骨肉瘤化疗药物敏感性实验研究

文章编号：１００７－４２８７（２０１３）０１－０１００－０３骨肉瘤化疗药物敏感性实验研究张利恒，李　亮＊，李晓峰，赵栓柱，桑　平，门宏亮（吉林省人民医院骨科，吉林长春１３００２１）摘要：目的　寻找耐药与敏感骨肉瘤组织样本，为进一步寻找差异蛋白做准备。

方法　取３０例患骨肉瘤患者的标本，分离培养骨肉瘤组织细胞，采用试剂盒法体外进行细胞的６种药物敏感性试验。

结果　①顺铂组中度以上敏感２０例（６６．７％），耐药８例（２６．７％）；②阿霉素组中度以上敏感１９例（６３．３％），耐药７例（２３．３％）；③紫彬醇组中度以上敏感１６例（５３．３％），耐药８例（２６．７％）；④博来霉素中度以上敏感１５例（５０％），耐药６例（２０％）；⑤长春新碱中度以上敏感１０例（２６．７％），耐药１４例（４６．７％）；⑥甲氨喋呤中度以上敏感５例（１６．７％），耐药２０例（６６．７％）。

结论　骨肉瘤对各种化疗药物的敏感性存在差异，顺铂是进行进一步寻找差异蛋白研究的合适药物。

关键词：骨肉瘤；化疗药物；多耐药性中图分类号：Ｒ９７９．１文献标识码：ＡＡ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＺＨＡＮＧ　Ｌｉ－ｈｅｎｇ，ＬＩ　Ｌｉａｎｇ，ＬＩ　Ｘｉａｏ－ｆｅｎｇ，ｅｔ　ａｌ．（Ｊｉｌｉｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ｔｈｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ　Ｔｒａｕｍａ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ｔｏ　ｆｉｎｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ　ｓａｍｐｌｅｓ，ｓｏ　ｔｈａｔ　ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ｆｏｒ　ｆｕｒ－ｔｈｅｒ　ｌｏｏｋｉｎｇ　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｏｂｔａｉｎ　ｔｈｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ，ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｉ－ｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｒｕｇ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｃｅｌｌｓ，ｓｏ　ａｓ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ　ｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　ｄｒｕｇｓ　ａｎｄ　Ｆｏｕｎｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉ－ｔｉｖｅ　ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ　ｔｉｓｓｕｅ　ｓａｍｐｌｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ　ｈａｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｄｒｕｇｓ，Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｉｓ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ　ｄｒｕｇｓ　ｔｏ　ｌｏｏｋ　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　ｄｒｕｇｓ；Ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇｎ，２０１３，１７：０１００） 目前国内、外对化疗药物多耐药性进行了大量研究，但其获得是一个多因素，多步骤的动态过程，是细胞内蛋白质的修饰加工、转运定位、结构变化、蛋白质与蛋白质相互作用、蛋白质与其它生物分子相互作用的结果，所以单一分析基因ＤＮＡ无法澄清其耐药机制。

至今尚缺乏有效用于早期确定骨恶性肿瘤耐药的特异性分子标志物，当然难以制定准确高效的化疗方案。

本实验为多耐药研究的第一步，具体如下。

１　材料和方法１．１　材料与试剂　骨肉瘤组织分别来源于吉林省人民医院骨外科，吉林大学第一医院骨外科，吉林大学中日联谊医院骨外科，取自３０例骨肉瘤患者，男１９例，女１１例，平均年龄１８．５岁。

化疗药物顺铂，阿霉素，紫杉醇，博来霉素，长春新碱，甲氨蝶呤由吉林省人民医院肿瘤血液科提供，化疗药物ＡＴＰ药物敏感性检测试剂盒购自北京金紫荆公司。

１．２　方法１．２．１　骨肉瘤组织细胞的分离　用无菌眼科剪将骨肉瘤肿瘤组织剪碎，大致１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍ的碎块，呈糊状，剪的过程中不再有明显颗粒状的感觉。

（将冻干粉状消化酶，用１０ｍｌ　ＣＡＭ培养液充分混合溶解，过滤除菌，置于５０ｍｌ无菌离心管中待用），１０ｍｌ消化液可用于消化１－２个实体肿瘤样本，加入消化酶５－１０ｍｌ，把剪碎的样本转移到无菌５０ｍｌ离心管中，轻摇混匀。

