焦磷酸测序法的原理
(医学PPT课件)pyrosequencing焦磷酸测序
Fast
Simple
Dedicated Software
Accuracy
Sequence
Dedicated Reagent Kit
Flexibility
Efficient
Scalable
Multiplexing
Short Optimization Time
3’TAAGCCGAATG
16
Multiplexing
SNPs located on different fragments…... …..or on the same
17
Principle of multiplexing
Design of sequencing primers and dispensation order
Single nucleotide InDels (e.g. [C]) Multiple nucleotide InDels (e.g. [CGACGGT])
11
CYP2D6 - A2637del (Allele 3)
T/T
Sequence (reverse) : TCC[ T ]GTG
T/-
3
ref
ref
2,5
2
1,5
1
0,5
0 TA GCT G CA CG AT G
18
User creates a SNP/ mutation sequence database
Software calculates theoretical genotyping results
Each DNA fragment is assigned a color
-/-
12
Large deletion
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文
焦磷酸光化测序技术的基本原理及运用-人类学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）不仅极大地提高了人类对基因组和相关遗传信息的认识水平，而且促进了生命科学研究技术的发展和应用。
正是在这样的历史背景下，焦磷酸光化测序技术（pyrosequencing）由瑞典研究人员发明。
焦磷酸光化测序技术的基础原理是基于通过合成测序原理进行酶促反应的DNA测序方法，通过基于释放焦磷酸盐时的链式反应的可见光检测，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。
该技术可应用于DNA核苷酸序列和突变的检测、单核苷酸多态性的基因型的鉴定，以及DNA甲基化水平变化的分析等。
近年来，随着摄影器材和成像技术的快速发展，这项技术的原理是基于通过酶促反应而实时检测可见光，因此，有望在检测的敏感性方面得到更进一步的发展。
该文根据笔者在瑞典近三十年的工作经验和积累的文献，首先阐明焦磷酸光化测序的基本原理，然后介绍该技术的应用，最后讨论其发展前景。
关键词：人类基因组计划; 焦磷酸光化测序; 基因变异; 基因型; DNA甲基化;Abstract：The Human Genome Project（HGP）not only greatly improved the understanding of human genome and related genetic information, but also promoted the development of technologies in life science research. It was under this historical context that pyrosequencing was invented by Swedish researchers. Pyrosequencing is a method of DNA sequencing based on the sequencing by synthesis principle with enzymatic reactions, and relies on light detection based upon a chain reaction when pyrophosphate is released. The application of this technology involved the detection of DNA nucleotide sequences and mutations, the identification of genotypes of single nucleotide polymorphisms, the analysis of changes in DNA methylation levels etc. With the recent rapid development of photographic equipment and imaging technology, this technology is expected to have an increasing sensitivity in signal detection. Based upon the working experiences in Sweden for nearly 30 years and accumulated literature, this review first clarified the basic principles of pyrosequencing, then introduced the applications of this technology, and finally discussed its development prospects in the near future.Keyword：Human Genome Project; pyrosequencing; genetic variation; genotype; DNA methylation;1 、引言本世纪是生命科学的世纪。
焦磷酸测序名词解释
焦磷酸测序名词解释焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的原理是通过对 DNA 序列进行扩增，并对扩增产物进行测序，最终得到 DNA 序列信息。
焦磷酸测序主要应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域，可以用于基因表达谱分析、基因突变检测、基因调控机制研究等。
相比其他基因测序技术，焦磷酸测序具有很多优势，如测序成本低、速度快、精度高等。
