谷胱甘肽的制备

谷胱甘肽的制备

背景

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由L一谷氨酸、L一半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的一种同时具有1一谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物⋯，在生物体内具有多种重要的、独特的生理功能，因此又被称为长寿因子和抗衰老因子。作为一种重要的生理活性物质，GSH在解毒、抗辐射、肿瘤、癌症、氧化衰老和协调内分泌的治疗中效果明显且无副作用，这些同类药物所不具有的优点使得GSH在临床和医药领域有着极为广泛的用途【21。在食品加T中，GSH具有抗氧化、防止褐变、强化风味和营养等功能，已被作为生物活性添加剂应用于保健食品的生产中。但GSH在体内循环周期短、易氧化、不能穿过细胞膜，从而限制了其保健和治疗作用的发挥。据报道，脂质体包埋技术能够有效地提高GSH的保护和治疗作用。

试验步骤

1试验材料

谷胱甘肽(纯度≥98．0％) Amresco公司；乙醇、乙醚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸(均为分析纯)、吐温一80(化学纯)、卵磷脂、胆固醇国药集团化学试剂有限公司；0．05m01·L。磷酸盐缓冲液(PBS) 自制。

2 实验方法

1．2．1脂质体的分离方法

1．2．1．1凝胶柱过滤法选用Sephadex G一25凝胶柱，取lmL脂质体混悬液进行上样分离，采用一定的洗脱剂洗脱，洗脱速度控制在0．5—1．0mL-min～，进行分部收集，测定游离的谷胱甘肽总量，计算包封率。

1．2．1．2洗脱剂的选择取1mg·mL“的谷胱甘肽溶液1mL上柱分离，分别选用去离子水、NaCI、乙醇、PBS、乙酸和PBS(NaCl)为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度控制在0．5～1．0mL·min～，进行分部收集，。测定洗脱液中的谷胱甘肽总量，计算回收率。1．2．2脂质体包封率的测定方法

1．2．2．1 游离GSH的测定方法采用优化的Ellman‟s测定法”1。

1．2．2．2包封率的计算方法将脂质体与游离谷胱甘肽分离，测定游离的谷胱甘肽量，根据下式计算脂质体包埋率：EE(％)=(1一Cf／Ct)×100％。其中：EE—GSH脂质体包封率；Cf一游离GSH含鼍；Ct一总GSH含量。

1．2．3 pH梯度法制备谷胱甘肽脂质体称取一定量的卵磷脂、胆固醇和叶温一80，溶于乙醚，得到类脂溶液；将类脂溶液置于圆底烧瓶中，在40'(2水浴中旋转蒸发除去乙醚，待类脂物在烧瓶壁上成膜后，加入一定pH的0．3tool·L。1柠檬酸10mL，继续旋转蒸发水合30min，得空白脂质体溶液；将谷胱甘肽加入空白脂质体溶液中，用0．5mol·L。1的磷酸氢二钠溶液调节pH，使pH增加3，将上述混合液在冰浴中短时超声(间歇超声，1s／1s)，静置2h，即得脂质体p。

1．2．4脂质体平均粒径和粒度分布吸取少量脂质体悬液，稀释至卵磷脂的含量在0．025％(W／W)，装入预处理过的透明小瓶中。用丙酮擦拭瓶外部并吹干。放人激光散射仪中进行检测旧‟。激光散射测试条4r牛-：温度：25±0．1℃；角度：90。(即垂直照射)；波长：632．8nm；扫描时间：300s／样

2结果与讨论

2．1 脂质体分离方法的确定

2．1．1 分离方法的选择测定包封率的前提是将未包封的游离GSH与脂质体分开，凝胶

过滤法具有经典、准确、方便、重现性好、耗时短，能将GSH和脂质体充分分开的优点，本实验采用凝胶过滤法来分离脂质体和游离GSH[7】。

2．1．2洗脱剂的选择水溶性物质的洗脱一般采用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液。为了使Sephadex G一25凝胶柱能够有效地分离脂质体和游离的谷胱甘肽，从而准确地测定游离的谷胱甘肽总量，选择了不同的洗脱剂x,-t上样谷胱甘肽进行洗脱，NaCI)为洗脱剂，谷胱甘肽经分离后可以得到较高的回收率，故本实验选用0．05mol·L…1 (0．5mol·L。1NaCI)作为凝胶柱分离的洗脱剂。