将离心管倾斜置于ＣＯ２培养箱中，３７℃孵育３小时（根据不同组织，孵育不同时间）。

每隔２０ｍｉｎ左右，颠倒混匀组织消化液５－１０次。

轻摇同时肉眼观察消化情况，直至出现明显的细胞悬液。

若需要时，实体瘤样本可以处理过夜。

消化结束后，用１０ｍｌ吸管反复轻轻吹打消化混合液，使组织块完全分散。

滴一滴于玻璃片上，加上台盼兰染色后，镜下观—００１—Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇｎ，Ｊａｎｕａｒｙ，２０１３，Ｖｏｌ　１７，Ｎｏ．１取出存储在冰箱中的化疗药物溶液（为２００Ｘ浓缩液），根据方案进行组合，并在细胞培养板上相对应位置进行备注。

取５００μｌ　ＣＡＭ培养基加入到各个组合的２０μｌ药物储存液中，终浓度８倍，混匀后备用。

根据得到的细胞的总量，设定５－６个检测浓度，即２００％，１００％，５０％，２５％，１２．５％以及６．２５％ＰＰＣ浓度的实验孔，每种药物浓度做２个平行孔。

同时设定Ｍ０无药对照孔。

用多道加样器向Ａ－Ｇ行每个孔中加入１００μｌ　ＣＡＭ培养液。

用可调加样器，分别向各２００％浓度孔加入１００μｌ相应的８００％ＰＰＣ的待测药物。

混合后从２００％浓度孔中吸出１００μｌ加入１００％孔，依次类推。

最后，从６．２５％孔中吸出１００μｌ弃去。

Ｍ０孔只加入１００μｌ　ＣＡＭ培养液。

台盼蓝染色确定细胞总数后，调整细胞数至２０－４０万／ｍｌ，加样时每孔２－３个细胞／１００μｌ。

计数之前，务必要混匀溶液，以免出现误差。

用多道加样器向Ｇ－Ａ行每孔加肿瘤细胞悬液１００μｌ。

盖上培养板盖，用胶布将９６孔板盖固定后放入湿盒内，置于３７℃，５％二氧化碳培养５－７天。

培养５－７天后，应用生物荧光发光检测仪进行ＡＴＰ荧光检测，并通过药物敏感检测软件进行药物敏感性分析。

１．２．３　统计学分析　数据以百分率表示，用ＳＰＳＳ１３．０统计软件进行数据的统计分析，Ｐ＜０．０５为差异有显著性。

２　结果２．１　培养骨肉瘤细胞分离骨肉细胞为圆形，经贴壁后变成梭形，细胞数目随着培养天数的增多，逐渐增加，见图１。

Ａ：初次分离骨肉瘤细胞，Ｂ：培养７天骨肉瘤细胞Ｃ：培养１４天骨肉瘤细胞图１　分离获得骨肉瘤细胞生长图２．２　骨肉瘤细胞对化疗药物检测曲线　通过对化疗药物对骨肉瘤细胞敏感性检测曲线分析显示，每个患者来源的骨肉瘤对于化疗药物敏感性不一致。

见图２，表１。

Ａ为６中药物全部耐药的曲线图，Ｂ为部分药物敏感的曲线图（４种敏感）图２　同患者６种药物对化疗药物敏感性分析曲线图—１０１—中国实验诊断学　２０１３年１月　第１７卷　第１期感１５例（５０％），耐药６例（２０％）；长春新碱中度以上敏感１０例（２６．７％），耐药１４例（４６．７％）；甲氨喋呤中度以上敏感５例（１６．７％），耐药２０例（６６．７％）。

顺铂和阿霉素组中度以上敏感率高于其它组，与其他各组存在统计学差异。

顺铂和紫杉醇组敏感与耐药比例大于其它组，与其他各组存在统计学差异。

表１　针对各种化疗药物敏感性检测患者数顺铂阿霉素紫杉醇博来霉素长春新碱甲氨蝶呤敏感５　３　６　３　２　０中度敏感１５　１６　１０　１２　８　５轻度敏感２　４　６　９　１４　５耐药８　７　８　６　６　２０３　讨论骨肉瘤［１］是最常见的青少年恶性肿瘤，恶性度高，常早期发生肺转移，故选用骨恶性肿瘤中骨肉瘤为研究对象。