但是，焦磷酸测序也存在一些缺陷，如测序长度有限、难以测序复杂基因结构等。
尽管焦磷酸测序技术已经发展了多年，但它仍在不断演进和改进。
未来，焦磷酸测序技术将继续发展，并在更多领域得到应用。
1. 什么是焦磷酸测序焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
具体来说，焦磷酸测序技术利用了聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的特性，可以通过检测 ATP 合成过程中的光谱变化来确定 DNA 序列。
焦磷酸测序技术最初由来自瑞典斯德哥尔摩大学的科学家们开发，并于 1998 年由瑞典Pyrosequencing AB 公司商业化。
自此，焦磷酸测序技术就成为了一种广泛应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域的技术手段。
2. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
焦磷酸测序的工作流程如下：1. 先将 DNA 样本进行扩增，得到扩增产物。
2. 然后将扩增产物与一种叫做反转录酶的蛋白质混合，使其能够将 DNA 序列转录成RNA 序列。
3. 将转录后的 RNA 序列与一种叫做聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的蛋白质混合，使其能够将 RNA 序列通过合成 ATP 来反应出 DNA 序列信息。
焦磷酸测序技术及其应用进展
·综述·焦磷酸测序技术及其应用进展倪红兵综述 鞠少卿 王惠民审校 【摘要】 焦磷酸测序技术是一种新的依靠生物发光进行DN A序列分析的技术。
在DN A聚合酶、A T P硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下,将引物上每一个dN T P聚合与一次荧光信号释放偶联起来,通过检测荧光的释放和强度,达到实时测定DN A序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针,也无需进行电泳,具有分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化的特点。
在遗传多态性分析、重要微生物的鉴定与分型研究、克隆检测和等位基因频率分析等方面具有广泛的应用。
【关键词】 焦磷酸测序技术; 单核苷酸多态性; DN A序列分析 DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一,而双脱氧核苷酸链终止法(Sange r法)是目前使用得最普遍的DNA序列分析技术。
在基于San-g er法的全自动DNA测序技术中,测序反应产生的DNA片段是荧光标记的,这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离,荧光分子被激发而发光,发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列,且单向反应的读序较长,目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中,很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证,而这种分析往往测几十对碱基(beas pair,bp)就可以满足需要。
在这种情况下,Sanger法未必是最合适的DNA序列分析技术。
新发展的焦磷酸测序技术(Py rosequencing)应该是目前最适合这些应用的DNA序列分析技术。
焦磷酸测序技术是新一代DNA序列分析技术,该技术对DNA的序列分析无须进行电泳,DNA片段无须荧光标记,因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置。
本文将就焦磷酸测序技术的原理和应用等方面作一综述。
焦磷酸测序技术1.焦磷酸测序技术的原理:焦磷酸测序技术是由Ronaghi等[1,2]于1987年发展起来的一种新型的DNA测序技术,其核心是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应。
焦磷酸测序简介
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
- 32 -
Sample & Assay Technologies
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
PCR
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
PCR引物（其中一条有生物素标记）必须 HPLC纯化或相当； PCR必须高保真，建议PyroMark PCR Kit (200) (cat. no. 978703) ，扩增体系和条件 见右图； 一般用5~20ul扩增物 (Q24 Adv) ；
主要内容
一，焦磷酸测序简介
.
. 二，Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 三，仪器维护
.
-1-
Sample & Assay Technologies
焦磷酸测序简介
基于合成的测序（边合成边测序），对DNA 序列进行精确分析和定量分析。
焦磷酸测序反应 体系中有4 种酶
DNA-Polymerase（DNA聚合酶） ATP-Sulfurylase（ATP硫酸化酶） Luciferase（荧光素酶） Apyrase（三磷酸腺苷双磷酸酶） 每次只加一种dNTP（A，T，C，G）
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
- 28 -
Sample & Assay Technologies
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
引物设计
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
上机运行
结果分析
- 29 -
Sample & Assay Technologies
基因定量分析系统-焦磷酸测序 [兼容模式]
![基因定量分析系统-焦磷酸测序 [兼容模式]](https://img.taocdn.com/s3/m/6f61366fb84ae45c3b358c72.png)
