【CN109652455A】一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法及其应用【专利】
作物育种关键技术的发展
作物育种关键技术的发展摘要：传统遗传育种方法是建立在有性杂交的基础上，通过遗传重组和表型选择进行新品种选培。
随着所用品种遗传多样性逐步减少，传统育种瓶颈效应愈来愈为明显，利用常规育种技术已经很难育成突破性新品种。
生物技术的创新极大地推动了现代育种的发展。
随着分子生物学、基因组学、系统生物学、合成生物学等学科的发展和生物技术的不断进步，多学科联合催生了设计育种技术的革新。
作物育种技术常用的有9种：远源杂交、自交不亲和、杂种优势利用、单倍体育种、多倍体育种、基因组编辑、全基因组选择、分子设计育种、转基因育种。
2017年生物技术发展迅猛，各项技术得到了空前的发展，尤其是基因组编辑技术、单倍体育种、分子设计育种技术的发展，正孕育着一场新的育种技术革命.1、基因组编辑技术基因组编辑是生命科学新兴的颠覆性技术，特别是基于CRISPR?Cas9系统的基因组编辑工具近几年迅猛发展。
在过去的一年里，基因组编辑技术得到空前发展.1）作物基因组单碱基编辑方法的建立在作物育种中，通过简单的方法将遗传变异引入到现代优异品种中是加速遗传改良、推进育种进程的重要手段.在过去的一年里，不同课题组分别建立了单碱基编辑方法，并在不同作物中进行了尝试.中国科学院上海生命科学研究院朱健康课题组在水稻中利用大鼠APOBEC1系统开发了一种单碱基置换方法.类似于哺乳动物“碱基编辑”系统，该研究小组合成了大鼠APOBEC1，并利用非结构化的16残基肽XTEN作为接头,将其融合到Cas9(D10A）的N末端。
将一种核定位信号（NLS)肽添加到Cas9（D10A)的C末端。
半主动式的Cas9可切割非编辑的链，并通过诱导碱基切除修复，增加碱基编辑的效率。
然后，在玉米泛素启动子(UBI)的控制下，这个APOBEC1?XTEN？Cas9（D10A)融合序列被构建成一个双运载体。
研究人员在水稻上对两个重要的基因NRT11B和SLR1进行了编辑，数据表明,采用这种改进的CRISPR/Cas9系统，可以有效地产生稳定C→T和C→G （G→A和G→C）替换.同期，中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴研究组与华中农业大学“千人计划”引进人才、美国加州大学圣地亚哥分校赵云德教授实验室合作，也报道了利用改造后CRISPR/Cas9系统，成功在水稻中实现靶标基因高效单碱基定点替换。
一种不结球白菜雄性不育新种质的创制方法[发明专利]
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专利名称：一种不结球白菜雄性不育新种质的创制方法专利类型：发明专利
发明人：朱玉英,李晓锋,侯瑞贤,朱红芳,翟文
申请号：CN201610248502.5
申请日：20160420
公开号：CN105918103A
公开日：
20160907
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种不结球白菜雄性不育新种质的创制方法，包括：选取甘蓝细胞质雄性不育材料作为母本和已经纯合稳定的不结球白菜自交系材料作为父本进行杂交，采取角果进行幼胚培养，获得杂交一代植株作为母本，自交系材料作为父本进行回交，连续回交6代获得园艺性状稳定的不结球白菜雄性不育新种质。
本发明获得的具有雄性不育性的不结球白菜新种质P70‑219，不仅丰富了不结球白菜的种质资源，而且该不结球白菜新种质P70‑219可以用来配制更多的优势明显、纯度高的杂交一代新品种，同时也可利用该不结球白菜新种质转育其它不结球白菜、白菜新种质材料。
因此，本发明在不结球白菜育种实践及其理论研究上都很有价值。
申请人：上海市农业科学院
地址：201106 上海市闵行区华漕镇北翟路2901号
国籍：CN
代理机构：北京国坤专利代理事务所(普通合伙)
代理人：姜彦
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结球白菜抗逆基因遗传转化方法的研究的开题报告
结球白菜抗逆基因遗传转化方法的研究的开题报告前言随着社会经济的发展以及人们生活水平的提高，白菜等蔬菜作物的需求量逐年增长。
然而，作物生长期间面临着气温、湿度、盐碱度等多种环境胁迫，导致产量下降和品质变差。
