【CN109652455A】一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法及其应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910121665.0

(22)申请日 2019.02.19

(71)申请人 南京农业大学

地址 210043 江苏省南京市栖霞区八卦洲

街道江苏省栖霞现代农业产业园区南

京农业大学现代园艺产业科技创新中

心

申请人 南京市蔬菜科学研究所

(72)发明人 张昌伟　许可翠　侯喜林　孙菲菲　

肖栋　刘同坤　李英　胡春梅　

(74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任

公司 32218

代理人 徐冬涛　竞存

(51)Int.Cl.

C12N 15/87(2006.01)

(54)发明名称

一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效

遗传转化方法及其应用

(57)摘要

为解决不结球白菜再生率低，受基因型影响

大，使得转化效率低的技术问题，本发明提供一

种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转

化方法，包括将含有外源基因的质粒与具有顺磁

性、表面覆盖一层PEI薄膜的Fe 3O 4的磁性纳米载

体以质量比1：1连接，得到基因—磁性纳米载体

复合物；在花粉培养基中混合基因—磁性纳米载

体与待转化植物花粉，在0.1～0.5T的磁场介导

下进行磁转化，直接递送基因—磁性纳米载体复

合物进入花粉细胞；然后通过植物授粉和受精过

程实现待转化植物的外源基因遗传转化。本发明

花粉培养基配方、磁性纳米粒子和质粒DNA的质

量比、磁转化时间三者的组合，能够保证不结球

白菜的花粉活力并有效提高磁转化效率，建立简

单高效的遗传转化体系。权利要求书2页 说明书7页序列表1页 附图3页CN 109652455 A 2019.04.19

C N 109652455

A

权　利　要　求　书1/2页CN 109652455 A

1.一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述方法包括将含有外源基因的质粒与具有顺磁性、表面覆盖一层PEI薄膜的Fe3O4的磁性纳米载体连接，得到基因—磁性纳米载体复合物；在花粉液体培养基中混合基因—磁性纳米载体复合物与待转化植物花粉，在0.1～0.5T的磁场介导下进行磁转化，直接递送基因—磁性纳米载体复合物进入花粉孔；然后通过植物授粉和受精过程实现待转化植物的外源基因遗传转化。

2.根据权利要求1所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，具体操作步骤包括：

1)提取含有外源目的基因的质粒，将浓度浓缩为100～1000ng/ul；

2)待转化植物人工授粉前一天去雄，细管套住柱头生殖隔离，防止其他花粉污染；

3)将步骤1)提取的质粒与磁性纳米载体按质量比1：l混合，室温连接30min，得到基因—磁性纳米载体复合物；

4)转化当天收集花粉，将培养皿放置于开放但未散粉的花朵下，轻拍花朵使其花粉散落在培养皿孔中，每个孔取0.1～0.2克花粉，立即加入300～500ul的花粉液体培养基，使花粉悬浮在花粉液体培养基中；

5)将步骤3)中连接好的基因—磁性纳米载体复合物加入带有花粉的培养基中，使基因—磁性纳米载体复合物与花粉数量比值为10ul:1g，置于0.1～0.5T的磁场下转化30min，使基因—磁性纳米载体复合物进入花粉孔；

6)使用移液枪吸走培养皿上层的液体，将下层花粉放置到滤纸上吸干水分，然后将花粉在30～35℃，10～15min内晾干；

7)田间授粉，将步骤2)中去雄并进行生殖隔离的细管去掉，将步骤6)中得到的花粉用毛笔蘸取涂抹与柱头上，再用细管重新套住柱头，并做好标记；

8)将步骤7)授粉后的植株培养至自然成熟后收获种子，播种后待长出第二片真叶后，取第二片真叶的叶片组织在荧光显微镜下，根据外源目的基因荧光特性选择适合的紫外线激发波长激发后，能够观察到相应荧光的即为候选阳性植株；在候选阳性植株长出第四片真叶和第八片真叶时，分别在荧光显微镜下，根据外源目的基因荧光特性选择适合的紫外线激发波长激发后，对叶片组织进行两次筛选，均能够观察到相应荧光的即为转化了基因—磁性纳米载体复合物的T0代阳性植株；

9)摘取T0代阳性植株叶片，提取基因组DNA，利用目的基因引物进行PCR检测，经测序筛选出包括目的基因的T0代阳性植株。

3.根据权利要求1或2所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述磁性纳米载体粒径为100nm。

4.根据权利要求1或2所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述质粒与磁性纳米载体按质量比1:1混合，进行连接。

5.根据权利要求1或2所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述磁转化时间为30min。

6.根据权利要求1或2所述的磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法，其特征在于，所述花粉液体培养基配方如下：每100mL花粉液体培养基包括15g蔗糖、10mgH3BO3、5.3mgKNO3，10.3mgCa(NO3)2，51.7mgMnSO4，10.3mg MgSO4·7H2O和3mgGA3，用蒸馏水定容。

2