a/g C T G C C T A/G Heterozygote Single height ref peaks 单个高度的参考峰 Double height ref peak两倍高 度的参考峰
Genotype:基因型 2 half height peaks 两个半高峰
C
A
G
T
C
T
G
C
T
Negative controls阴性
For Internal Use Only
- 15 -
Sample & Assay Technologies
焦磷酸测序流程
实验设计 测序 PCR 试样预处理， 获得单链模板
结果分析
1-2h /96 sample
SNP: 10min/96 sample SQA:35 min/96 sample 15 min/96 sample
Homozygous G 纯合子G
GCTGCCT --------CGACGGA--GCTGCCT --------CGACGGA--A
G
C
T
A
G
Heterozygous A/G 杂合子A/G
ACTGCCT --------TGACGGA--GCTGCCT --------CGACGGA--A G C T A G
C
A
G
T
C
T
G
C
T
Negative controls阴性
For Internal Use Only -6-
Reference Peaks参考峰
Sample & Assay Technologies
Pyro技术原理
Pyrogram™ 的产生
焦磷酸测序
焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。
在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。
新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。
Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。
PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。
Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。
反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。
反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。
焦磷酸测序技术简介及临床意义
焦磷酸测序技术简介及临床意义
PyrosequencingTM (焦磷酸测序技术)是一种基于4种酶的级联反应来进行定量序列分析的技术。
通过对病人样本DNA序列的直接测定，从而与已知DNA序列进行对照，从而对病人的病情作出判断。
不仅可以指导临床用药，甚至可以对未来的病情发展做出预测。
目前焦磷酸测序技术越来越多的应用在病毒的分型和耐药分析、微生物快速鉴定和肿瘤的个性化治疗中。
与传统的检测方法相比，焦磷酸测序技术由于是直接得到目的核酸片段的序列，所以又被称为分子诊断中的“金标准”。
焦磷酸测序技术原理及应用
焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由Nyren等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。
焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行DNA甲基化、SNP等单个/连续多个核苷酸变异进行实时定量检测提供了非常理想的技术操作平台。
一.焦磷酸测序技术原理焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。
焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)．荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。
焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。
反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。
1.每次加入一个dNTP,在聚合酶作用下产生一个焦磷酸（PPi）；2.硫酸化酶转化PPi为ATP，ATP使荧光素酶发出荧光(产生的光强度与结合的核苷数量成正比).3.多余的dNTP被降解，开始新一个循环.4.测序结果2.技术平台：QIAGEN公司PyroMark Q24，PyroMark Q48Autoprep，PyroMark Q96ID焦磷酸测序仪.3.焦磷酸测序实验流程4.焦磷酸测序技术应用1)DNA甲基化检测2)全基因组甲基化水平检测：LUMA法4.SNP定量检测/等位基因差异表达检测。
焦磷酸测序
罗氏454测序系统中文名罗氏454测序系统测试原理基于焦磷酸测序法特点依靠生物发光对DNA序列进行检测测序流程支持各种不同来源的样品序列测定测试原理GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。
在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。
通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。
测序流程1. 样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定，包括基因组DNA，PCR产物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同类型的样品测序都可在一台仪器上完成。
2. 样品DNA打断：样品如基因组DNA或BAC等被打断成300到800bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤并不需要。
短的PCR产物则可利用GS融合引物扩增后直接进行步骤4。
3. 加接头：借助一系列标准的分子生物学技术，将3′端和5′端有特异性的A和B接头连接到DNA片段上。
接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。
图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段。