因此，如何提高白菜抗逆性能已成为蔬菜栽培中急需解决的问题。
本研究将探究结球白菜抗逆基因遗传转化方法，以期提高其抗逆性能，降低其环境胁迫下的产量损失。
一、研究背景白菜作为重要的蔬菜之一，在我国栽培历史悠久，且味道鲜美、营养丰富，深受人们喜爱。
然而，作为一种非耐逆性蔬菜作物，白菜在种植过程中面临着气温、湿度、盐碱度等多种环境胁迫，导致产量下降和品质变差。
当前，为了提高作物的产量和质量，许多科学家都在探索利用基因工程技术来吸纳优异基因，从而改善作物生长环境的变异性。
然而，自然基因突变和重组是不可预测的，许多常规转基因作物对于环境因素的调节能力也存在不少局限性。
因此，如何提高作物的抵御环境胁迫的能力，降低环境因素下作物的生产损失，是种植业面临的一个重要问题。
本研究拟以结球白菜为对象，运用基因编辑技术和生物技术手段，探究结球白菜抗逆基因遗传转化方法，以期提高结球白菜的抗逆性能，降低环境因素下的生产损失。
二、研究目的和意义通过对结球白菜抗逆基因遗传转化方法的研究，可以探索结球白菜在遗传水平上的适应性，提高其抗逆性能，降低环境因素下的生产损失。
具体的研究目的和意义如下：1. 探索结球白菜抗逆基因转化方法，为蔬菜栽培提供技术支持。
2. 通过基因编辑技术，吸纳抗逆基因，提高结球白菜在极端环境下的生存能力和产量。
3. 为蔬菜生产提供新的种植策略，促进蔬菜行业的可持续发展。
三、研究内容和方法1. 结球白菜抗逆基因筛选初步筛选抗逆基因并鉴定其作用机制。
依据白菜抗逆生理特点设计抗逆表型筛选程序，采用标准环境和模拟环境对抗逆性强的品种进行SDS-PAGE蛋白质组分析、RNA-seq分析等，发现与抗逆性相关的代表性蛋白质及其基因，进一步验证其在抗逆性中的作用。
不结球白菜再生体系、遗传转化及耐热性调控研究的开题报告
不结球白菜再生体系、遗传转化及耐热性调控研究的开题报告一、研究背景白菜是我国著名的蔬菜之一，已有几千年的种植历史。
目前，白菜品种已经相当丰富，其中不结球型品种受到越来越多的关注，因其更加适合多样化的种植和消费需求。
然而，不结球型白菜存在着低产、低品质、抗病性差等问题，这制约了其产业化发展。
基因工程技术在中国农业中的应用已被明确提出，是提高农作物产量和品质的重要途径。
在不结球型白菜的生产中，目前缺乏合适的遗传转化技术和有效的耐热性调控策略，这阻碍了其高效、稳定生产和市场化推广。
因此，开展不结球白菜再生体系、遗传转化及耐热性调控研究，具有重要的理论和应用价值。
二、研究目的和内容本研究旨在建立不结球型白菜再生体系，构建遗传转化体系，探索适用于不结球型白菜的耐热性调控策略，以推动其产业化发展。
具体内容包括：1. 筛选合适的白菜愈伤组织作为再生体系的起始材料；2. 优化外源基因转化的体系，比较不同载体和基因导入量对基因表达的影响；3. 选取有效的遗传标记对转基因植株进行鉴定；4. 建立耐热性检测体系，分析转基因白菜的耐热性变化及其与基因表达的关系；5. 探讨开发针对白菜耐热性的基因组编辑技术。
三、研究方法1. 通过组织培养的方法，筛选优质白菜的愈伤组织，建立再生体系；2. 利用农杆菌介导法等遗传转化技术，导入外源基因，研究转化效率和稳定性；3. 选择与转化基因拓扑结构相似的叶绿体基因作为参照，利用PCR或Southern杂交等方法，检测转化植株中外源基因的存在；4. 以不同温度和湿度条件下的表型为评价指标，分析转化植株的耐热性差异，研究耐热性的分子机制；5. 借助CRISPR/Cas9等基因组编辑技术，针对耐热相关基因进行基因组编辑。
四、预期成果1. 系统地建立不结球型白菜的再生体系和基因转化体系；2. 研究白菜不结球性状的遗传规律，建立鉴定转基因植株的方法；3. 研究转化植株在环境压力下的反应，探索改善其抗热应答机制的可能性；4. 建立耐热性相关基因的编辑技术并初步应用。
一种酶响应型磁性纳米粒及其制备方法与应用[发明专利]
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专利名称：一种酶响应型磁性纳米粒及其制备方法与应用专利类型：发明专利
发明人：祝侠丽,黄河清,张振中,张英杰,侯琳,张慧娟,李鸿基申请号：CN201510550456.X
申请日：20150901
公开号：CN105031651A
公开日：
20151111