伴随着一系列药物进入临床，大剂量综合化疗使骨肉瘤患者５年生存率有了较大提高；合理，积极地进行化疗，约８０％的骨肉瘤患者的肢体能够得到保留，治愈率已由单纯手术的不足２０％达到现在的５０％－８０％［２］。

然而无论采取何种积极的治疗，总有约４０％的患者在诊治过程中发生肺转移，最终导致治疗的失败。

在目前免疫治疗及各种生物治疗未能取得重大突破之前，基于化学治疗能够使大部分病例得到治愈的事实，决定了如何增强化疗的效果，进而提高骨肉瘤治愈率成了当务之急。

积极发展新药和加大药物强度是提高化疗效果的一个方面，更主要的是怎样提高骨肉瘤细胞对化疗的敏感性，降低部分病例产生的耐药。

最终化疗失败的主要原因可能与肿瘤细胞发生多药耐药性（Ｍｕｌ－ｔｉｄｒｕｇ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＭＤＲ）有关。

目前有３０％左右骨肉瘤病人因发生多药耐药而导致化疗失败。

化疗病人中，无论是初次化疗还是再次化疗，一旦对某一种化疗药物表现出耐药后，常还会表现出对其他的与此种药物的结构和功能全不相同的化疗药的耐受，从而导致化疗失败，这一现象称为多药耐药。

目前骨恶性肿瘤病人化疗过程中，常因无法早期正确判断患者对化疗药物的敏感性，而造成化疗药物错误使用，延误病情。

所以，建立药物敏感性的早期正确诊断系统，是急待解决的课题。

顺铂可通过诱导骨肉瘤细胞自噬性活化达到其化疗效果［３］，是目前骨肉瘤新辅助化疗Ｒｏｓｅｎ　Ｔ系列方案中的３种主要药物之一［４］。

本实验中，甲氨喋呤敏感例数为０，耐药例数最多，考虑该药物只是抑癌药物的原因［５］，与现在研究资料相符。

顺铂和阿霉纱组中度以上敏感率最高，与其它组存在统计学差异；顺铂与紫杉醇组敏感组与耐药组间差异最小，与其它组存在统计学差异。

故进一步进行实验研究，取顺铂为宜。

作者简介：张利怛，主任医师。

参考文献：［１］Ｒｏｓｅｎ　Ｇ，Ｔａｎ　Ｃ，Ｓａｎｍａｎｅｅｃｈａｉ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｒａｔ　ｉｏｎａｌｅ　ｆｏｒ　ｍｕｌｔｉ－ｐｌｅ　ｄｒｕｇ　ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　ｓａｒｃｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ，１９７５，３５（ｓｕｐｐｌｅ）：９３６－９４５．［２］Ｂａｃｃｉ　Ｇ，Ｌｏｎｇｈｉ　Ａ，Ｆａｇｉｏｌｉ　Ｆ，ｅｔ　ａｌ．Ａｄｊｕｖａｎｔ　ａｎｄ　ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏｒ　ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍ　ａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒｅｍｉｔ　ｉｅｓ：２７ｙｅａｒ　ｅｘｐｅ－ｒｉｅｎｃｅ　ａｔ　Ｒｉｚｚｏｌｉ　Ｉｎｓ　ｔｉｔｕｔｅ，Ｉｔａｌｙ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２００５，４１（１８）：２８３６．［３］张志才，邵增务，熊蠡茗，等．顺铂诱导骨肉瘤细胞自噬及其与凋亡关系的体外研究［Ｊ］．华中科技大学学报（医学版），２０１１，４（４０）：１７８．［４］徐万鹏，冯传汉．骨科肿瘤学［Ｍ］．北京：人民军医出版社，２００１：１９３．［５］万法青．甲氨蝶呤对骨肉瘤细胞株的作用观察［Ｊ］．中国实验诊断学，２０１２，１６（３）：４０６．（收稿日期：２０１２－０２－１２）—２０１—Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｌａｂ　Ｄｉａｇｎ，Ｊａｎｕａｒｙ，２０１３，Ｖｏｌ　１７，Ｎｏ．１。