4. 一条DNA片段=一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响，从而实现了所有DNA片段进行平行扩增（emPCR）。
5. 一个磁珠=一条读长：经过emPCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。
经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到Pico Titer Plate板中供后继测序使用了。
6. 数据读取和分析工具：GS FLX系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用。
pyrosequencing焦磷酸测序
Accuracy
Sequence
Dedicated Reagent Kit
Flexibility
Efficient
Scalable
Multiplexing
Short Optimization Time
1. Assay Design
Example of a general target: 16S gene
Relative
1,000 0,900
Relative peak height =
75 %
peak1 height peak1 height + peak2 height
peak height
0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1分子的dNTP掺入，释放出1分子的PPi，生成1分子的 分子的dNTP掺入，释放出1分子的PPi，生成1 dNTP掺入 PPi ATP， ATP，产生单位强度的光信号
Pyrosequencing： Pyrosequencing： Quantitative Accuracy Test
C/C C/G G/G
PCR产物中加入 streptavidine包被的 sepharose beads
EtOH NaOH
振荡温育 5-10 min 变性，生物素标记的 单链结合于beads并被 真空吸附于Vacuum Prep Tool上
Water Washing buffer
PCR product immobilize d on Sepharose beads
焦磷酸测序
焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。
在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。
Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。
在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。
新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。
Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。
PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。
Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。
反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。
反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。
焦磷酸测序技术及其应用进展
（ 进行疾病的遗传连锁分析（ｎ ｇａ ｌｉ及关 １ ） ｉ ａ ｎ ｓ） ｌｋ ｅ ｙｓ ａ 联分析（ ｓｉｏ ａ ｌｉ ， ａｏａ ｎ ｙｓ 用于疾病易感基因定 ｓｃｔ ｎ ｓ） ｉ ａ
位； 而且其定位的精度将比 微卫星标记精细得多， 可 直接用于指导易感基因克隆。（） 药物基因组 ２在“
学， ｍｏｎ ｉ） ＂ ｈ ｃｅｍ ｓ （ ｍ ｇｏ ｃ 研究中， ｐ 可通过检测 ＳＰ Ｎ 的遗
荧光素（ｙｅ ｒ） 氧 光素发出与ＡＩ ｏｌｉｉ转化， 化荧 ｘｕｆｎ ｅ Ｔ量 〕
成正比的可见光信号。光信号由 ＣＤ摄影机检测 Ｃ
焦磷酸测序技术（ｙｓ ｕ ｃｇ是由Ｎｒ 等 Ｐ ｅ ｅ ｉ） ｍ ｑ ｎｎ ｙｎ ｅ
人于 １ ７ ９ 年发展起来的一种新型的 Ｄ Ａ测序技 ８ Ｎ 术， 其核心是由四种酶催化的同一反应体系中的酶
菌株是否含有两个质粒（ ｐ０ 的 ｌ 基因和 鉴定 ｘ １ ｅ ｆ ｐ０ 的ｃ 基因） Ｘ２ ａ ｐ 来确定炭疽细菌的致病状态， 准 确率达 １ ％ ｎｅｔ 等利用焦磷酸测序技术对 ０ ； ｒａ ０ Ｕｎｓｄ
１ 株不同血清型的单核细胞增生李斯特氏菌（ｉ ０ ６ Ｌ－ ｓ
７ 医学检验与临床 ２ ６ ０ 年第１卷第２ Ｍｄ越 ｒ ｒＳｉ ｃ ａｄ ｉｉ ｓ２０ ， ｏ１ ， ｏ２ ０ ７ 期 ｅｃ Ｌ巨 ａ ｙ ｃ ｎｅ Ｃ ｎ ｅ，０６ Ｖ １ Ｎ ． ｉ ｔ ｅ ｎ ｌｃ ｏ
Ｄ Ａ序列分析技术是现代生命科学研究的核 Ｎ 心技术之一， 而双脱氧核昔酸链终止法（ａ ｅ法） Ｓｇ ｎｒ
是 目前使用最普遍的 Ｄ Ａ序列分析技术。在基于 Ｎ
Ｓ ｇ 法的全自 Ｎ 测序技术中， ａｅ ｎｒ 动ＤＡ 测序反应产生
的 Ｄ Ａ片段是荧光标记的， Ｎ 这些片段经过平板胶电 泳或毛细管电泳得到分离， 荧光分子被激发而发光，
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序 焦磷酸盐测序
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序焦磷酸盐测
序
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序和焦磷酸盐测序是两种先进的DNA分析技术，目前被广泛应用于基因组学研究领域。
这些技术能够提供更深入的基因信息和遗传组成的全景图，从而为生物医学、农业、环境科学等领域的研究提供强有力的支持。
下面将逐步介绍这两种技术。
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序将亚硫酸盐浸染与高通量测序技术结合，能够鉴定DNA序列中的甲基化位点。
甲基化是在DNA分子生命周期的各个时期进行的一种重要化学修饰，可影响基因的表达、转录和维护。
从DNA提取到甲基化测序和基因组的分析，整个流程需要严格协同工作，以确保结果的准确性。
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序技术可以鉴定出全基因组范围内的甲基化位点，大大提高了对基因组特征的认识。