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及酶响应型磁性纳米粒及其制备方法与应用，可有效解决酶响应型磁性纳米粒的制备及作为磁性热疗介质和药物转运载体在肿瘤治疗中的应用问题，方法是，作为药物载体系统是以FeOCuS复合纳米材料为磁靶向材料和光敏剂，明胶和海藻酸钠为复合囊材，磁性FeOCuS复合纳米材料先通过化学共沉淀法制得FeO纳米粒子，然后将CuS负载于FeO纳米粒子表面，得到核壳型FeOCuS复合材料，最终以明胶和海藻酸钠为复合囊材，采用复凝聚法将此载体与抗癌药物，制备成一种酶响应型磁性纳米粒，本发明的原料来源丰富，成本低，质量好，靶向性强，使用效果好，是肿瘤治疗药物上的一大创新。
申请人：郑州大学
地址：450001 河南省郑州市高新技术开发区科学大道1号
国籍：CN
代理机构：郑州天阳专利事务所(普通合伙)
代理人：聂孟民
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磁性纳米颗粒介导的椭圆小球藻转化体系的建立
磁性纳米颗粒介导的椭圆小球藻转化体系的建立作者：曹苏珊薛静陈绪清王倩楠张秀海安贤惠来源：《江苏农业学报》2020年第02期摘要：旨在利用磁性納米颗粒作为载体构建小球藻的新型转化方法，由于纳米载体技术已经被成功地应用于动、植物的遗传转化中，其主要优势是相对于传统转化技术更加便捷、高效。
本研究首先利用磁性纳米颗粒吸附含有增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的质粒载体pYBA1132，形成纳米颗粒-基因复合物，通过磁场作用对椭圆小球藻原生质体进行转化，进而观察EGFP基因在椭圆小球藻中的瞬时表达情况。
结果表明，对椭圆小球藻细胞进行酶解处理并形成半原生质体/原生质体后，磁性纳米颗粒可以介导外源EGFP基因转入小球藻中，并能够进行瞬时表达，产生绿色荧光。
关键词：磁性纳米颗粒;增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）;转化;瞬时表达中图分类号：Q785文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）02-0306-06Abstract：Using magnetic nanoparticles as carriers， a new transformation method of Chlorella ellipsoidea was constructed. Nanocarrier technology has been successfully applied to genetic transformation of animals and plants， which is more convenient and efficient than traditional transformation technologies. In this study， magnetic nanoparticles were used to absorb plasmid vector pYBA1132 containing enhanced green fluorescent protein gene （EGFP）， and the nanoparticles-gene complexes were formed. In addition， the protoplasts of Chlorella ellipsoidea were transformed by magnetic force， and the transient expression of EGFP in Chlorella ellipsoidea was observed. After the formation of semi-protoplasts/protoplasts in Chlorella ellipsoidea cells by enzymolysis treatment， the magnetic nanoparticles mediated the transfer of exogenous EGFP gene into Chlorella ellipsoidea， and green fluorescence was detected after transient expression.Key words：magnetic nanoparticles;enhanced green fluorescent protein gene（EGFP）;transformation;transient expression小球藻（Chlorella）作为单细胞真核微藻，是一种重要的微藻资源。
