体积增大。 细胞增殖是：细胞数量增多。
一、体内外细胞的差异和分化

目前人体内所有细胞基本上皆可进行培养。培养细胞已成
细胞分化机制是极其复杂的，是在

细胞与细胞 细胞与体液 细胞与细胞外基质
相互作用下，由众多基因参与、经过多阶段和多环节完成 的动态演变过程。

细胞离体培养因环境的改变，失掉上述在体内时的关系，
细胞的分化可能发生如下的变化。
1．不适应 (Deadaptation)

细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显。

因此应分析体外培养细胞分化的改变属何种性质。

很多细胞在培养中的改变是因培养环境的改变和分化因子 的缺乏，导致细胞分化表达受阻、分化基因表达抑制或不
充分而已。但即便是脱分化也并不意味着细胞分化能力完
全丧失。

从细胞遗传学角度考虑，体外培养细胞，不论正常或肿瘤 细胞都源于二倍体细胞，也即含有与体内细胞基本相同的 基因组 (Genome)，也即存在着发生分化的依据。一种分 化特性的丧失，不等于彻底消除了分化能力。

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(四) 我国组织培养的发展
(五) 对组织培养工作者的要求和工作方法


除掌握操作技术之外，尚需明白各种操作的基本道理。

成为生物制品、单克隆抗体生产和基因工程制品等的生产手段

不足

组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中， 与体内环境相比，仍有很大差异。因此在利用培养细
胞做实验对象时，不应视为与体内细胞完全一样，把
实验结果外推至体内，轻易源自文库出与体内等同的结论。
三、组织培养发展简史

最早是德国人Roux (1885) 曾用温生理盐水在体外培养鸡胚，活 了数月，这被认为是组织培养的萌芽试验。 1903 年 Jolly 用盖片悬滴培养法，培养蜂蜕白细胞生活了近一个 月。 1906 年 Beebe 和 Ewing 用同样方法以动物血清做培养基，培养 狗淋巴细胞存活了 72 小时，并曾见到细胞生长现象。
便于使用摄影、摄象和闭路电视等方法进行记录，能直接观察活 细胞变化


可供研究的细胞种类极其广泛
便于使用各种不同的技术方法 培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组(Genome)，也是分子生
物学和基因工程学的研究对象

易于施用物理、化学和生物因素等进行实验研究 可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，比较经济









中国工业微生物菌种保藏中心 http://www.china-cicc.org/inl%20col/introduction.htm 台湾快兴科技股份有限公司 Cambrex 產品 http://www.qualitysystems.com.tw/Cambrex.htm 台湾国家卫生研究院 http://www.nhri.org.tw/index/home2.htm 中国协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心
国际上已建立了不少的细胸库或中心。

美国的 ATCC (American Tissue Culture Collection)；HGMR (Human Genetic Mutant Repository)，CAR (Cell Aging Repository) 等。

在英国和日本等也有类似的机构。 我国在上海和昆明也建立了小规模储存细胞的实验室。
细胞产品资源

国内细胞库

武汉细胞库 http://www.cctcc.org/fzlbc/cell.doc 上海细胞库 http://db.sgst.cn/main1/cell/ 昆明细胞库 http://vkz.brim.ac.cn/CELL.HTM 成都基因治疗肿瘤药物工程技术研究中心细胞及载体服务 http://www.genemedicine.com.cn/cell_catalog.asp 南京中医药大学新药及海洋药物研究中心药理毒理研究室细胞库 http://202.195.210.5/web/keyanziyuan/haiyangcell1.htm 湖南远泰生物技术有限公司生物资源库 http://www.promab.com.cn/Source.asp 上海午立生物技术有限公司 http://www.wulibiotech.com/cpjs-4.htm 中国医学科学院基础医学研究所细胞中心 http://bionon.nease.net/cellhouse.doc 上海华大天源生物科技有限公司提供高表达 GPCR 细胞株和报告基因分 析http://www.hdbiosciences.com/03chanpin.htm
培养细胞最多见的表现是：

失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显、出现类似 “反祖” (Atavism) 现象 表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性
性状的细胞群。
(二) 培养细胞的分化

个体从受精卵通过发育形成组织、器官，并进行各种功能
的过程，也可看作为细胞分化的过程。


当前组织培养日益成为生物工程和基因工程的生产手段。 中空纤维培养法一次可培养细胞 1.2×l011 个，能用于生产 多种生物制品，组织工程等。

近年随工业的发展，瓶皿、培养基和血清等都已商品化和
系列化，使细胞培养工作已成得轻而易举。 低温冷冻技术可把已建立的多种细胞系和细胞株长期冻存 起来。


动物细胞培养
第一章 绪论和基本 理论知识
鄂征
第一节 绪论
一、细胞培养的基本概念

体外培养的三个层次 ：
组织培养 (Tissue Culture) 细胞培养 (Cell Culture) 器官培养 (Organ Culture)

二、细胞培养的评价

优点


能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动

1912 年，Carrel 特别注意无菌操作，用血浆包
埋组织块外加胎汁的培养法，并采用了更新培
养基和分离组织的传代措施，从而完善了经典
的悬滴培养法 (Suspension Culture)。Carrel 用
这种方法，曾培养鸡胚心肌组织长达数年之久。

1924 年，Maximow 又把 Carrel 的悬滴培养法改良为 双盖片培养，使之更易于传
代和减少污染。

1923 年，Carrel 又设计了用 卡氏瓶培养法，扩大了组织
的生存空间。
(二) 组织培养的发展


40 年代开始，大多数培养工作都过渡到用瓶子培养。
50 年代起，组织培养进入了一个更加迅速发展的阶段。 卡氏瓶原理的启示下，出现了用试管培养。 培养基由天然动物血浆改进为应用人工合成培养基。 促细胞生长物质从胎汁改用动物血清。 Dulbecco (1957) 等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法， 获得了单层 (细胞) 培养 (Single Layer Culture)。
培养条件下不仅能很好的生存、生长和增殖，在一定程度
上，已能控制细胞的分化。

但当前毕竞未能彻底了解人体内一切细胞活动的内在联系， 人工模拟条件与体内实际情况仍不完全相同。这样，当细 胞被置于体外培养后，一旦失去神经体液的调节和细胞相 互间的影响、生活在缺乏动态平衡的环境中，日久天长， 细胞发生变化是必然的。

(三) 现代组织培养

50 年代末起，生物科学和技术科学相互渗透、遗传学和 生物化学相互结合的结果，出现了分子遗传学、分子生物 学、细胞工程等新兴科学。这些新科学的形成和发展都与 组织培养有密切关系。


用各种理化措施诱发出遗传缺欠细胞株
应用细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体 用培养细胞检测环境中可疑致癌物、癌基因转染和细胞转化等各 种新技术
为人们研究体内器官、组织和细胞的正常和异常生命活动
的重要对象。

却面临一个重要的问题，体外培养细胞和体内细胞是否有 差异? 是否可视为同一??

它们的增殖方式是相同的，均赖于有丝分裂。体内、 外细胞的差异关键在于细胞的分化，从而细胞分化是 检测细胞差异的核心问题。
(一) 体内外细胞的差异

当前人工模拟体内环境的技术已经很高，细胞生活在人工