焦磷酸盐测序技术是一种基于DNA链中特定区域序列的扩增测序方法。
通过对DNA分子中的焦磷酸盐末端标记进行适当的化学处理，可在PCR产物中产生序列比对信号。
这种方法只需少量的DNA模板，即可直接测定特定基因组片段的信息。
此外，该技术还可以用于检测样本中特定代表性序列的条形码，以区别同一个样本中的不同DNA来源。
因此，焦磷酸盐测序技术在种群遗传学、比较基因组学等方面被广泛应用，并且在医学诊断、病原体研究、动植物遗传资源保护等领域具有重大作用。
总之，全基因组重亚硫酸盐甲基化测序和焦磷酸盐测序技术为基因组学领域提供了重要的工具。
这些技术的进一步发展和应用将为全球科学家提供更加深入的遗传信息和基因组特征的全景图，从而更好地了解人类、动植物和微生物世界。
甲基化 焦磷酸测序
甲基化焦磷酸测序什么是甲基化焦磷酸测序？甲基化焦磷酸测序（Methylated CpG island recovery assay sequencing，MIRA-seq）是一种用于检测DNA甲基化的高通量测序技术。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式，它在调控基因表达、细胞分化和发育、肿瘤发生等过程中起着重要的作用。
MIRA-seq技术通过将DNA中的甲基化位点与未甲基化位点区分开来，从而实现对DNA甲基化状态的检测和定量。
该技术结合了焦磷酸测序（sequencing by synthesis，SBS）和甲基化特异性结合蛋白质（methyl-CpG binding domain protein，MBD）的结合能力，能够高效地富集甲基化位点，并通过高通量测序得到其精确位置和数量信息。
MIRA-seq的原理MIRA-seq主要包括以下几个步骤：1.DNA提取：从待检样品中提取总DNA。
2.修剪：将提取得到的总DNA进行修剪处理，去除低质量碱基。
3.甲基化富集：使用甲基化特异性结合蛋白质（MBD）结合甲基化位点，将甲基化的DNA片段富集出来。
未甲基化的DNA片段则不会与MBD结合。
4.PCR扩增：对富集得到的甲基化DNA片段进行PCR扩增，以得到足够多的DNA样本用于测序。
5.测序：对PCR扩增得到的甲基化DNA样本进行高通量测序。
可以选择不同的测序平台，如Illumina、PacBio等。
6.数据分析：将测序得到的数据进行比对和分析，确定甲基化位点的位置和数量信息。
MIRA-seq与其他甲基化检测方法的比较与传统的甲基化检测方法相比，MIRA-seq具有以下优势：1.高通量：MIRA-seq利用高通量测序技术进行数据获取，能够同时检测大量的甲基化位点。
2.高灵敏度：MIRA-seq能够将目标片段从复杂的DNA混合物中富集出来，提高了目标位点的检测灵敏度。
3.高准确性：MIRA-seq采用了PCR扩增和高通量测序技术，可以获得高质量的测序数据，提高了甲基化位点的检测准确性。
e7-3焦磷酸测序与深度测序
e7-3 焦磷酸测序与深度测序1. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其参入到引物链的3′-端，并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。
PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。
每个峰值的高度与反应中参入的核苷酸数目成正比。
第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。
整个测序反应分为四步[图e7-3(1)]：图e7-3(1) 焦磷酸测序的原理（1）将单链DNA模板与其特异性的测序引物结合，然后加入四种酶的混合物，包括：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶（A TP sulfurylase，APS）、荧光素酶（luciferase）和双磷酸酶（apyrase）。
反应底物有腺苷-5′-磷酸硫酸（adenosine-5′-phosphosulfate，APS)和荧光素（luciferin）。
（2）向反应体系中加入1种dNTP，如果它正好能和DNA模板的下一个碱基配对，就会在DNA 聚合酶的作用下，被添加到测序引物的3′-端，同时释放出1分子的PPi。
dA TP 由腺苷-α硫-三磷酸（deoxyadenosine alfa-thio triphosphate，dATPαS）替代，原因是DNA聚合酶对dATPαS的催化效率比对dA TP的催化效率高，且dATPαS不是荧光素酶的底物。
（3）在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合，形成氧化荧光素，同时产生可见光。
通过电荷耦合器（charge coupled device，CCD）光学系统，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。
（4）反应体系中剩余的dNTP和残留的少量A TP在双磷酸酶的作用下发生降解。
（5）加入另一种dNTP，按第2、3、4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
焦磷酸测序法的原理
聚焦磷酸测序（Focused phosphor sequencing，FPS）是由分子物理学和计算机科学
联合发明出来的新一代DNA测序技术，它改变了传统测序技术在DNA测序中的传统方法，
可以准确、高效地检测基因组中特定基因的位置。
聚焦磷酸测序原理是借助电子可视显像仪将特定基因座度量为磷酸，并将这些映射的
磷酸聚集到激光光源上，形成数组。
激光以极快的扫描速度在数组上寻找特定的点。
激光
在这些点上发出的能量将磷酸中的DNT链分离，从而使被测序的DNA序列显示出来。
然后，当激光扫描多次后，分子团就会发光，并将发出的能量转换成信号，从而实现DNA序列的
测定。
聚焦磷酸测序的原理是将各个核苷酸的构型用磷酸分子表示出来，使用磷酸捕获和激
发原子，以及用激光源收集磷酸放出的能量及其他光子，利用可视显像仪的传感器和电子
计算机组合系统，进行图像处理和信号处理，最后将得到的数据转化为序列数据。
聚焦磷酸测序是一种基于微电子显像和激光扫描相结合的DNA序列测定技术，相比传
统的测序方法，具有更高的精度和可靠性，准确性高，定位精度高，可以检测基因组中特
定基因的位置，从而使DNA测序技术得到全面的发展，为研究基因组和全基因组提供更多
有用的信息。