一种农杆菌介导的大白菜转基因方法[发明专利]
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专利名称：一种农杆菌介导的大白菜转基因方法
专利类型：发明专利
发明人：朴钟云,赵玉竹,李晓楠,庞文星,战宗祥,朴英兰申请号：CN201810720025.7
申请日：20180703
公开号：CN108642080A
公开日：
20181012
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种农杆菌介导的大白菜转基因的方法。
所述方法通过用含有待转基因的农杆菌侵染液侵染大白菜籽苗的带柄子叶，成功的将目的基因转入大白菜的基因组中。
经多次重复试验，本发明所提供的方法最高转化率为13.5％，平均转化效率8％，所得方法的基因转化的效率高。
此外，本发明提供的方法中，多种培养基的组成成分和浓度配比基本一致，培养基无需反复更换、改变浓度，极大的简化了转基因操作过程，所得方法简便高效。
本发明利用该方法建立了稳定的大白菜转基因体系，为大白菜分子育种及基因功能研究奠定基础。
申请人：沈阳农业大学
地址：110866 辽宁省沈阳市沈河区东陵路120号
国籍：CN
代理机构：厦门福贝知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：郝学江
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一种不结球白菜胞质雄性不育新种质的鉴定方法[发明专利]
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专利名称：一种不结球白菜胞质雄性不育新种质的鉴定方法专利类型：发明专利
发明人：侯喜林,曹寿椿,何玉科
申请号：CN99114126.1
申请日：19990329
公开号：CN1231115A
公开日：
19991013
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于一种不结球白菜胞质雄性不育新种质的鉴定方法,包括:田间鉴定、细胞染色体鉴定、酯酶、过氧化物同工酶电泳分析、分子生物学鉴定。
本发明对融合再生植株后代进行了花器形态学、雄性不育性及结实率鉴定,细胞染色体鉴定,同工酶分析和分子生物学鉴定,结果准确可靠。
鉴定的98H秋－45为新种质,其不育率、不育度均为100%,低温下苗期叶片不黄化,结实率与保持系相同,极显著高于原不育材料;经PCR扩增cpDNA和mtDNA的电泳证实为体细胞杂种。
申请人：南京农业大学
地址：210014 江苏省南京市卫岗南京农业大学科研处
国籍：CN
代理机构：东南大学专利事务所
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纳米磁珠转化
纳米磁珠转化
纳米磁珠转化是一种在生物技术中应用的方法，该方法借助纳米磁珠将外源基因导入花粉，然后经过人工授粉和自然结实过程，将外源基因转入多种玉米自交系中。
这种方法解决了玉米遗传转化过程中“依赖组培体系，严重受基因型限制”的瓶颈问题。
具体来说，纳米磁珠转化方法是将纳米磁珠与外源基因结合，利用磁力将它们导入花粉中。
这种方法不需要通过植物组织培养过程，直接通过花粉萌发孔将外源基因导入玉米花粉，然后经过人工授粉和自然结实过程，将外源基因转入玉米自交系中。
纳米磁珠转化方法具有操作简便、省时省力、成本低等优点，同时打破了基因型限制，为其他植物开发花粉转化体系提供了有力借鉴。
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910121665.0
(22)申请日 2019.02.19
(71)申请人 南京农业大学
地址 210043 江苏省南京市栖霞区八卦洲
街道江苏省栖霞现代农业产业园区南
京农业大学现代园艺产业科技创新中
心
申请人 南京市蔬菜科学研究所
(72)发明人 张昌伟 许可翠 侯喜林 孙菲菲
肖栋 刘同坤 李英 胡春梅
(74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任
公司 32218
代理人 徐冬涛 竞存
(51)Int.Cl.
C12N 15/87(2006.01)
(54)发明名称
一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效
遗传转化方法及其应用
(57)摘要
为解决不结球白菜再生率低，受基因型影响
大，使得转化效率低的技术问题，本发明提供一
种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转
化方法，包括将含有外源基因的质粒与具有顺磁
性、表面覆盖一层PEI薄膜的Fe 3O 4的磁性纳米载
体以质量比1：1连接，得到基因—磁性纳米载体
复合物；在花粉培养基中混合基因—磁性纳米载
体与待转化植物花粉，在0.1～0.5T的磁场介导
下进行磁转化，直接递送基因—磁性纳米载体复
合物进入花粉细胞；然后通过植物授粉和受精过
程实现待转化植物的外源基因遗传转化。
本发明
花粉培养基配方、磁性纳米粒子和质粒DNA的质
量比、磁转化时间三者的组合，能够保证不结球
白菜的花粉活力并有效提高磁转化效率，建立简
单高效的遗传转化体系。
权利要求书2页 说明书7页序列表1页 附图3页CN 109652455 A 2019.04.19
C N 109652455
A
权 利 要 求 书1/2页CN 109652455 A
1.一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括将含有外源基因的质粒与具有顺磁性、表面覆盖一层PEI薄膜的Fe3O4的磁性纳米载体连接，得到基因—磁性纳米载体复合物；在花粉液体培养基中混合基因—磁性纳米载体复合物与待转化植物花粉，在0.1～0.5T的磁场介导下进行磁转化，直接递送基因—磁性纳米载体复合物进入花粉孔；然后通过植物授粉和受精过程实现待转化植物的外源基因遗传转化。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，具体操作步骤包括：
1)提取含有外源目的基因的质粒，将浓度浓缩为100～1000ng/ul；
2)待转化植物人工授粉前一天去雄，细管套住柱头生殖隔离，防止其他花粉污染；
3)将步骤1)提取的质粒与磁性纳米载体按质量比1：l混合，室温连接30min，得到基因—磁性纳米载体复合物；
4)转化当天收集花粉，将培养皿放置于开放但未散粉的花朵下，轻拍花朵使其花粉散落在培养皿孔中，每个孔取0.1～0.2克花粉，立即加入300～500ul的花粉液体培养基，使花粉悬浮在花粉液体培养基中；
5)将步骤3)中连接好的基因—磁性纳米载体复合物加入带有花粉的培养基中，使基因—磁性纳米载体复合物与花粉数量比值为10ul:1g，置于0.1～0.5T的磁场下转化30min，使基因—磁性纳米载体复合物进入花粉孔；
6)使用移液枪吸走培养皿上层的液体，将下层花粉放置到滤纸上吸干水分，然后将花粉在30～35℃，10～15min内晾干；
7)田间授粉，将步骤2)中去雄并进行生殖隔离的细管去掉，将步骤6)中得到的花粉用毛笔蘸取涂抹与柱头上，再用细管重新套住柱头，并做好标记；
8)将步骤7)授粉后的植株培养至自然成熟后收获种子，播种后待长出第二片真叶后，取第二片真叶的叶片组织在荧光显微镜下，根据外源目的基因荧光特性选择适合的紫外线激发波长激发后，能够观察到相应荧光的即为候选阳性植株；在候选阳性植株长出第四片真叶和第八片真叶时，分别在荧光显微镜下，根据外源目的基因荧光特性选择适合的紫外线激发波长激发后，对叶片组织进行两次筛选，均能够观察到相应荧光的即为转化了基因—磁性纳米载体复合物的T0代阳性植株；
9)摘取T0代阳性植株叶片，提取基因组DNA，利用目的基因引物进行PCR检测，经测序筛选出包括目的基因的T0代阳性植株。
3.根据权利要求1或2所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述磁性纳米载体粒径为100nm。
4.根据权利要求1或2所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述质粒与磁性纳米载体按质量比1:1混合，进行连接。
5.根据权利要求1或2所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述磁转化时间为30min。
6.根据权利要求1或2所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述花粉液体培养基配方如下：每100mL花粉液体培养基包括15g蔗糖、10mgH3BO3、5.3mgKNO3，10.3mgCa(NO3)2，51.7mgMnSO4，10.3mg MgSO4·7H2O和3mgGA3，用蒸馏水定容。
2。